一種預防和治療老年痴呆症的藥物及其製劑和用途的製作方法
2023-06-06 21:21:21 1
專利名稱：一種預防和治療老年痴呆症的藥物及其製劑和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種預防和治療老年痴呆症的藥物及其製劑和用途，具體涉及傳統中藥材淫羊藿中提取的淫羊藿總黃酮及其製劑在製備預防和治療老年痴呆症的藥物、保健品中的應用。
背景技術：
老年痴呆是一種中樞神經系統原發性退行性變性疾病，起病緩慢，病程為慢性進行，平均5～10年，以全面進行性痴呆為特徵。其主要臨床相為痴呆症候群，主要表現為記憶、語言、判斷、認識、思維、行為、性格，和情感等高級神經活動障礙，伴失語、失用、失認、失寫和失讀等。老年痴呆症主要可分為阿爾茨海默型痴呆、腦血管性老年痴呆、混合型和其它型。其中以阿爾茨海默(AD)和血管性痴呆(VD)最為多見。阿爾茨海默老年痴呆症(AD)是一種慢性的大腦退行性變性疾病，其病因至今不明，具有特徵性神經病理和神經化學改變。由於腦血管障礙所引起的以痴呆為主要臨床症狀的疾病，就稱之為血管性痴呆(Vascluardementia，VD)。從神經病理學的角度來看，VD包括缺血和出血性腦血管病以及心臟停搏引起腦缺血缺氧性損害而導致的痴呆。我國對血管性痴呆的研究較多，認為多發梗塞性痴呆(MID)最為常見，是腦血管病所引起腦內多數散在梗塞或腔隙梗塞灶造成的。除了腦血管梗塞可以發生痴呆外，腦出血同樣可以引起痴呆，包括慢性硬膜下血腫、蛛網膜下腔出血後遺症和腦血腫，都會引起血管性痴呆的發生。混合型老年痴呆是指同時存在有老年痴呆和血管性痴呆的症狀，有時鑑別很困難。其他原因引起的痴呆歸為其它型痴呆。
據報導，老年人口中，痴呆的患病率佔總人口的4％～5％，80歲以上的老年人可佔17％～20％。其中腦變性疾病引起的痴呆——阿爾茨海默病佔50％以上，腦血管病引起的血管性痴呆佔20％，混合性痴呆佔20％，其他原因引起的痴呆佔10％。在美國，AD的患病人口為400萬，到下世紀中葉這個數字將上升到1100萬，每年花費為100億美元。我國27個城鄉的普查資料表明60歲以上老人中血管性痴呆的患者率為324/10萬人口，阿爾茨海默病為238/10萬人口；血管性痴呆的患病率城市高於農村，阿爾茨海默病正相反，農村多於城市。據估計，到2025年，世界範圍內AD的患病人口為2200萬。AD作為老年期痴呆的主要類型，是繼心臟病、癌症、中風之後的第四位致死原因。因此對AD的防治已引起醫學界乃至全社會的廣泛重視。
老年性痴呆症的治療藥物，西藥主要有膽鹼能前體負荷及促釋放劑、膽鹼酯酶抑制劑、膽鹼能受體激動劑類、抗氧化劑和神經保護劑、激素替代療法(ERT)、抗炎藥，另外對於老年痴呆的治療還可以應用神經營養因子、抗神經細胞凋亡劑及促神經細胞代謝藥，鈣通道阻滯劑、糾正鈣穩態失調藥物，抗澱粉樣肽形成藥，代謝增強劑，細胞膜調節劑，腦活素，穀氨酸鹽受體拮抗劑等藥物。目前主要的臨床用藥有毒扁豆鹼、重酒石酸卡拉巴汀、加蘭他敏、多奈哌齊、他克林、石杉鹼甲、司來吉蘭、尼莫地平等。這些藥物雖然對老年痴呆有一定的治療作用，但是這些藥物均有不同程度的毒副作用，例如毒扁豆鹼很多病人難以承受它的胃腸道副作用，如噁心、嘔吐、出血等；他克林作用持續時間較毒扁豆鹼長，本藥的主要不良反應是肝毒性和胃腸道症狀，尤其是引起轉氨酶(ALT和AST)水平升高，消化系統症狀包括噁心、嘔吐、腹瀉、消化不良、厭食和體重下降，其他不良反應包括尿頻、流涎、多汗、眩暈和皮疹等，由於本品毒副作用較大，目前國內臨床已停止使用；服用重酒石酸卡拉巴汀常見的不良反應有噁心、嘔吐、腹瀉、眩暈和頭痛等，加蘭他敏也有噁心、嘔吐及腹瀉等消化道不良反應；多奈哌齊和石杉鹼甲等，此類藥物對痴呆症早期以及改善認知功能障礙有效，但也有一定的不良反應及作用短暫等缺點。
