一株基因改性的高效解磷工程菌及其應用的製作方法

2023-06-01 14:44:26 1

專利名稱：一株基因改性的高效解磷工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物和基因工程技術領域中的一株經基因工程技術改性(本文中改性含義與改造相同)的高效解磷細菌及其在製備生物肥料中的微生物肥料中的應用。
背景技術：
磷是限制植物生長的主要營養元素之一，其在土壤中主要以難溶的礦物態存在。溶磷微生物在土壤磷循環相關的生物學系統中擔任著重要的角色，它們可以將難溶性無機磷轉化為可溶性磷(如磷酸一氫鈣等)，提高作物對磷的利用率。但植物根圍的解磷微生物通常數量不足，難以發揮其效用。因此，有必要從自然環境中篩選出高效解磷菌株，製成菌劑後再施入土壤中以促進植物對磷的吸收利用。
由於芽孢桿菌具有抗逆性強，在土壤中容易定殖，適宜工業化生產等優點，目前通過註冊的商品化微生物菌肥中有很多都是芽孢桿菌(Bacillus)。微生物溶解無機磷的機理較為複雜，許多微生物的解磷過程與細胞內有機酸的合成密切相關，弱酸性環境可促進難溶磷酸鈣溶解。基因工程技術是把外源基因導入到宿主菌細胞，有目的的改造宿主菌的遺傳形狀的一種方法，通過此方法構建的工程菌株，可以在分子的水平上定向的改變菌株的遺傳特性。目前，國內外對解磷細菌的研究大量集中在解磷細菌的菌株篩選、對比、誘變、以及機理初探方面，對基因解磷機理的研究很少，解磷細菌的基因工程育種僅限於一些零星的、基礎性的研究報導。儘管分子育種是新型解磷菌選育的發展方向，但目前尚未見到利用基因工程技術對解磷微生物進行改造的報導。與本發明相關的現有技術如下現有技術一「一種解磷真菌及其在製備生物菌肥中的應用」(中國專利文獻，申請號201010590115. 2)。該發明米用常規方法從雲南省晉寧縣磷礦廠礦土中利用解磷微生物篩選培養基，篩選獲得解憐真菌Penicillium oxalicum Mo-Po菌株。其利用Mo-Po菌株堆肥發酵菸草廢棄物製備的生物菌肥能作為各種蔬菜種植中的基肥，在土壤含磷量較高的農田裡能夠作為化學磷肥的替代品。其缺點是篩選解磷真菌時採集的樣品來源範圍小，使得篩選的解磷真菌的種類較少，且在傳代的過程中容易蛻化，在進一步的純化過程中容易失去解磷能力。此外，該發明所用的篩選方法為常規方法，未涉及利用基因工程技術對解磷菌進行遺傳改造。現有技術二 「一株具有解磷作用的枯草芽孢桿菌及其應用」(中國專利文獻，申請號201010532768. 5)。該發明從山東省濟寧市田間土壤中分離到一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis XF-8)，該菌株能產生中性植酸酶，對有機磷具有解磷作用。其缺點為所使用的枯草芽孢桿菌只對土壤有機磷具有解磷作用，對難溶性無機磷無效。此外，該發明未涉及利用基因工程技術對解磷菌株進行遺傳改造。現有技術方案三「芽孢桿菌解磷工程菌株的構建」(中國專利文獻，申請號02145369. I)。該發明應用誘變效率高、突變幅度大的新型誘變技術一離子束注入方法構建工程菌，使芽孢桿菌分解有機磷和無機磷的能力增強。其缺點為得到的工程菌利用的是物理誘變技術，此技術一方面產生的有益突變頻率低，另一方面難以有效的控制變異的方向和性質。此外，該發明也未涉及利用基因工程技術對解磷菌進行遺傳改造。

發明內容
本發明的目的是提供一株對土壤中的無機磷具有較好的溶解效果的高效解磷工程菌。本發明所提供的高效解磷芽孢桿菌，為解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。所述解澱粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在Yro培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面溼潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度範圍 250C _37°C，最適生長溫度30°C -37°C ;生長酸鹼度範圍pH 2-9，最適pH值為7.0。本發明進一步提供一種高效解磷微生物菌劑，其活性成分為前述的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089的發酵液或發酵液乾燥得到的固體菌劑。該高效解磷微生物菌劑，為所述發酵液與草炭、輕質碳酸鈣經混合、粉碎得到的，三者混合比例為1:3-5:0. 03-0. 05，優選1:4:0. 04 (重量比)。