一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法

2023-09-16 15:01:25

專利名稱：一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法，用於對動物性食品中己烯雌酚含量的檢測。屬於酶聯免疫分析技術領域。
背景技術：
己烯雄酚(Diethylstilbestrol)是一種人工合成激素類藥物，臨床可應用於更年期綜合症的治療。近年來「食補」保健品替代藥物漸成趨勢，愈來愈為更多的人所接受，在家禽、家畜的餵料中添加某些藥物以期在其卵和肉中含有這些微量藥物，從而實現以食代藥。
對己烯雌酚和其它一些甾類激素在牛肉及動物血液中含量的測定和儀器分析方法已有文獻報導，而雞蛋中己烯雌酚的測定鮮有報導。研製己烯雌酚的酶聯免疫檢測試劑盒，對己烯雌酚殘留進行檢測具有重要的經濟和社會意義。

發明內容
本發明目的在於提供一種靈敏度高、結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶方便的己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒。
本發明的另一目的是提供一種樣品前處理簡單，而且簡便、快速、靈敏、準確、廉價的利用本試劑盒檢測己烯雌酚殘留的檢測方法。
本發明試劑盒主要由盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶(標準液，為己烯雌酚水溶液，包括A1，A2，A3，A4，A5，A6共六瓶)(3)，B試劑瓶(己烯雌酚過氧化物酶標記物濃縮液)(4)，C試劑瓶(己烯雌酚抗體濃縮液)(5)，D試劑瓶(底物發色劑，10ml四甲基聯苯胺)(6)，E試劑瓶(反應停止液，14ml 1M硫酸)(7)，F試劑瓶(緩衝液，25ml，酶標記及抗體濃縮液稀釋用)(8)，海綿託架(9)所組成，海綿託架(9)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F試劑瓶安放在海綿託架的孔和凹槽內，海綿託架(9)和酶標板(2)安放在盒體(1)內。
酶標板(2)有96個標準檢測微孔，12條×8孔，每個檢測孔均包被有兔IgG抗體。
A試劑瓶(3)，包括A1、A2、A3、A4、A5、A6共6瓶己烯雌酚水溶液標準液，300ul/瓶，分別為0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、2700ppt、8100ppt。
用本試劑盒檢測己烯雌酚的方法是應用抗原抗體反應。酶標板微孔包被有針對兔IgG(Diethylstilbestrol抗體)的羊抗體。Diethylstilbestrol抗體被加入，經過孵育及洗滌步驟後，加入Diethylstilbestrol酶標記物，標準或樣品溶液。Diethylstilbestrol與Diethylstilbestrol酶標記物競爭Diethylstilbestrol抗體，沒有連接的Diethylstilbestrol酶標記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(過氧化氫尿素)和發色劑(四甲基聯苯胺)加入到孔中並且孵育。結合的酶標記物將無色的發色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液後使顏色由藍轉變為黃色。在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的Diethylstilbestrol濃度成反比。
樣品前處理1尿樣不用處理，取20ul清亮尿樣直接測定(如果尿樣渾濁一定要過濾或離心直至得到清亮尿樣)2.1帶有低脂肪的肝，肉，或組織……5g粉碎的樣品與25ml 50mM HCL混合，振蕩15小時，以達到均質的目的。
……稱6g均質物(相當於1g肝臟)，加入離心瓶中，……離心15分鐘/4000g或更高的轉速，在10-15℃，……轉移上清液到另一個離心瓶中，加300ul 1MNaOH混合15分鐘，……加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩衝液pH3.0，簡單的混合併在4℃保存至少1.5小時或過夜。
……離心15分鐘/4000g或更高的轉速，在10-15℃，分離全部上清液，使其升至室溫(20-24℃)，然後用柱純化2.2肉和組織……5g粉碎的樣品與25ml 50mM Tris緩衝液pH8.5混合，振蕩0.5小時，以達到均質的目的。
……加入15ml庚烷((n-heptane)振蕩5分鐘以溶去脂肪，……離心5分鐘/4000g或更高的轉速/10-15℃……用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層……再用15ml庚烷((n-heptane)重複步驟2-4……向均質的肉液中加入0.5ml半濃的鹽酸，振蕩1小時……稱6g均質物(相當於1g肝臟)，加入離心瓶中，……以下從2.1的第一個離心步驟開始。像處理肝臟一樣繼續進行處理，
柱純化以下列方式所有試劑和樣品處理必須在室溫條件下(20-24℃)並嚴格控制過柱時的流速。