隨著社會的發展，人口老齡化速度的加快，老年性痴呆症將越來越引起人們重視。目前歐洲、日本和美國70歲以上的人口中有20％的人患此病，全世界65歲以上的人口中有5000多萬人患有不同種類的痴呆病。據預測，到2005年發達國家中的老年性痴呆症病人數將增加50％。對此，目前尚無更有效的治療方法。但是，這一現象已經引起了世界各國醫藥行業的關注，並正在大力研究開發治療藥物，其開發新產品的數量超過了任何其他治療類藥物開發的數量。然而，儘管世界各國對治療老年痴呆症的藥物的研發投入了大量的資金，但是效果並不是很令人滿意。大部分品種有一定的治療作用，短期能夠改善患者的認知功能，但是長期療效以及毒副作用卻不容樂觀。於是，越來越多的人將目光投向傳統中草藥，希望從中尋找出可以有效預防和治療老年痴呆症的藥物。
古代中醫學中無「老年性痴呆」的病名，但類似痴呆症狀的描述可散見於呆證、文痴、武痴、善忘、語言顛倒、痴呆、癲證、狂證等病證中。《左傳》謂「不慧，蓋世所謂白痴」，「成十八年，周子有兄而無慧，不能辨菽麥，不知分家犬」。《內經》中有類似病證的闡述，如《靈樞·海論》「髓海不足，則腦轉耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥」；「腎主骨，生髓通於腦」。現代中醫學家對痴呆病因病機的認識不離虛實兩端，本虛標實兼挾多見。虛主要包括腎精虧虛和氣血衰少；實則包括痰溼蒙蔽、瘀血痺阻。病機責之腎肝心脾等臟腑功能失調，腎精失充，氣血不足，腦髓失養，痰瘀互結，蒙蔽清竅。痴呆之虛，雖廣泛累及腎、脾、心、肝諸髒，但腎虛為其根本，腎精虧虛，腦髓不足始終貫穿該病的全過程。鑑於上述祖國傳統醫學對痴呆症的治療理論的經典闡釋，我們對部分中草藥進行了詳盡的研究，通過大量的動物和細胞藥理篩選實驗對十數種預期對痴呆證有治療作用的中藥材及其提取物進行了藥效和毒理研究，最終發現中藥材淫羊藿總黃酮能明顯改善模型動物記憶障礙、提高學習能力，可以有效改善、調節中樞膽鹼能神經，調節自由基代謝等多種作用，對包括阿爾茨海默症、血管性痴呆等各種老年痴呆症均有確切的療效。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種從傳統單味中藥材淫羊藿中提取的淫羊藿總黃酮在製備預防和治療老年痴呆症的藥物、保健品中的應用。
本發明的另一目的在於提供由淫羊藿總黃酮和適宜的藥物輔料製備而成的用於預防和治療老年痴呆症的藥物製劑。
淫羊藿為小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)、箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim]、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes T.S.Ying)、朝鮮淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)等的莖、葉。淫羊藿味辛、甘，性溫。歸腎、肝經。具有補腎壯陽、強筋健骨、祛風除溼等功效。傳統用藥常用於治療陽痿遺精，虛冷不育，尿頻失禁，腎虛喘咳，腰膝酸軟，風溼痺痛，半身不遂，四肢不仁等。現代藥理研究表明淫羊藿具有促性機能作用、提高免疫功能、保護心肌缺血性損傷、增加冠脈流量、延緩衰老等多種藥理作用。我們對中藥材淫羊藿的化學成分、藥理作用、作用機制等方面進行了深入細緻的研究，發現淫羊藿總黃酮可以顯著改善痴呆模型動物的學習記憶能力障礙，還具有提高腦內氧自由基代謝，調節單胺類神經遞質代謝的作用，對阿爾茨海默症、血管性痴呆症、混合型痴呆等老年痴呆症都具有明顯的預防和治療作用。
本發明可以使用中藥材淫羊藿，對其進行提取加工，以淫羊藿總黃酮為主要的藥用組份，加入適宜的用於輔料，製備成適宜的製劑用於血管性痴呆、阿爾茨海默症等各種老年痴呆症的預防和治療。
本發明也可以購買現成的淫羊藿總黃酮，加入適宜的藥用輔料，製備成適宜的製劑用於老年痴呆症的預防和治療。
