一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置的製作方法

2023-06-01 13:47:06

專利名稱：：一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置的製作方法
技術領域：
：本發明屬農業領域獸醫專業，特別涉及含血凝素(HA)的動物病毒抗體監測用的血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置的改進。
背景技術：
：含血凝素的動物病毒如雞新城疫、禽流感、雞產蛋下降綜合症都是嚴重危害養殖業發展的病毒性傳染病。通過免疫監測確定最佳免疫時機，適時免疫接種是當前控制這幾種重大傳染病發生的最好方法。血凝抑制(HI)試驗是目前國際動物衛生組織(OIE)推薦的進行雞新城疫和禽流感等抗體檢測的金標準，也是中華人民共和國國家標準規定的含血凝素病毒的抗體檢測標準。但是，這種HI試驗需要用SPF(無特定病原)或不免疫公雞血製備1%雞紅細胞懸液(指示劑)。SPF雞的飼養需要有專門的SPF雞舍和嚴格的飼養條件；不免疫雞的詞養也存在著發生疫病的風險，且禽流感等疫病不免疫需經省級獸醫行政主管部門批准；採血時需要用阿氏(Alsevers)液(主要成份為抗凝劑)，需要離心紅細胞配製1%紅細胞懸液。洗滌用PBS或生理鹽水，需要10mlX6轉子和1.5X24(或12)轉子的小型離心機各一臺；需要分離血清，除雞血清以外，用雞紅細胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在於血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗時進行抗原標準化；整個試驗大約需要4個小時。通常測試步驟如下(1)、血清分離用2ml或5ml注射器，被檢雞翅靜脈採血2—3ml，室溫靜置數小時或離心2000r/min10min左右至析出血清。(2)、1%紅細胞懸液製備採集至少3隻SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2，0.01mo1/1.PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min,洗滌後用PBS配成體積分數為1%紅細胞懸液，4'C保存備用。(3)、抗原滴定與校正血凝試驗(HA)操作術式孔號123456789101112稀釋倍數2223242526272s2'0211對照等滲PI〗S25-25《5，25-25-25^25—一25抗原,，""""^等滲PBS2525252525252525252525251%雞紅細胞252525252525252525252525感作2(TC左右40分鐘或4,C60分鐘注第12孔為紅細胞對照。能使紅細胞完全凝集(100%凝集，++++，不流淌)的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為l個血凝單位(HAU)。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數。如果抗原標定錯誤，將直接影響試驗結果，甚至如果抗原小於4個單位時整個試驗都不成立，要從頭再來。因此抗原稀釋為4個單位後，一般還要進行校正。(4)、HAU抗原校正tableseeoriginaldocumentpage6(5)、血凝抑制試驗(HI)操作術式:tableseeoriginaldocumentpage6注第11孔為4HAU抗原對照，第12孔為紅細胞對照。現有測試方法存在以下缺點方法繁雜、反應時間長、所用器材較多、採血困難等問題，因此，只用於小型化驗室，不適於現場應用。
發明內容本發明就是提供一種適於現場使用的病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置。本發明的病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法如下本發明包括檸檬酸鈉100g—300g、葡萄糖400g—600g、氯化鈉150—170g、氯化鉻l一5g、疊氮鈉10g—20g，加入1000ml水中，以NaOH調pH至7.0。一種病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置，包括箱體，箱體是由箱蓋、具有提手的箱底組成，其結構要點箱蓋的擋板內設置有平板玻璃；箱底上設置有檢測工具盒，檢測工具盒內設置有分隔，分隔內設置有藥劑瓶、微量吸液器、血凝反應板、離心管、離心管架、吸管、平皿、具有燈泡的雞白痢檢測器。