……用3ml甲醇(100％)洗滌柱子，流速為1滴/每秒……用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩衝液pH3.0)……樣品進柱(肝，肉，或組織的全部上清液)……用2ml洗滌液洗滌柱子(50mM磷酸二氫鉀緩衝液pH3.0)……用正壓去除殘留的流體並且用空氣或氮氣吹2分鐘乾燥柱子……用1ml甲醇(100％)洗脫樣品。流速為15滴/分鐘……在50-60℃並且在弱空氣或氮氣流下完全蒸發溶劑……用1ml蒸餾水溶解乾燥的殘留物，取20ul進行分析樣品的保存……未處理的樣品冷凍保存……HCL均質後的樣品在2-8℃穩定3天……以磷酸二氫鉀緩衝液提取後的樣品(RIDAC18柱純化之前)在2-8℃穩定2天，使用前離心……柱純化步步驟6所獲得的甲醇洗脫物可以冷凍保存數周，在2-8℃穩定2周……用蒸餾水溶解的乾燥殘留物(步驟8)在2-8℃穩定1周3牛眼……冷凍樣品(-20℃)……解凍樣品(破壞細胞)並且小心的切割眼球，在兩邊切破視網膜……收留解凍液滴(約0.5ml)……用蒸餾水1∶1稀釋(一份蒸餾水加—份解凍液)，取20ul測定保存解凍液應該立即冷凍保存，4周內可以繼續使用酶標免疫檢測1測定之前注意事項1)使用之前將所有試劑回升至室溫20-24℃。
2)使用之後立即將所有試劑放回2-8℃。
3)在使用中不要讓微孔乾燥4)在EIA分析中的再現性，很大程度上取決於洗板的一致性，仔細按照推薦的冼板順序操作是EIA測定程序中的要點。
5)在所有恆溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。
2 Diethylstilbestrol酶標記物提供的Diethylstilbestrol酶標記物(B試劑瓶)為濃縮液，由於稀釋的酶標記物穩定性不好，所以只稀釋實際需用量的酶標記物。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，用緩衝液以1∶10的比例稀釋酶標記物濃縮液。
3 Diethylstilbestrol抗體提供的Diethylstilbestrol抗體(C試劑瓶)為濃縮液，由於稀釋的Diethylstilbestrol抗體穩定性不好，所以只稀釋實際需用量的Diethylstilbestrol抗體。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖。用緩衝液以1∶10的比例稀釋抗體濃縮液(400ul濃縮液鬥4.0ml緩衝液，足夠4個微孔板條32孔用)4包被有抗體的微孔板條錫箔袋沿橫向邊壓皺外沿剪開。取出需用數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進原錫箔袋中並且與提供的乾燥劑一起重新密封，保存於2-8℃，不要冷凍。
5標準液提供的Diethylstilbestrol標準液濃度為標準液1(A1)…………0ppt(O)標準液2(A2)…………100ppt標準液3(A3)…………300ppt標準液4(A4)…………900ppt標準液5(A5)…………2700ppt標準液6(A6)…………8100ppt6測定程序(室溫20-24℃條件下操作)1)將足夠標準和樣品所用數量的孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個平行實驗，記錄下標準和樣品的位置。
2)加入100ul稀釋後的抗體溶液到每個微孔中底部。在室溫孵育15分鐘。
3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重複操作兩遍。
4)加入20ul的標準或處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。
5)加入100ul稀釋的酶標記物到微孔底部，室溫孵育30分鐘，
6)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重複操作兩次。
7)加入100ul底物發色試劑(D試劑瓶)到微孔中，在室溫暗處孵育15分鐘。
8)加入100ul反應停止液(E試劑瓶)到微孔中混合好，用酶標儀在450nm處測量吸光度值以空氣為空白，必須在加入停止液後60分鐘內讀取吸光度值。
結果所獲得的標準和樣品吸光度值的平均值除以第一個標準(0標準)的吸光度值再乘以100。因此0標準等於100％並且以百分比的形式給出吸光度值。
標準(或樣品)的吸光度值/0標準的吸光度值×100＝％吸光度值計算的標準值繪成為一個對應Diethylstilbestrol濃度(ng/kg)的半對數坐標系統曲線圖，校正曲線在200-2000ng/kg(ppt)範圍內應當成為線性。相對應每一個樣品的濃度(ng/kg)可以從校正曲線上讀出。
為了獲得樣品中的Diethylstilbestrol的實際濃度(ng/kg)，從標準曲線上讀出的濃度值必須乘以相對應的稀釋係數。當樣品處理過程是按指示進行的，稀釋係數如下；尿液(沒有樣品處理)………………1組織…………………………………1牛眼…………………………………2靈敏度試劑盒的平均檢測下限約為100ng/kg，根據樣品處理記錄，尿液中的Diethylstilbestrol檢測下限為100ng/kg(100ppt)，組織中的檢測下限為100ng/kg(100ppt)，牛眼中的檢測下限為200ng/kg(200ppt)。
特異性試劑盒的特異性通過對相應的物質進行交叉反應性分析而得到。
再現性由獲得的標準吸收值的變異係數(％CV)對相應Diethylstilbestrol濃度作曲線，可以看到在全部範圍內變異係數如此之低，可以得到很好的再現性。
回收率以尿液樣品為例，回收率為90％±12％。
本發明的優點是該試劑盒是競爭酶標免疫法試劑盒，用於定量測定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的己烯雌酚殘留。檢測前對於樣品的前處理簡單，利用本試劑盒檢測己烯雌酚殘留，是簡便、快速、靈敏、準確、廉價的檢測方法。最低檢測限為己烯雌酚0.1ppb。