1、本發明中所述的從中藥材淫羊藿中提取的淫羊藿總黃酮是按照以下的製備工藝製備而成，其工藝步驟是(1)將中藥材淫羊藿清洗，乾燥，粉碎成粗粉，加入5～12倍量50～95％乙醇，回流提取2～3次，每次0.5～2小時，過濾，合併提取液；(2)濃縮提取液至無醇味，回收乙醇；(3)在濃縮液中加入1/3～1/5體積的有機溶劑萃取2～3次，分取有機溶劑層，合併，濃縮至膏狀，回收有機溶劑；或將濃縮液通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至洗脫液無色後，再用30％～90％乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，合併，濃縮提取物至膏狀，回收乙醇；(4)將步驟(3)所得的膏狀提取物乾燥，打粉即得淫羊藿總黃酮。
步驟(3)中所述萃取用有機溶劑，可以是乙酸乙酯、甲酸乙酯等脂肪酸酯，氯仿、二氯甲烷等滷代烴，正丁醇等脂肪族醇。
步驟(4)中所述乾燥方法，可以是真空乾燥法、冷凍乾燥法、鼓風乾燥法、噴霧乾燥法、常壓普通乾燥法、紅外乾燥法等適宜方法。
以該方法製得的是包括淫羊藿黃酮甙、淫羊藿黃酮次甙等多種活性成分在內的淫羊藿黃酮，其中淫羊藿總黃酮的含量在50％以上。
本發明的製劑每一單位所含藥用組份為1mg～1000mg。可以按需給藥。由於淫羊藿總黃酮無明顯毒副作用，所以不是很嚴格。醫生可以根據疾病的嚴重程度、接受治療的患者的體重、給要頻率、給要途徑以及療程和患者的個體差異性調整劑量，靈活改變。
本發明所用的藥物製劑可以按照已知的方法、與一種或多種可藥用的載體或稀釋劑等一起配製。該製劑可以是口服、非腸道、直腸、鼻內給藥的形式，也可以製成氣霧劑、吸入劑等給藥的形式。
口服給藥的固體藥物製劑可以是片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、散劑、丸劑等。可以按照它們的常規製備方法製備而成，在製備的過程中使用可以藥用的輔料。例如，在片劑或膠囊劑的製備過程中可以使用填充劑(例如澱粉、糊精、蔗糖、乳糖、硫酸鈣、碳酸鈣、微精纖維素等)、黏合劑(如甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基澱粉鈉、明膠、玉米澱粉等)、崩解劑(如乾燥澱粉、交聯羧甲基澱粉鈉、羧甲基澱粉鈉、低取代羥丙基纖維素等)、潤滑劑(如硬脂酸鎂、硬脂酸、微粉矽膠、聚乙二醇、滑石粉等)。片劑還可以按照目前已知的方法包衣。顆粒劑還需要選用相應的矯味劑(如蔗糖、枸櫞糖漿等)。軟膠囊劑的製備中所用的稀釋劑包括但不限於植物油、礦物油、丙二醇、吐溫、聚乙二醇(PEG)(200～8000)中的一種或幾種。助懸劑包括但不限於纖維素類如羥甲基纖維素鈉、羥乙纖維素、乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素等；膠樹類如阿拉伯膠等；其他如卡波姆、聚乙烯醇類等中的一種或幾種。乳化劑包括但不限於硬脂酸鈉、油酸鈉、司盤類(20～80)、吐溫類(20～80)、單硬脂酸甘油酯、羥化卵磷脂、二乙醯單甘油酯、二乙二醇硬脂酸酯、三羥基甲烷、乙二醇單硬脂酸酯、蜂蠟中的一種或幾種。所用防腐劑包括但不限於山梨酸甲酯、苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、尼泊爾金甲酯、尼泊爾金乙酯、苯甲醇中的一種或幾種。滴丸劑的製備中，基質包括但不限於聚乙二醇(PEG)6000、聚乙二醇(PEG)4000、聚乙二醇(PEG)1000、聚乙二醇(PEG)1500、硬脂酸鈉、甘油明膠、硬脂酸、泊洛沙姆等；冷凝液包括但不限於二甲基矽油、液體石蠟、植物油等。
口服液體製劑可以是合劑(口服液)、糖漿劑、乳劑、混懸劑、酏劑或懸浮液，還可以是在其使用前用水或者其他合適的載體衝調服用的乾燥產品。這些液體製劑可以按照本身已知的方法製備，在製備的過程中可以使用藥用添加劑，如懸浮劑(如纖維素衍生物、葡萄糖/蔗糖糖漿、山梨醇糖漿等)、乳化劑(如阿拉伯膠、大豆磷脂、卵磷脂、明膠、吐溫類等)、助懸劑(如甘油、單糖漿、單硬脂酸鋁植物油、膠體硫酸鎂鋁等)、防腐劑(如苯甲酸、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、山梨酸等)。根據需要還可以加入矯味物質、芬香成分、甜味劑等。
