用於治療癌症的單克隆抗體的製作方法

2023-09-09 22:37:20

專利名稱：用於治療癌症的單克隆抗體的製作方法
用於治療癌症的單克隆抗體基於抗體的癌症療法已被成功地引入臨床中，並已在過去十年中成為腫瘤學中最具有前景的療法。與傳統藥物相比，基於抗體的癌症療法具有較高特異性和較低副作用等潛力。究其原因是抗體能夠精確地區分正常和腫瘤細胞，並且它們的作用模式依賴於毒性較低的免疫抗腫瘤機制，例如補體活化和細胞毒性免疫細胞的招募。基於抗體之療法的靶標需要具有特別的性質，所述性質形成了正確區分正常細胞和腫瘤細胞的基礎。顯然，僅存在於腫瘤細胞中並在正常組織中完全檢測不到的靶標對於開發有效且安全的抗體療法來說是理想的。另一方面，高水平過表達可作為治療窗的基礎並且副作用低，例如人類2型表皮生長因子受體(HER-2)作為基因擴增的結果，其是抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀(Here印tin))的良好靶標。用於腫瘤治療的已經批准或在臨床開發中的抗體的其它靶標具有不同的性質，它們並非基於腫瘤細胞上靶分子的大量過表達。在針對蛋白聚糖MUC-I的抗體的情形中，該靶標之骨架的肽重複表位在腫瘤細胞中糖基化不足，並因此與其正常對應物不同。在針對 CD20(利妥昔單抗(rituximab))、CD52(坎帕斯-IH(Campath-IH))和 CD22(依帕珠單抗 (epratuzumab))的抗體的情形中，抗體靶標在腫瘤細胞和正常淋巴細胞上具有類似的表達水平。此時，由於靶標陰性的幹細胞恢復了正常淋巴細胞群，因此利用抗體剔除正常細胞是可耐受的。抗體靶標可接近性具有差異的另一些實例包括癌胚抗原(CEA)和碳酸酐酶 IX(CA9)。這兩種抗原均分別表達於結腸和腎的正常上皮細胞上。然而，放射性標記的成像抗體能夠很好地區分腫瘤組織與正常組織，並且細胞毒性抗體耐受良好。這極有可能是由於CA9和CEA限制性表達在正常上皮組織的腔室一側(IgG抗體沒有機會接近此處)所致。 同樣地，抗原上皮細胞粘附分子(Ep-CAM)屬於這一類。作為上皮細胞的同型細胞粘附分子，其定位於細胞間隙。令人感興趣的是，由於高親合力的抗Ep-CAM抗體毒性很強，因此中等親合力的抗體耐受良好。這提示可接近正常細胞上的Ep-CAM靶標，同時還表明抗體結合動力學可拓展治療的領域。已有八種抗體被批准用於治療腫瘤疾病，其中大多數為淋巴瘤和白血病(Adams， G. P. & Weiner, L. Μ. (2005) Nat. Biotechnol. 23，1147-1157)。只有 3 種單克隆抗體(mAb) (即赫賽汀，阿瓦斯汀(Avastin)和愛必妥(Erbitux))解決了佔癌症誘發死亡率90%以上的實體癌問題。醫療中的大批需要、已提供的經批准mAb的明顯臨床有益效果及其巨大的商業成功均激發了開發針對更廣患者群的基於抗體之治療以及提高其療效的創新方法的一輪浪潮(Brekke, 0. H. & Sandlie, I. (2003)Nat. Rev. Drug Discov. 2,52-62 ；Carter, P. (2001) Nat. Rev. Cancer 1,118-129)。開發下一代升級的基於抗體之癌症療法所面臨的一個挑戰是選擇合適的靶標分子，這是有利的毒性/功效模式的關鍵所在。對於目前可用於治療實體癌的抗體(由於其靶標表達在正常組織上所致)來說， 尚未充分發掘出抗體分子作用模式的全部潛能。例如，赫賽汀的靶標Her2/neU表達於許多正常的人體組織中，包括心肌(Crone, S. Α.，Zhao, Y. Y.，Fan, L.，Gu, Y.，Minamisawa,S. ， Liu, Y. ， Peterson, K. L. ， Chen, J. ， Kahn, R. ， Condorelli, G.等(2002)Nat. Med. 8, 459-46 。因此，所設計的赫賽汀具有減低的免疫效價，並且不能以最高有效劑量給藥，否則將出現不能承受的毒性。這種「使具有鋒利潛力的刀變鈍」限制了赫賽汀的療效。除了不在毒性相關的正常組織中表達以外，在腫瘤細胞表面上穩健且大量表達以及表現出促進腫瘤的功能是理想的抗體靶標的期望特徵(Houshmand，P. & Zlotnik， Α. (2003)Curr. Opin. Cell Biol. 15，640—644)。為了發現用於抗體治療癌症的新靶標，我們使用綜合數據挖掘和實驗驗證方法鑑定出GT468。GT468是胎盤特異性基因，其在多種腫瘤特別是乳腺癌中往往異常活化並高度表達。在MCF-7和BT-549乳腺癌細胞中，RNAi介導的GI~468沉默顯著破壞了運動、遷移和侵入，並誘導G1/S細胞周期阻滯使增殖幾乎完全受阻。GT468的敲低與細胞周期蛋白Dl的表達減少相關，並降低了 AKT激酶的磷酸化。此外，GT468位於癌細胞的表面上，其對於拮抗該分子之生物功能的抗體來說是可接近的。