本發明的有益效果本發明的病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法是一種固定抗體稀釋抗原的方法，預先將抗原在實驗室進行標定，試驗時只需採取被檢雞的一滴全血，省略了現有標準HI法的製備紅細胞懸液、分離被檢血清、標定抗原等一系列繁瑣的準備工作和相應的設備與器材，雞採血量從1毫升以上降至0.05毫升(l滴)，解決了現有方法雛雞採血困難的問題；可將現有標準法的4小時以上縮短為本法的40分鐘以內，又不影響試驗結果的敏感性和特異性。可以裝配成試劑盒，適用於現場室溫下各日齡及各種類型養殖場雞含血凝素病毒的抗體監測。本發明的病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置(1)適於現場使用打開箱蓋、可一目了然看到各種檢測工具，取拿很是方便、實用；本檢測應用裝置採血容易，只需要一滴，而且反應時間較短，所用器材較少，因此攜帶方便；一個檢測應用裝置就相當於一個小型化驗室，在普通養雞戶就可以應用。(2)—機多用可檢測雞新城疫、禽流感、產蛋下降綜合症、傳染性法氏囊炎及雞白痢等五種重大傳染病。禽流感、雞新城疫、產蛋下降綜合症抗體監測所需時間從4小時以上降至40分鐘以內，反應結果維持時間可長達十幾個小時穩定不變(常規方法僅能維持不足20分鐘)，雞採血量從1毫升以上降至0.05毫升，除本盒外不需要其它的儀器設備；檢測雞傳染性法氏囊炎抗體靈敏度可增加一個以上；由於在本檢測裝置中加入了光源，增加了檢測雞白痢凝集反應的清晰度，易於結果觀察和最終診斷。本發明的病毒血凝抑制試驗工作液為專用工作液，具有反應穩定、清晰、準確等優點，可以長期保存使用，使用時用蒸餾水或去離子水20倍稀釋即可。應用本發明的病毒血凝抑制試驗工作液進行的a全血血凝抑制試驗方法術式(1)、抗原的標定抗原只需每批標定一次，且如果抗原標定錯誤還可以根據重新標定的結果改正HI試驗結果，不會前功盡棄。(2)、將工作原液倒入100ml瓶內，加水至100ml，抗原按標註量用工作液稀釋。(3)、根據被檢雞數將稀釋好的工作液移入離心管中，每管lml。、針刺被檢雞翅下靜脈，待出血後用微量吸液器吸取0.05ml，移入裝有工作液的試管內反覆抽吸3—5次將血液混合後備用。用本發明進行免疫監測操作術式表tableseeoriginaldocumentpage9置室溫下反應30分鐘左右至對照組完全沉降始開始判定本發明與國內外同類現行技術指標的比較tableseeoriginaldocumentpage9圖1是本發明的應用裝置的結構示意圖。具體實施例方式水可為去離子水或蒸餾水。本發明還包括磷酸二氫鉀0-16g或磷酸氫二鈉0-58g或氯化鉀0-4g。實施例1:本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入10OOmL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉(NaCl)170g、氯化鉻(CrCl36H20)2g、疊氮鈉(關3)10g，用NaOH調pH至7.0。使用時作20倍稀釋。實施例2:本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入lOOOmL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉(NaCl)160g、磷酸二氫鉀(KH2P04)4g、磷酸氫二鈉(NeOIPO,12仏0)58g、氯化鉀(KC1)4g、氯化鉻(CrCl36H20)2g、疊氮鈉(關3)10g，用NaOH調pH至7.0。使用時作20倍稀釋。實施例3:本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入1000mL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉(NaCl)170g、磷酸二氫鉀(KH2P04)13.6g、氯化鉻(CrCl36H20)2g、疊氮鈉(NaN:,)10g，用NaOH調pH至7.0。使用時作20倍稀釋。一種病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置，包括箱體l，箱體l是由箱蓋13、具有提手2的箱底3組成，箱蓋13的擋板16內設置有平板玻璃18;箱底3上設置有檢測工具盒19，檢測工具盒19內設置有分隔8，分隔8內設置有藥劑瓶5、微量吸液器11、血凝反應板17、離心管15、離心管架14、吸管9、平皿4、具有燈泡7的雞白痢檢領!l器6。擋板16可由箱蓋13內兩側的拉帶12固定；擋板16的下方可設置兩個工具袋IO，放置筆和記錄本，方便記錄。應用實例通過固定抗體稀釋抗原的方法建立禽流感的a微量全血血凝抑制試驗快速免疫監測方法。分別用本發明的病毒血凝抑制試驗工作液和現有標準方法(P血凝抑制試驗)測定雞新城疫疫苗免疫雞的血清HI抗體，通過30次成對設計對比試驗和30次重複試驗，比較兩種方法的差異。試驗結果見表1和表2。