圖1試劑盒的直觀示意2酶標板的直觀示意圖(重疊三層，僅畫出其中一層)
圖中盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶(3)，B試劑瓶(4)，C試劑瓶(5)，D試劑瓶(6)，E試劑瓶(7)，F試劑瓶(8)，海綿託架(9)。
具體實施例方式
實施例11、按前述方法進行樣品處理。
2、試劑配製Diethylstilbestrol抗體稀釋溶液，(Diethylstilbestrol抗體濃縮液∶稀釋液＝1∶10)，Diethylstilbestrol過氧化物酶標記物稀釋溶液，(酶標記物濃縮液∶稀釋液＝1∶10)。
3、加抗體，室溫孵育加入100ul稀釋後的抗體溶液到每個微孔中底部。在室溫孵育15分鐘。
4、洗滌倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重複操作兩遍。
5、加標準液或待測樣品加入20ul的標準或處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行實驗。
6、加酶標記物，孵育加入100ul稀釋的酶標記物到微孔底部，室溫孵育30分鐘。
7、洗滌倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打(每行拍打3次)以保證完全除去孔中的液體。用250ul蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重複操作兩次。
8、加發色劑反應加入100ul底物發色試劑到微孔中，在室溫暗處孵育15分鐘。
9、終止加入100ul反應停止液到微孔中混合好。
10、測定用酶標儀在450nm處測量吸光度值以空氣為空白，必須在加入停止液後60分鐘內讀取吸光度值。
權利要求
1.一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵是由盒體(1)，酶標板(2)，A試劑瓶，標準液，為己烯雌酚水溶液，包括A1，A2，A3，A4，A5，A6共六瓶(3)，B試劑瓶，己烯雌酚過氧化物酶標記物濃縮液(4)，C試劑瓶，己烯雌酚抗體濃縮液(5)，D試劑瓶，底物發色劑，四甲基聯苯胺(6)，E試劑瓶，反應停止液，1M硫酸(7)，F試劑瓶，緩衝液，酶標記及抗體濃縮液稀釋用(8)，海綿託架(9)所組成，海綿託架(9)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F試劑瓶安放在海綿託架的孔和凹槽內，海綿託架(9)和酶標板(2)安放在盒體(1)內。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵是所述的酶標板(2)上檢測微孔均包被有IgG抗體。
3.一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒檢測己烯雌酚的方法，先進行樣品處理，其特徵是應用抗原抗體反應，酶標板微孔包被有兔IgG抗體，Diethylstilbestrol抗體被加入，經過孵育及洗滌後，加入Diethylstilbestrol酶標記物，標準或樣品溶液，Diethylstilbestrol與Diethylstilbestrol酶標記物競爭Diethylstilbestrol抗體，沒有連接的Diethylstilbestrol酶標記物在洗滌步驟中被除去，發色劑(四甲基聯苯胺)加入到孔中並且孵育，結合的酶標記物將無色的發色劑轉化為藍色的產物，加入反應停止液後使顏色由藍轉變為黃色，在450nm處測量，吸收光強度與樣品中的Diethylstilbestrol濃度成反比。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵是Diethylstilbestrol酶標記物濃縮液的稀釋，只稀釋實際需用量的酶標記物，在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖，用緩衝液10份稀釋1份酶標記物濃縮液的比例進行稀釋。
5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵是Diethylstilbestrol抗體濃縮液的稀釋，只稀釋實際需用量的Diethylstilbestrol抗體。在吸取濃縮液之前，要仔細地振搖。用緩衝液10份稀釋1份抗體濃縮液的比例進行稀釋。
6.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵是加抗體室溫孵育為15分鐘，加酶標記物後，室溫孵育30分鐘，加底物發色劑後，室溫暗處孵育15分鐘。
7.根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵是測定吸光度A450nm，以空氣為空白，在加入停止液後60分鐘內讀取光度值。
全文摘要
一種己烯雌酚酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬於酶聯免疫分析技術領域。本發明配製的試劑盒，採用酶聯免疫吸附(ELISA)競爭法檢測己烯雌酚。酶標板上包被兔IgG抗體，Diethylstilbestrol抗體加入後經孵化、洗滌，加入樣品稀釋液及酶標抗原，使兩者反應，洗滌，加酶底物顯色，用酶標儀檢測A
文檔編號G01N33/74GK1456894SQ0313185
公開日2003年11月19日 申請日期2003年6月9日 優先權日2003年6月9日
發明者胥傳來, 李相前, 王武康, 邵蔚藍, 徐保國, 賀鐵明, 胡擁明 申請人:江南大學