GT468具有使其成為極具吸引力的治療性抗體之靶標的若干特性。作為僅在如懷孕這樣的特別時期才在人體中出現的細胞譜系分化抗原，它在健康的毒性相關組織中不存在，如同自身抗原可能的情形一樣。它在多種腫瘤實體中的高普遍性使眾多患者可以採用 GT468靶向療法來治療。例如在乳腺癌的情形中，82%的患者攜帶該靶標。相反地，赫賽汀的靶標Her2/neu (唯一可用於治療這種癌症類型的mAb)僅在20-25%的乳腺癌患者中過表達(Slamon, D. J. , Godolphin, W. , Jones, L. A. , Holt, J. A. , Wong, S. G. , Keith, D. Ε. , Levin, W. J. , Stuart, S. G. , Udove, J. , Ullrich, A.等(1989) Science 244,707-712)。對於 GT468 分別在42%和58%的病例中表達的肺癌和胃癌來說，由於這些癌症類型缺少合適的靶標， 到目前為止尚無經批准的mAb療法。可將針對活細胞上GT468之抗體用於開發成藥物，這種抗體可表現出抗腫瘤效果例如增殖抑制。GT468不僅參與增殖，而且還參與細胞的運動、遷移和侵入。最令人感興趣的是，所有這些屬性不僅充分造就了腫瘤表型，而且還是人滋養層細胞的固有特性，所述滋養層細胞的生理特徵是生長快速並且有效侵入子宮組織。預期可對GT468的mAb進行改造， 使其以最大潛力地迅速介入所有這些作用來介導免疫效應功能(例如ADCC和⑶C)。發明概述本發明一般地提供可用作治療和/或預防與表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之疾病的抗體，所述疾病包括腫瘤相關疾病例如癌症，尤其是乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，所述癌症疾病是肺中的轉移癌。一方面，本發明涉及能夠與GT468結合的抗體。本文所述的抗體優選地是分離的單克隆抗體，所述抗體特異性地與GT468上存在的表位結合，優選地與GT468的細胞外結構域中的表位結合，更優選地與SEQ ID NO :3-10和35-82結合。優選地，所述抗體能夠與位於細胞表面的GT468結合，優選地與位於GT468細胞外結構域的一個或多個表位(優選地在GT468的23-212位胺基酸殘基中)結合，最優選地與位於SEQ ID NO 3-10和35-82胺基酸序列之一中的表位結合。在一個優選的實施方案中，所述抗體對SEQ ID NO :3-10和 35-82胺基酸序列之一個或多個具有特異性。在多個實施方案中，所述抗體能夠結合包含SEQ ID NO :2的四至119位胺基酸的肽，優選四至212位胺基酸，更優選23至212位胺基酸。本發明所包括的單克隆抗體包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗體。在一個實施方案中，抗體是IgGl抗體，更尤其是IgGl、κ同種型或IgGl、X同種型。在另一個實施方案中，抗體是IgG3抗體，更尤其是IgG3、κ同種型或IgG3、X同種型。在又一個實施方案中，抗體是IgG4抗體，更尤其是IgG4、κ同種型或IgG4、X同種型。還在另一個實施方案中，抗體是IgAl或IgA2抗體。還在另一個實施方案中，抗體是IgM抗體。在一個實施方案中，本發明的抗體結合一種或多種根據SEQ ID NO :75-79的肽。 在一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 75的肽和/或根據SEQ ID N0:76的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 75的肽和根據SEQ ID NO :76的肽。在另一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 77的肽和/或根據SEQ ID NO 78的肽和/或根據SEQ ID NO 79的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 78的肽和根據SEQ ID NO :79的肽，或結合根據SEQ ID NO 77的肽、根據SEQ ID NO 78的肽和根據SEQ ID NO 79的肽。在一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :4的肽或根據SEQ ID N0:80的肽進行免疫，獲得本發明的抗體。在另一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :6的肽或根據SEQ ID NO=Sl的肽進行免疫，獲得本發明的抗體。優選地，本發明的抗體結合一種或多種所述肽。