非腸道給藥製劑可以製備成注射液、優選靜脈內、皮下、肌內注射液。可以是以安瓿形式，也可以加入防腐劑製備成輸液形式。該製劑可以是水性或油性載體中的溶液、懸浮液或者是乳液形式，還可以加入適宜的懸浮劑、穩定劑、分散劑或者是調節滲透壓的試劑等。另外，活性成分可以製成固體無菌粉末，在使用之前用適宜的載體配製溶解。
本發明還可以製備成直腸給藥製劑栓劑等。栓劑的基質可以選擇WitepsolH、S和E，以及聚乙二醇、甘油明膠、吐溫61、泊洛沙姆等。也可以製備成適宜的氣霧劑、噴霧劑、滴劑等製劑。
本發明提供的單味中藥材淫羊藿中提取的淫羊藿總黃酮還可以用於製備保健食品添加劑和/或保健食品，可以製備成保健食品的各種劑型，例如片劑、膠囊劑、口服液、保健飲料、保健茶等；也可以作為食品添加劑，應用於食物(如麵包、麵條等)、保健茶、保健飲料等。
本發明和現有技術相比具有以下顯著新穎性和先進性首先，本發明是以單味中藥材淫羊藿為處方組成，以淫羊藿總黃酮作為主要的藥用組份，活性成分明確，避免了多味中藥材同時入藥，造成藥物的活性成分不明確的不足；其次，本發明採用了中藥的現代提取工藝，通過工藝的優化設計，選擇了以溶媒提取、溶劑萃取/大孔吸附樹脂洗脫分離等工藝步驟，對藥材進行提取、除雜、精製，得到有效成分、有效部位富集的淫羊藿總黃酮作為主要的藥用組份，製備工藝具有重現性和可控性；第三，由於本發明藥用組份比較明確，可以通過現代分析手段如紫外分析法、高效液相等方法進行定性定量測定，藥物質量可控，符合現代醫藥發展對中藥發展提出的成分明確、質量可控的要求；第四，本發明是對傳統的補腎壯陽藥淫羊藿為研究開發對象，對其化學成分、藥理作用，特別是以現代藥理實驗為基礎的藥理藥效學進行了深入的研究和探索，發現淫羊藿總黃酮能夠顯著改善老年痴呆的記憶障礙、認知障礙，還能夠提高腦內氧自由基的代謝、調節單胺類神經遞質代謝，改善老年痴呆症的學習記憶的物質基礎，從而改變了淫羊藿傳統的「補腎壯陽」的用藥方向，開闢了它用於血管性老年痴呆症、阿爾茨海默症等各種老年痴呆症的預防和治療的新的藥用方向和作用；第五，本發明是將其具有藥用活性的成分以現代藥物製劑作為載體用於老年痴呆症的預防和治療，各種製劑都是按照製劑本身的需要和特點，採用現代製劑技術製備而成，體現了現代中藥製劑的科學性和多樣性，同時也符合現代人對藥物製劑的要求和選擇。
圖1是實施例1的工藝流程圖；圖2是實施例2的工藝流程圖；圖3是對AD模型大鼠被動學習記憶的影響的實驗結果；
圖4是對AD模型大鼠主動學習記憶的影響的實驗結果；圖5是對AD模型大鼠海馬組織單胺遞質含量的影響的實驗結果；圖6對AD模型大鼠顳側腦組織單胺遞質含量的影響的實驗結果；圖7是對VD模型大鼠學習獲得能力的影響的實驗結果；圖8是對VD模型大鼠記憶鞏固能力的影響的實驗結果；圖9是對VD模型大鼠腦組織SOD活力的影響的實驗結果；圖10是對D-半乳糖所致痴呆小鼠腦膽鹼能系統的影響的實驗結果。
為了更進一步了解本發明，下面以實施例對本發明作進一步的說明和闡釋，但是本發明並不僅限於所列舉的實施例。
具體實施例實施例1淫羊藿總黃酮(萃取法精製)的製備工藝將中藥材淫羊藿清洗，乾燥，粗粉後，加入10倍量75％乙醇，回流提取，提取時間1.5小時，過濾，在藥材中再加入8倍量70％乙醇，回流提取兩次，第一次提取時間1小時，第二次提取時間0.5小時，過濾，合併三次回流提取液，棄去藥渣；將合併液減壓濃縮至無乙醇味，並且回收乙醇；在濃縮液中加入1/3體積的有機溶劑乙酸乙酯，充分混勻後靜置，分離萃取層和水層；在水層中依次加入1/4體積、1/5體積的乙酸乙酯再萃取2次，分離水層，合併三次所得的萃取液層，減壓濃縮，回收乙酸乙酯，所得提取物放入真空乾燥箱，在60℃溫度下乾燥，打粉即得。
其工藝流程見說明書附圖1。