本發明還提供一種構建解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089的方法，包括以下步驟I)選定一株能解憐的芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57,其 16S rDNA序列如序列表中序列I所示；2)在序列表中序列2所示的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的5』端添加枯草桿菌蛋白酶E基因啟動子(PsubE)，在3』端添加枯草桿菌蛋白酶E基因轉錄終止子(TsubE)，得到序列表中序列3所示的葡萄糖脫氫酶基因的完整表達元件，然後將其克隆到芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質粒PHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位點之間，得到攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體PHYH ；3)將攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體pHYH通過電擊轉化方法導入芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57中,得到基因改造的高效解磷工程菌即解澱粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。本發明進一步提供一種得到解澱粉芽孢桿菌(BaciIIus amyloliquefaciens)PS57CGMCC No. 6089的發酵液的方法，包括以下步驟I)配製無機磷細菌液體培養基，配方為葡萄糖10g，硫酸銨0. 5g，酵母粉0. 5g，氯化鈉0. 3g,氯化鉀0. 3g,硫酸鎂0. 3g,硫酸亞鐵0. 03g,硫酸猛0. 03g,磷酸韓5g,蒸懼水IOOOmL, pH 7. 0-7. 5，將培養基在使用前用常規方法115°C滅菌30min ；2)將解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 按5%的比例接種於步驟I)的無機磷細菌液體培養基中，在搖瓶轉速180-200r/min下培養20-24h，得到PS57H1發酵液。本發明還提供一種製備所述高效解磷微生物菌劑的方法，將前PS57H1發酵液與高溫滅菌後的草炭、輕質碳酸鈣按照重量比1:4:0. 04的比例在攪拌機內攪拌均勻，粉碎後得到。本發明進一步提供一種活化磷肥，包括磷肥和按磷肥質量的1-50%添加的所述高效解磷微生物菌劑。解澱粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 在溶解土壤難溶磷中的應用也屬於本發明內容；所述土壤難溶磷為包括磷酸鈣、磷灰石和磷鐵礦中的磷酸三鈣等的無機磷。綜上，本發明技術方案圍繞該高效解磷工程菌解澱粉孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089展開。該菌株是先從植物根圍土壤中篩選獲得解磷菌PS57，然後構建葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的完整表達元件，再將該基因表達元件電轉入宿主菌一解磷菌PS57中得到的高效解磷菌株。實驗證明，該菌株在無機磷培養基(磷元素來源為難溶性磷酸鈣Ca3 (PO4)2，原始含量為5g/L，)中培養72h，可使培養基中的可溶 性磷(磷以可溶性磷的形式存在)含量高達58. 8mg/L，說明該菌株具有很強的解磷作用，可作為解磷細菌應用於微生物肥料生產。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖I為磷標準曲線圖2為攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體pHYH的物理圖譜
具體實施例方式本發明提供的基因改性(或稱改造)的高效解磷工程菌為一株解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),名稱為PS57H1,該菌株已於2012年05月11日保藏於位於中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6089。該解澱粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在Yro培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面溼潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度範圍25°C-37°C，最適生長溫度30°C-37°C;生長酸鹼度範圍pH 2-9，最適pH值為7. O ;部分生化特性如表I所示表I 解澱粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1CGMCC No. 6089的部分生化特性
權利要求
1.一株基因改性的高效解磷工程菌，為解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H ICGMCC No. 6089。
2.根據權利要求I所述的高效解磷工程菌，其特徵在於所述解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1CGMCC No. 6089是革蘭氏陽性桿菌,頂端生芽抱；在Yro培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面溼潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度範圍25°C _37°C，最適生長溫度30°C -37°C ；生長酸鹼度範圍pH 2-9，最適pH值為7.0。