在又一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :4的肽或根據SEQ ID N0:80的肽進行免疫，獲得下述抗體，所述抗體結合根據SEQ ID NO 75的肽和/或根據SEQ ID NO 76的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 75的肽和根據SEQ ID NO 76的肽。在另一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :6的肽或根據SEQ ID NO :81的肽進行免疫，獲得下述抗體，所述抗體結合根據SEQ ID NO 77的肽和/或根據SEQ ID NO 78的肽和/或根據SEQ ID NO 79 的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 78的肽和根據SEQ ID NO 79的肽或結合根據SEQ ID NO 77的肽、根據SEQ ID NO 78的肽和根據SEQ ID NO 79的肽。在一個實施方案中，本發明的抗體結合一種或多種根據SEQ ID NO :61-66的肽。 在一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID N0:61的肽和/或根據SEQ ID NO 62的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 61的肽和根據SEQ ID NO 62的肽。在另一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 64的肽和/或根據SEQ ID NO 65的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO :64的肽和根據SEQ ID NO :65的肽。在另一實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 65 的肽和/或根據SEQ ID NO 66的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 65的肽和根據SEQ ID NO 66的肽。在一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :82的肽進行免疫，獲得本發明的抗體。 優選地，本發明的抗體結合所述肽。根據SEQ ID NO :82的肽具有C-端GS-連接子，所述連接子被添加以幫助肽的1和16位胺基酸之間二硫鍵的形成。推測所述肽與GT468的天然構象相似。由使用SEQ ID N0:82的肽進行免疫獲得的雜交瘤51-1A-1所生產的抗體對表達GT468的癌細胞的增殖和集落形成顯示強抑制活性。在又一個實施方案中，使用根據SEQ ID NO :82的肽進行免疫，獲得下述抗體，所述抗體結合根據SEQ ID NO 64的肽和/或根據SEQ ID NO :65的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 64的肽和根據SEQ ID NO 65的肽，或者所述抗體結合根據SEQ ID NO 65的肽和/ 或根據SEQ ID NO :66的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO :65的肽和根據SEQ ID NO :66的肽。在一個實施方案中，本發明的抗體結合一種或多種根據SEQ ID N0:57_60的肽。在一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 57的肽和/或根據SEQ ID NO 58的肽和/或根據SEQ ID NO :59的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 57的肽和根據SEQ ID NO :58的肽和根據SEQ ID NO 59的肽。在另一個實施方案中，抗體結合根據SEQ ID NO 59的肽和 /或根據SEQ ID NO 60的肽，更優選地結合根據SEQ ID NO 59的肽和根據SEQ ID NO 60 的肽。優選地，本發明的抗體與癌細胞結合，尤其是本文所述之癌症類型的細胞，優選不與非癌細胞顯著結合，更優選地不與除胎盤細胞和睪丸細胞之外的非癌細胞顯著結合。優選地，所述抗體與表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(例如癌細胞)的結合介導殺死所述細胞和/或抑制該細胞的一種或多種活性(例如運動、遷移、侵入、增殖和集落形成)。優選地，抗體抑制所述細胞的增殖和/或集落形成。本發明的抗體殺死細胞和/或抑制細胞的一種或多種活性(尤其是細胞增殖和/ 或集落形成)優選地通過該抗體與所述細胞表達的GT468結合和/或與所述細胞的細胞表面相互作用來誘導。