實施例2淫羊藿總黃酮(大孔樹脂柱分離純化)的製備工藝；將中藥材淫羊藿清洗，乾燥，粗粉後，加入10倍量75％乙醇，回流提取，提取時間1.5小時，過濾，在藥材中再加入8倍量70％乙醇，回流提取兩次，第一次提取時間1小時，第二次提取時間0.5小時，過濾，合併三次回流提取液，棄去藥渣；將合併液減壓濃縮至無乙醇味，並且回收乙醇；濃縮液通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至洗脫液無色後，再用70％乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇；將所得提取物放入真空乾燥箱中，在60℃溫度下乾燥，打粉即得淫羊藿總黃酮。
其工藝流程見說明書附圖2。
實施例3口服片劑淫羊藿總黃酮 0.05～0.40克/片硬脂酸鎂 0.1～0.3毫克/片羧甲基澱粉鈉 4～12毫克/片微晶纖維素50～100毫克/片將淫羊藿總黃酮與羧甲基澱粉鈉、微晶纖維素混合，過篩，使其混勻，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，乾燥後，整粒，加入適量的硬脂酸鎂，然後用適當直徑的衝壓裝置將顆粒壓片。
實施例4硬膠囊劑淫羊藿總黃酮 0.05～0.40克/粒羧甲基澱粉鈉 4～12毫克/粒硬脂酸鎂 0.1～0.3毫克/粒澱粉 50～100毫克/粒將淫羊藿總黃酮過篩，與羧甲基澱粉鈉、澱粉混合，過篩，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，乾燥後，整粒，加入適量的硬脂酸鎂，用合適的裝置將該混合物裝入硬明膠膠囊中。通過改變淨重，以及按照需要改變膠囊的大小可以製備不同的膠囊。
實施例5顆粒劑淫羊藿總黃酮 2～20克/袋糊精 2～10克蔗糖 2～15克矯味劑適量甜味劑適量將藥用成份和蔗糖、糊精、矯味劑、甜味劑混合均勻，加入適量的水或適宜濃度的乙醇制粒，乾燥後，整粒，分裝。
實施例6軟膠囊劑淫羊藿總黃酮 0.05～0.40克/粒稀釋劑300～450毫克/粒助懸劑5～7.5毫克/粒乳化劑5～7.5毫克/粒水60～90毫克/粒每粒囊殼的組份和含量如下明膠 100～150毫克甘油 30～50毫克水100～150毫克防腐劑適量將明膠置於膠罐中，加入可溶解明膠量的純化水，膠罐溫度適宜，溶化後，加入甘油、防腐劑，攪拌均勻，抽真空脫氣後保溫靜置；按比例將淫羊藿總黃酮與稀釋劑、乳化劑、助懸劑混合均勻，將內容物和製備好的明膠置旋轉壓囊機，壓製成軟膠囊，定型、乾燥即可。可以按照不同需要，改變內容物製備成不同規格的軟膠囊。
實施例7滴丸淫羊藿總黃酮 2～20毫克/粒基質 40～80毫克冷凝液甲基矽油(適量)在淫羊藿總黃酮中加水製成均勻糊狀，再加入熔融的基質液，加熱熔融成澄清液體，倒入已預熱的滴丸器中，控制滴制溫度和滴速，滴入冷凝液中，成丸後吸乾冷凝液，收集滴丸，置乾燥器內即得。
實施例8糖漿劑淫羊藿總黃酮 20～100毫克羥丙基甲基纖維素 適量緩衝劑適量矯味劑適量防腐劑適量甜味劑適量著色劑適量純化水 至 10～100毫升將羥丙基甲基纖維素分散在熱水中，冷卻，然後與含有活性成分和製劑中其他成分的含水懸浮液混合。將所得溶液調製需要體積並混合均勻，滅菌後分裝。
實施例9注射劑淫羊藿總黃酮 5～100毫克/單位注射用0.9％氯化鈉溶液至 5～10毫升將藥用成份溶解於注射用氯化鈉溶液中，將溶液調至所需要的體積，調節pH值，灌裝後在高溫下加熱滅菌。
實施例10舌下片淫羊藿總黃酮 0.05～0.40克/片可壓蔗糖 40～80毫克/片硬脂酸鎂 0.1～0.3毫克/片將淫羊藿總黃酮經合適的篩過篩後與其他成分混合均勻，並用適當的衝壓裝置壓片。可以通過改變活性成分與載體的比例或者通過改變壓縮重量而製備成不同強度的片劑。
實施例11直腸給藥的栓劑淫羊藿總黃酮0.05～0.40克/片Witepsol H150.5～2克製備藥用成份在熔融Witepsol H15中的懸浮液，並且適當的裝置將其裝入1克栓劑模中。
下面用藥理實驗進一步說明本發明。