3.一種高效解磷微生物菌劑，其活性成分為權利要求I或2所述的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 的發酵液或發酵液乾燥得到的固體菌劑。
4.根據權利要求5所述高效解磷微生物菌劑，其特徵在於，為所述發酵液與草炭、輕質碳酸鈣經混合、粉碎得到的，三者混合比例為1:3-5:0. 03-0. 05，優選1:4:0. 04 (重量比)。
5.—種構建權利要求I或2或3或4所述解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089 的方法，包括以下步驟 1)選定一株能解憐的芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) PS57,其 16S rDNA 序列如序列表中序列I所示； 2)在序列表中序列2所示的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的5』端添加枯草桿菌蛋白酶E基因啟動子(PsubE)，在3』端添加枯草桿菌蛋白酶E基因轉錄終止子(TsubE)，得到序列表中序列3所示的葡萄糖脫氫酶基因的完整表達元件，然後將其克隆到芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質粒PHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位點之間，得到攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體PHYH ； 3)將攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體pHYH通過電擊轉化方法導入芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacien3)PS57中，得到基因改造的高效解磷工程菌即解澱粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) PS57H1 CGMCC No. 6089。
6.一種得到權利要求3或4所述解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57CGMCC No. 6089的發酵液的方法，包括以下步驟 1)配製無機磷細菌液體培養基，配方為葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，酵母粉0. 5g，氯化鈉0. 3g，氯化鉀0. 3g，硫酸鎂0. 3g，硫酸亞鐵0. 03g,硫酸錳0. 03g,磷酸鈣5g，蒸餾水IOOOmL,pH 7. 0-7. 5，將培養基在使用前用常規方法115°C滅菌30min ； 2)將解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57Hl CGMCC No. 6089按5%的比例接種於步驟I)的無機磷細菌液體培養基中，在搖瓶轉速180-200r/min下培養20_24h，得到PS57H1發酵液。
7.一種製備權利要求4所述高效解磷微生物菌劑的方法，將權利要求6所述PS57H1發酵液與高溫滅菌後的草炭、輕質碳酸鈣按照1:4:0.04 (重量比)的比例在攪拌機內攪拌均勻，粉碎後得到。
8.一種活化磷肥，其特徵在於，包括磷肥和按磷肥質量的1-50%添加的權利要求3或4所述高效解磷微生物菌劑。
9.解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)PS57Hl CGMCC No. 6089 在溶解土壤難溶磷中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述土壤難溶磷為包括磷酸鈣、磷灰石和磷鐵礦中的磷酸三鈣等的無機磷。
全文摘要
本發明公開了一株基因改性的高效解磷工程菌及其應用。該菌株為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)PS57H1 CGMCC No.6089，從植物根圍土壤中篩選獲得解磷菌PS57，構建含有葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的完整表達元件，再將該基因表達元件電轉入宿主菌PS57中得到。實驗證明，該菌株在無機磷培養基(主要磷元素來源為難溶性磷酸鈣，含磷量為5g/L)中培養72h，可使培養基中的可溶性磷含量高達58.8mg/L，說明該菌株具有很強的解磷作用，可作為解磷細菌應用於微生物肥料生產。
文檔編號C12R1/07GK102876624SQ20121038282
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者孫立文, 許仁傑, 李慶財, 趙學民 申請人:山東禹城瑞利源科技有限公司, 北京中農瑞利源高科技發展有限公司