這樣殺死細胞和/或抑制細胞的一種或多種活性可用於本文所述的治療中。具體而言，殺死細胞和/或抑制細胞增殖和/或抑制細胞集落形成可用於治療或預防癌症，包括癌症轉移。抑制細胞的運動、遷移、侵入、增殖和/或集落形成可尤其用於治療或預防癌症轉移和癌細胞轉移性傳播。優選地，所述表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞是癌細胞，尤其選自以下癌症疾病的致瘤性癌細胞乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中， 所述癌症疾病是肺中的轉移癌。本發明的抗體可附著至一種或多種治療效應物部分(therapeutic effector moieties)，例如放射性標籤、細胞毒素、治療性酶、誘導凋亡的試劑等等，從而提供定向的細胞毒性，即殺死腫瘤細胞。優選地，本發明的抗體通過誘導補體依賴性細胞毒作用(CDC)介導的裂解、抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)介導的裂解、細胞凋亡、同質性粘附(homotypic adhesion)和/ 或吞噬作用(優選地通過誘導CDC介導的裂解和/或ADCC介導的裂解)來殺死細胞。然而，本發明還包括下述實施方案，其中抗體發揮其如本文所述的活性，如殺死細胞和/或抑制細胞的一種或多種活性，例如細胞增殖和/或集落形成，而不誘導補體依賴性細胞毒性 (CDC)介導的裂解、抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)介導的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用。例如，本發明的抗體也可簡單地通過與細胞表面上的GT468結合而發揮作用，從而例如阻斷細胞的增殖。在一個實施方案中，本發明的抗體不誘導CDC介導的細胞裂解。優選地，ADCC介導的細胞裂解在效應細胞(在一些具體實施方案中選自單核細胞 (monocyte)、單個核細胞(mononuclear cell)、NK細胞和PMN)存在時發生，而吞噬作用由巨噬細胞實現。在一個尤其優選的實施方案中，本發明的抗體具有抑制或降低表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(優選癌細胞如乳腺癌細胞)增殖的活性。可以在使用溴脫氧尿苷(5-溴-2-脫氧尿苷，BrdU)的實驗中，通過測定表達GT468的癌細胞的增殖來體外測量這一活性。BrdU是合成的核苷，其為胸苷的類似物並且可以在DNA複製期間代替胸苷，摻入正在複製的細胞(細胞周期的S期)新合成的DNA中。使用例如對BrdU 具有特異性的抗體檢測所摻入的化學品，這指示了活躍地複製其DNA的細胞。可以使用細胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 作為表達 GT468 的癌細胞。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體抑制或降低細胞系SK-BR-3、MCF-7和 MDA-MB-468中一種或多種的增殖，優選地抑制或降低細胞系SK-BR-3和MCF-7 二者的增殖，最優選地抑制或降低SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-468全部細胞系的增殖。在這一方面中優選的本發明抗體選自⑴由雜交瘤:35-48B-l、35-50A-^i、38-10B-l、38-lA-l、45-2A-l、 45-8Α-2、48-3Β-1、48-4Α-1、49-3Α-1、51-1Α-1、53-13Α-2、53-29Α1、56-4Α-2、62-9Β-1、 78H11 1H6和44-3A-2生產的抗體和/或可得自它們的抗體，(ii)屬於⑴所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，和(iii)具有(i)所述抗體之特異性的抗體，尤其是包含(i)所述抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(尤其是可變區)的抗體。在這一方面中，尤其優選的本發明抗體選自(i)由雜交瘤35-48Β-1、48-;3Β-1、51-1Α-1和56-4A-2生產的抗體和/ 或可得自它們的抗體，(ii)屬於⑴所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，和(iii)具有 (i)所述抗體的特異性的抗體，尤其是包含(i)所述抗體的抗原結合部分或抗原結合位點 (尤其是可變區)的抗體。