表l應用本發明的病毒血凝抑制試驗工作液進行的檢測試驗與現有標準法檢測結果比較試tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12由表l可以看出，進行30次成對設計對比試驗，快速法和現有標準法檢測結果差異均不顯著。證明a全血法與現有標準HI試驗同樣準確可靠；由表2可見，30次重複試驗結果全部差異不顯著。證明用本發明的工作液監測禽流感的血清抗體濃度是可行的。下面以雞白痢實例說明一次檢測過程(1)取平板玻璃18,劃出3X3cm的方塊；(2)在每個方塊中心滴一滴(0.02ml)結晶紫抗原；(3)針刺雞翅靜脈，利用微量吸液器11吸取與抗原相同體積的一滴血液滴於抗原旁；(4)利用微量吸液器11將抗原與新鮮血液混勻；(5)將雞白痢檢測器6插上電源，平板玻璃18在燈泡7上方輕輕晃動，在2分鐘內出現凝集塊者為陽性反應，無凝集塊者為陰性反應。權利要求1、一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法，其特徵在於，包括檸檬酸鈉100g-300g、葡萄糖400g-600g、氯化鈉150g-170g、氯化鉻1g-5g、疊氮鈉10g-20g，加入1000ml水中，以NaOH調pH至7.0。2、根據權利要求1所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法，其特徵在於，還包括磷酸二氫鉀0-16g或磷酸氫二鈉0-58g或氯化鉀0-4g。3、根據權利要求1所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法，其特徵在於，本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入1000mL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉170g、氯化鉻2g、疊氮鈉10g，用NaOH調pH至7.0。4、根據權利要求1或2所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法，其特徵在於，本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入1000mL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉160g、磷酸二氫鉀4g、磷酸氫二鈉58g、氯化鉀4g、氯化鉻2g、疊氮鈉10g，用NaOH調pH至7.0。5、根據權利要求1或2所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法，其特徵在於，本發明的血凝抑制試驗工作液的配製將200g檸檬酸鈉加入1000mL水中，水浴溶化後，再加入葡萄糖500g、氯化鈉170g、磷酸二氫鉀13.6g、氯化鉻2g、疊氮鈉10g，用NaOH調pH至7.0。6、一種病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置，包括箱體(1)，箱體(1)是由箱蓋(13)、具有提手(2)的箱底(3)組成，其特徵在於箱蓋(13)的擋板(16)內設置有平板玻璃(18);箱底(3)上設置有檢測工具盒(19)，檢測工具盒(19)內設置有分隔(8)，分隔(8)內設置有藥劑瓶(5)、微量吸液器(11)、血凝反應板(17)、離心管(15)、離心管架(14)、吸管(9)、平皿(4)、具有燈泡(7)的雞白痢檢測器(6)。7、根據權利要求6所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置，其特徵在於擋板(16)由箱蓋(13)內兩側的拉帶(12)固定。8、根據權利要求6所述的一種病毒血凝抑制試驗工作液的應用裝置，其特徵在於擋板(16)的下方設置兩個工具袋(10)。全文摘要一種病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置屬農業領域獸醫專業。本發明就是提供一種適於現場使用的病毒血凝抑制試驗工作液的生產方法及其應用裝置。本發明包括檸檬酸鈉100g-300g、葡萄糖400g-600g、氯化鈉150-170g、氯化鉻1-5g、疊氮鈉10g-20g，加入1000ml水中，以NaOH調pH至7.0。本發明的裝置，包括箱體，箱體是由箱蓋、具有提手的箱底組成，其結構要點箱蓋的擋板內設置有平板玻璃；箱底上設置有檢測工具盒，檢測工具盒內設置有分隔，分隔內設置有藥劑瓶、微量吸液器、血凝反應板、離心管、離心管架、吸管、平皿、具有燈泡的雞白痢檢測器。文檔編號G01N33/53GK101634654SQ20081001246公開日2010年1月27日申請日期2008年7月23日優先權日2008年7月23日發明者新姜,崔漓波,崔玉君,鵬張,李微蕎,葛寶偉,邵傳明,顧貴波申請人:遼寧省動物疫病預防控制中心