一、對痴呆模型大鼠學習記憶作用的影響(一)阿爾茨海默症(AD)模型大鼠學習記憶的影響1、實驗方法取健康Wistar雄性大鼠60隻，3～4月齡，體重200～250g。隨機分為假手術組10隻，AD模型組10隻，給藥低劑量組(0.01g/kg)10隻，給藥中劑量組(0.03g/kg)，給藥高劑量組(0.06g/kg)10隻，銀可絡片(銀杏葉片0.02g/kg)對照組10隻。以1.0ml/100g體重，灌胃給藥。假手術組和AD模型組灌胃等容量飲用水，每日灌胃給藥一次，連續灌胃15天。正式給藥前一天，將大鼠用1％戊巴比妥鈉3ml/kg將腹腔麻醉，剪去顱頂切口區毛，固定在腦立體定位儀上。取大鼠顱頂正中切口，參照大鼠的腦立體定位圖譜(尾側1.4mm，左右兩側各3.1mm，深6.9mm)，對兩側海馬CA1區立體定位後，用牙科電鑽，鑽開顱骨，用微量注射器垂直進針，將用0.01mol/L，PH7.4PBS緩衝溶液的喹啉酸2μl(含有150nmol喹啉酸)緩慢注入海馬CA1區。假手術組注入等量的PBS緩衝溶液。注入速度為0.05μl/min，留針10min，然後在10min中內逐漸緩慢將針拔出。局部消毒後，用牙科水泥固定鑽孔，縫合皮膚，並給大鼠腹腔注射青黴素注射液120000U/kg。
第14天起，給藥後1小時，以多功能迴避反射條件儀，採用跳臺法進行被動學習記憶訓練，觀察動物自平臺跳下電柵的潛伏期及受電擊錯誤次數，次日進行測試；第14天同天採用穿梭法進行主動學習記憶訓練，觀察主動迴避期(Tl)、主動迴避次數(Nl)、被動迴避潛伏期(Ts)、被動迴避次數(Ns)，第15日和16日，連續測試2日。神經行為學測試結束後，處死動物，解剖取大鼠腦海馬組織和顳側組織，分別置於硫酸紙上稱重後，放入裝有預冷的酸性正丁醇中，冰浴條件下，製備組織均漿，以酸性正丁醇調整組織均漿濃度為0.1g/3ml。將均漿倒入具塞離心管中，震蕩5min，離心10min(轉速3000)，取適當正丁醇液，以化學螢光測定法進行去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚醋酸(5-HIAA)的提取和測定。實驗結果以X±S的方法計算。
2、實驗結果實驗結果顯示與假手術組相比，AD模型組動物的測試階段跳臺錯誤次數明顯增加，具有顯著意義(**P＜0.05)；與AD模型組相比，大、中、劑量的給藥組和銀可絡組大鼠的跳臺錯誤次數均有明顯減少，表現極顯著的統計學意義(***P＜0.01)。表明給藥後，動物的被動學習記憶能力有顯著提高。
與假手術組相比，AD模型動物的測試主動迴避潛伏期(Tl)及主動迴避次數(Nl)均明顯減少(*P＜0.01)；而被動迴避潛伏期(Ts)及被動迴避次數(Ns)均明顯增加(*P＜0.01，**P＜0.05)，表現出極顯著意義；與AD模型組相比，各劑量給藥組和銀可絡組對Tl和Nl均有顯著增加的作用(**P＜0.01)，對Ts和Ns有明顯減少的作用(***P＜0.01)，顯示出極顯著的統計學意義。表明給藥後，動物的主動學習記憶能力得到顯著提高。
與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬的NE含量有顯著性減少(*P＜0.05)，5-HT含量也有較明顯減少，但是與假手術組相比，未見顯著的統計學意義；和AD模型組比較，各劑量的給藥組和銀可絡組均可顯著提高NE含量，顯著差異(**P＜0.05)；小劑量給藥組可顯著提高DA和5-HT含量，降低5-HIAA含量；中劑量組對5-HIAA含量也有顯著降低作用，也可以提高DA和5-HT含量(**P＜0.05，***P＜0.01)；高劑量組對上述單胺遞質的含量也有明顯的調節作用，顯示了所給藥物是隨劑量的增加而增加大鼠海馬NE、DA、5-HT的含量。
與假手術組相比，AD模型大鼠顳側腦組織5-HT含量明顯減少，統計學意義顯著(*P＜0.05)；和AD模型組相比，給藥小劑量組、中劑量組可顯著提高5-HT含量(**P＜0.05)，對DA、5-HIAA含量有一定調節作用，大劑量組對DA、5-HT、5-HIAA也具有一定程度的調節作用，但是統計學差異不是很顯著。