在一個尤其優選的實施方案中，本發明的抗體具有抑制或減少表達GT468和/ 或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(優選癌細胞如乳腺癌細胞)的集落形成的活性。可以在克隆形成實驗(clonogenic assay)中體外測量該活性。可以使用細胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 作為表達 GT-468 的癌細胞。克隆形成實驗是一種研究特定試劑對細胞存活和增殖的效力的微生物學技術。其常常在癌症研究實驗室中用於測定藥物或輻射對正在增殖的腫瘤細胞的影響。該實驗包括三個主要的步驟(i)對細胞(尤其是癌細胞)樣品進行處理，(ii)將細胞置於組織培養容器中，和(iii)允許細胞生長。將產生的集落固定、染色並計數。如果個體腫瘤細胞在器官中定殖，則集落形成對轉移的形成而言是重要的。抗體的抑制活性表明它們阻抑轉移形成的潛力。在克隆形成實驗中具有抑制或減少集落形成之活性的抗體尤其適用於治療或預防癌細胞(尤其是本文提到的癌症類型)的轉移和轉移性傳播。在這一方面中優選的本發明抗體選自下組⑴由雜交瘤 51G6 2H3 2B4、78H11 1H6、16-5B-1、22-1A-1、29-8B_1 和 51-1A-1產生的抗體和/或可得自它們的抗體，(ii)屬於(i)所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，和(iii)具有(i)所述抗體之特異性的抗體，尤其是包含(i)中抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(尤其是可變區)的抗體。在這一方面中，尤其優選的本發明的抗體選自下組⑴由雜交瘤51G6 2H3 2B4、29-8B-1和51-1A-1生產的抗體和/或可得自它們的抗體，(ii)屬於(i)所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，和(iii)具有(i)所述抗體之特異性的抗體，尤其是包含(i)中抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(尤其是可變區) 的抗體。在一個尤其優選的實施方案中，本發明的抗體具有抑制或減少表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的增殖的活性，並且具有抑制或減少表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的集落形成的活性。在這一方面中優選的本發明抗體選自下組⑴由雜交瘤51-1A-1產生的抗體和/或可得自它們的抗體，(ii)屬於(i)所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，和(iii)具有(i)所述抗體之特異性的抗體， 尤其是包含(i)所述抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(尤其是可變區)的抗體。在一個實施方案中，本發明涉及下述抗體，所述抗體(i)結合表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞，和(ii)不結合不表達GT468和/或特徵不在於其細胞表面與GT468締合之細胞。本發明的抗體優選地(i)介導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的殺死和/或抑制其增殖，和(ii)不介導不表達GT468和 /或特徵不在於其細胞表面與GT468締合之細胞的殺死和/或不抑制其增殖。本發明的抗體可以是單克隆、嵌合的、人的或人源化的抗體或抗體片段，其可選自 IgGU IgG2(優選 IgG2a 和 IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌型 IgA、IgD 和 IgE 抗體。本發明的抗體包括全人抗體。此類抗體可以在下述非人轉基因動物(例如轉基因小鼠)中生產，所述非人轉基因動物能夠通過發生V-D-J重組和同種型轉換而生產GT468 的人單克隆抗體的多種同種型。此類轉基因動物也可以是生產多克隆抗體的轉基因兔，如 US 2003/00175:34 所公開。本發明的抗體與GT468抗原的結合可以例如通過活化補體系統來介導表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(例如腫瘤細胞)的殺死，和/或可抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(例如腫瘤細胞)的增殖。或者或除介導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的殺死和/或抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的增殖之外，本發明的抗體與 GT468抗原的結合可抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞(例如腫瘤細胞)的運動、遷移、集落形成和/或侵襲，並且因此可抑制腫瘤細胞的轉移性傳播。 表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的殺死可以通過一種或多種以下機制發生表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的補體依賴性細胞毒性(⑶C)；表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的凋亡；表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的效應細胞吞噬作用；或表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的效應細胞抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。根據本發明的所有方面，GT468優選為人GT468，優選地具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列，更優選地具有SEQ ID NO :2胺基酸序列之細胞外結構域的胺基酸序列，特別是具有涵蓋SEQ ID NO :2之23至212位胺基酸的胺基酸序列。在一些特別優選的實施方案中，本發明的抗體與活細胞表面上存在的GT468的天然表位(例如SEQ ID NO :3-10和35-82所示的)結合。在一些更優選的實施方案中，本發明的抗體對癌細胞(優選乳腺癌細胞)具有特異性。優選地，本發明的抗體對表達GT-468 的癌細胞如細胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 是特異性的，並且不結合不表達GT468的癌細胞如NUG-C4胃癌細胞。在本發明的一些實施方案中，GT468表達在細胞表面上和/或與細胞表面相關。可通過包括以下步驟的方法來獲得本發明的抗體用含有選自SEQ ID NO 2-10 和35-82之胺基酸序列的蛋白質或肽或者其免疫原性片段或衍生物、或表達所述蛋白質或肽或者其免疫原性片段或衍生物的核酸或宿主細胞來免疫動物。優選地，本發明的抗體對以上提及的蛋白質、肽或其免疫原性片段或衍生物具有特異性。對於用於免疫的蛋白質或肽來說，衍生物涉及這些蛋白質或肽的變體，所述變體具有與衍生出其的蛋白質或肽同樣的免疫原性。特別地，當用於免疫產生抗體(特別是單克隆抗體)時，蛋白質或肽的衍生物提供了與使用蛋白質或肽進行免疫時所獲得抗體具有同樣特異性的抗體。例如，這樣的衍生物可包括一個或多個胺基酸的缺失、替換或添加。特別地，它可包括一個或多個胺基酸的添加，例如在N-端或C-端或兩者處添加半胱氨酸。在一個特別優選的實施方案中，本發明的抗體由具有如下登記號的克隆產生DSM ACC2822(4E9-1H9)、DSM ACC2826 (9B6-2A9)、DSM ACC2824 (59D6-2F2)、 DSM ACC2825 (61C11-2B5)、DSM ACC2823 (78H11-1H6)、DSM ACC2895 (22-1A-1)、 DSM ACC2893 (22-2A-1)、DSM ACC2896 (22-9B-1)、DSM ACC2897 (23-33A-1)、DSM ACC2891(23-19A-1)、 DSM ACC2894(F11#33F7D12)、 DSM ACC2892(4A12 2D4 1A10)、 DSM ACC2898(4E9 1D12 2D4)、DSM ACC2961 (42H11 ICll 2B2)、DSM ACC2962(51G6 2H3 2B4)、DSM ACC2943 (16-5B-1)、DSM ACC2956 (20-11A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2)、 DSM ACC2964(29-8B-1)、DSM ACC2959 (35-48B-1)、DSM ACC2963 (35_50A_2a)、 DSM ACC2957(38-10B-1)、 DSM ACC2958(38-1A-1)、 DSM ACC2948 (44-3A-2)、 DSM ACC2949 (45-2A-1)、DSM ACC2950 (45-8A-2)、DSM ACC2951 (48-3B-1)、 DSM ACC2952(48-4A-1)、 DSM ACC2946(49-3A-1)、 DSM ACC2945(49-8A-1)、 DSM ACC2944(51-1A-1)、DSM ACC2953 (53-13A-2)、DSM ACC2955 (53-29A-1)、DSM ACC2960(54-4B-2)、DSM ACC2954(56-4A-2)或 DSM ACC3001(62-9B-1)。