對AD模型大鼠被動學習記憶的影響的實驗結果詳見說明書附圖3；對AD模型大鼠主動學習記憶的影響的實驗結果詳見說明書附圖4；對AD模型大鼠海馬組織單胺遞質含量的影響的實驗結果詳見說明書附圖5；對AD模型大鼠顳側腦組織單胺遞質含量的影響的實驗結果詳見說明書附圖6。
(二)血管性痴呆症(VD)模型大鼠學習記憶的影響1、實驗動物及分組取成年雄性SD大鼠60隻，SPF級，體重180～220g。動物分組情況；按照水迷宮訓練成績隨機分為六組1)假手術組10隻；2)陽性藥物組(腦復康組)10隻；3)給藥組(以淫羊藿總黃酮為主要成分的提取物組)低劑量組10隻；4)中劑量組10隻；5)高劑量組10隻；6)模型組10隻。
2、造模和給藥將大鼠按4％戊巴比妥鈉1ml/kg，ip，麻醉後，分離暴露雙側頸總動脈。硝普納按2.5mg/kg腹腔注射後即刻用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10min後，復通10min，再次夾閉10min，再通後縫合。實際過程中使大鼠肛溫保持在37±0.3℃，以防止低溫對大鼠腦缺血損傷的保護作用，術後保溫飼養。造模後，待動物清醒後當日即開始給藥。陽性對照組予腦復康，按0.4g/100g體重灌胃；模型組和假手術組給予相同劑量的生理鹽水灌胃，每日1次，連續15天。
3、實驗方法水迷宮實驗裝置有三處盲端，只有一個通往出口的階梯。實驗時，每隻訓練四次。第五次記錄其遊完全程的時間，以VD大鼠自水迷宮起點遊至終點所需要的時間和中途進入盲端的次數(錯誤次數)，作為衡量學習獲得能力的指標。如果在3min時仍未找到階梯，則定為不能完成學習訓練，即有明顯的學習能力低下。24h後重複測試上述指標作為記憶鞏固能力的指標。大鼠在水迷宮中進入盲端的次數越少及遊出時間越短表明動物學習記憶能力越強。處置動物，將大鼠處死後取腦，分離出左側海馬和皮質，冰生理鹽水衝洗血液，濾紙擦乾後稱重，加入10倍量生理鹽水，均漿器中研磨成10％均漿，離心，取上清液。採用考馬斯亮蘭蛋白測定法進行蛋白測定。計算公式為蛋白含量(g/L)＝測定管吸光度/標準管吸光度×標準管濃度。SOD測定，測定方法按照所用SOD試劑盒說明書，計算公式組織均漿中SOD活力＝(對照管吸光度-測定管吸光度)後反應液總體積/對照管吸光度×50％×取樣量(ml)×組織中蛋白含量(U/mg·pro)。
4、實驗結果各組動物手術後15天和16天分別記錄學習和記憶成績。模型組和假手術組相比前者遊完全程時間、進入盲端次數和時間明顯增加(*P＜0.01)。給藥組與模型組相比前者遊完全程時間、進入盲端次數和時間明顯減少(**P＜0.05)；給藥組和陽性對照組相比兩者差異不是很顯著，無統計學意義。
SOD為機體清除自由基酶系統中的較重要的酶類，其清除自由基的能力與酶的活性成正比，能不斷地清除多餘的自由基，保證機體代謝平衡。本實驗結果表明模型組腦組織SOD的活力明顯下降，抗自由基能力下降；而給藥組和陽性對照組可提高SOD活力，具有抗自由基損傷作用，且以給藥組的療效為優。與模型組比較*P＜0.001，與假手術組比較**P＜0.01；與陽性對照組比較***P＜0.05。
對VD模型大鼠學習獲得能力的影響的實驗結果詳見說明書附圖7；對VD模型大鼠記憶鞏固能力的影響的實驗結果詳見說明書附圖8；對VD模型大鼠腦組織SOD活力的影響的實驗結果詳見說明書附圖9。
(三)對D-半乳糖所致痴呆小鼠腦膽鹼能系統的影響1、實驗方法選擇三月齡雌性昆明小鼠100隻，體重40±5g，隨機分為正常對照組，模型組，給藥小、中、大劑量組(60、180、600mg/kg)，銀可絡組(12mg/kg)。每日灌胃給藥1次，容量0.5mL/20g，正常對照組及模型組給予等容量蒸餾水。除正常對照組外，其餘各組小鼠在每日給藥的同時，均於背部皮下注射5％D-半乳糖(0.5mL/只)。正常對照組小鼠皮下注射等容量生理鹽水。以上均連續給藥60天。
乙醯膽鹼酯酶(AchE)活性測定末次給藥後1小時，動物均脫頸椎處死，立即取腦，稱重，冰浴中以生理鹽水製備10％腦均漿，測定AchE活性。AchE活性以生成的膽鹼含量表示(μmol/ml)。
膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)活性測定末次給藥後1小時，動物脫頸椎處死，立即取腦，稱重，加18倍磷酸緩衝液(PBS，75mmol/L，pH7.4)，於冰浴中均漿，取均漿10μL，加入地物緩衝液(含NaCl1600mmol/L，MgCl240mmol/L，毒扁豆鹼2.0mmol/L，3H-乙醯輔酶A0.88mmol/L)，37℃溫浴40min後，加150μL含四苯硼鈉70mg/mL的庚烷酮，振搖，離心，取上層有機相，於Beckman LS Analyzer中測定其放射性，同時取均漿適量，用考馬斯亮蘭法測定蛋白含量。ChAT活性以形成的乙醯膽鹼[nmol/(mg·h)蛋白]表示。
2、實驗結果表明給藥組可以明顯降低D-半乳糖致痴呆模型小鼠腦組織膽鹼酯酶活性，明顯提高其腦組織膽鹼乙醯轉移酶活性。提示本品可以通過改善中樞膽鹼能系統功能的紊亂，起到治療痴呆的作用。注與正常對照組比較*P＜0.01；與模型組比較**P＜0.05。
其實驗結果詳見說明書附圖10。
權利要求
1.淫羊藿總黃酮用於製備預防和治療老年痴呆症的藥物或保健品中的用途。
2.根據權利要求1所述的淫羊藿總黃酮，是由單味中藥材淫羊藿經過溶媒提取、有機溶劑萃取或大孔樹脂柱精製而成的，其製備工藝如下所述(1)將中藥材淫羊藿清洗，乾燥，粉碎成粗粉，加入5～12倍量50～95％乙醇，回流提取2～3次，每次0.5～2小時，過濾，合併提取液；(2)濃縮提取液至無醇味，回收乙醇；(3)在濃縮液中加入1/3～1/5體積的有機溶劑萃取2～3次，分取有機溶劑層，合併，濃縮至膏狀，回收有機溶劑；或將濃縮液通過大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至洗脫液無色後，再用30％～90％乙醇溶液進行洗脫，收集乙醇洗脫液，合併，濃縮提取物至膏狀，回收乙醇；(4)將步驟(3)所得的膏狀提取物乾燥，打粉即得淫羊藿總黃酮。
3.根據權利要求2所述的淫羊藿總黃酮，其特徵在於是包括淫羊藿黃酮甙、淫羊藿黃酮次甙等多種活性成分在內的總黃酮，其中總黃酮的含量在50％以上。
4.根據權利要求1所述的淫羊藿總黃酮的用途，其特徵在於可以用於製備預防和治療血管性痴呆、阿爾茨海默、混合型痴呆等各種老年痴呆症的藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的淫羊藿總黃酮的用途，其特徵在於主要用於治療阿爾茨海默症的藥物中的應用。
6.根據權利要求4或5所述的淫羊藿總黃酮的用途，其特徵在於可以用於製備成口服、直腸、肌內、靜脈內、鼻腔等所有給藥形式的藥物。
7.根據權利要求6所述的含有淫羊藿總黃酮的製劑，其特徵在於所述的製劑包括普通片劑、含片、緩釋片、控釋片、分散片、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、滴丸、丸劑、注射劑、乳劑、吸入劑、氣霧劑或栓劑等藥學上可接受的製劑。
全文摘要
本發明提供了一種預防和治療老年痴呆症的藥物及其製劑和用途。本發明是以單味傳統中藥材淫羊藿為處方組成，通過溶媒提取、萃取或大孔樹脂柱洗脫，乾燥等工藝程序提取精製淫羊藿總黃酮，以其作為主要成分，用於製備預防和治療血管性痴呆、阿爾茨海默等老年痴呆症的藥物和/或保健品中的應用。本發明可以製備成包括片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、滴丸、注射劑、乳劑、吸入劑、氣霧劑或栓劑在內的任何一種適宜的藥物製劑。
文檔編號A61K9/16GK1931212SQ20051009441
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月16日 優先權日2005年9月16日
發明者阮錦滿, 史美耿, 石海雲, 王永毅, 姚小燕 申請人:南京宇道科技開發有限公司