在一個實施方案中，本發明的抗體與治療劑(如毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑)偶聯。另一方面，本發明涉及能產生本發明抗體的雜交瘤。優選的雜交瘤具有如下登記號DSM ACC2822(4E9-1H9)、DSM ACC2826(9B6-2A9)、DSM ACC2824 (59D6-2F2)、 DSM ACC2825 (61C11-2B5)、DSM ACC2823 (78H11-1H6)、DSM ACC2895 (22-1A-1)、 DSM ACC2893(22-2A-1)、 DSM ACC2896(22-9B-1)、 DSM ACC2897(23-33A-1)、 DSM ACC2891 (23-19A-1)、DSM ACC2894 (F11#33F7D12)、DSM ACC2892(4A12 2D4 1A10)、 DSM ACC2898(4E9 1D12 2D4)、DSM ACC2961 (42H11 ICll 2B2)、DSM ACC2962(51G6 2H3 2B4)、DSM ACC2943 (16-5B-1)、DSMACC2956 (20-11A-1)、DSM ACC2947 (29-1A-2)、
DSMACC2964(29--8B-1)、DSM ACC2959 (35-48B-1)、DSM ACC2963(35-50A-2a)、DSMACC2957 (38--10B-1)、DSM ACC2958 (38-1A-1)、DSM ACC2948 (44--3A-2)、DSMACC2949 (45-2A-1)、DSM ACC2950 (45-8A--2)、DSM ACC2951 (48-3B-i)、DSMACC2952 (48-4A-1)、DSM ACC2946 (49-3A--i)、DSM ACC2945 (49--8A-1)、DSMACC2944(51-1A-1)、DSM ACC2953 (53-13A-2)、DSM ACC2955(53-29A-1)、DSM
ACC2960(54-4B-2), DSM ACC2954(56-4A-2)或 DSM ACC3001(62-9B-1)。本文通過引用抗體名稱和/或引用產生該抗體的克隆(如4E9-1H9)來指明本發明的抗體。優選地，本發明的抗體能夠區分由不同細胞類型(包括癌細胞和非惡性細胞)表達的GT468變體。本發明的抗體優選地介導殺死表達GT468和/或特徵在於其細胞表面通過與GT468結合而與GT468締合的細胞。優選地，GT468在所述細胞表面上表達。在一個實施方案中，本發明的抗體誘導補體依賴性細胞毒作用(CDC)，例如表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞至少約20 40%的⑶C介導之裂解，優選地約40 50% 的⑶C介導之裂解，更優選地大於50%的⑶C介導之裂解。作為誘導⑶C的替代或補充， 本發明的抗體可在效應細胞(例如單核細胞、單個核細胞、NK細胞和PMN)存在下誘導表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。 本發明的抗體可具有誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞發生凋亡的能力，誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞同質性粘附的能力，和/或在巨噬細胞存在下誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的吞噬。本發明的抗體可具有一種或多種上述功能特性。優選地，本發明的抗體誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的⑶C介導之裂解和ADCC 介導之裂解，更優選地誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的 ADCC介導之裂解而不誘導所述細胞的CDC介導之裂解。針對本發明抗體之靶細胞的實例包括但不限於表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的癌細胞。在一個特別優選的實施方案中，由本發明抗體所介導的殺死細胞是GT468特異性的，即本發明的抗體優選以CDC和/或ADCC介導之裂解的方式介導殺死表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GI~468締合的細胞，但不介導殺死不表達GI~468和/或特徵在於其細胞表面與GI~468不發生締合的細胞。上述抗體可用於在治療或預防癌症中介導殺死腫瘤細胞，所述癌症例如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，所述癌症疾病是肺中的轉移癌。本發明的抗體可源自不同的物種，其包括但不限於小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本發明的抗體還包括嵌合分子，其中源自某一物種(優選人)的抗體恆定區與源自另一物種的抗原結合位點相組合。此外，本發明的抗體包括人源化分子，其中源自非人物種之抗體的抗原結合位點與人源的恆定區和框架區相組合。本發明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體，其中包括IgGh(如IgG2a，κ，λ )、 IgG2b (如IgG2b，κ，X)、IgG3(如IgG3，κ , λ)和IgM抗體。然而，本發明還涵蓋了另一些抗體同種型(isotype)，包括IgGU IgAU IgA2、分泌型IgA, IgD和IgE抗體。所述抗體可以是完整抗體或其抗原結合片段，包括例如Fab、F(ab』)2、Fv、單鏈Fv片段或雙特異性抗體。此外，所述抗原結合片段包括結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)與免疫球蛋白鉸鏈區多肽融合的結合結構域多肽(例如重鏈可變區或輕鏈可變區)，( )與所述鉸鏈區融合的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區，以及(iii)與所述CH2恆定區融合的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。這樣的結合結構域免疫球蛋白融合蛋白還進一步公開於US2003/0118592 和 US2003/0133939 中。優選地，本發明的抗體與GT468解離的解離平衡常數(kD)約為1 IOOnM或更低。 優選地，本發明的抗體不與相關細胞表面抗原發生交叉反應，並因此不抑制其功能。在一些優選的實施方案中，本發明的抗體可通過如下一個或多個屬性來表徵a)對GT468具有特異性；b)與GT468的結合親合力約為IOOnM或更低，優選地約5 IOnM或更低，更優選地約1 3nM或更低；c)能夠對⑶55/59陰性細胞或⑶55/59陽性細胞介導高水平的⑶C ；d)能夠抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的生長；e)能夠誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞發生細胞
凋亡；f)能夠誘導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞發生同質性粘附；g)能夠在效應細胞存在下誘導表達GI~468和/或特徵在於其細胞表面與GI~468締合之細胞發生ADCC ；h)能夠延長具有表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的腫瘤細胞的患者存活；i)能夠清除表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞；j)能夠清除低水平表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞； 和/或k)能夠使GT468聚集在活細胞表面上。本發明的抗GT468抗體可以衍生成、連接至或共表達有另一些結合特異性。在一個具體的實施方案中，本發明提供了雙特異性或多特異性分子，其包含至少一種針對GT468 的第一結合特異性(例如，抗GT468抗體或其模擬物)以及針對效應細胞的第二結合特異性(例如針對Fc受體(如Fc- γ受體，例如Fc- y RI，或任何其它Fc受體)或T細胞受體 (如CD3)的結合特異性)。因此，本發明包含與GT468以及Fc受體或T細胞受體(如⑶3)結合的雙特異性或多特異性分子。Fc受體的實例包括IgG受體、Fc- γ受體(Fe y R)(例如Fc y RI (CD64)、 FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))。也可以靶向另一些Fc受體，例如IgA受體(如 Fc α RI)。所述Fc受體優選地位於效應細胞(例如，單核細胞、巨噬細胞或活化的單個核細胞)的表面上。在一個優選的實施方案中，所述雙特異性和多特異性分子在有別於受體之免疫球蛋白Fc (例如，IgG或IgA)結合位點的位點處與Fc受體結合。因此，生理水平的免疫球蛋白不會阻斷所述雙特異性和多特異性分子的結合。另一方面，本發明的抗GT468抗體衍生化、連接或共表達有另一功能性分子(例如，另一肽或蛋白質(如Fab』片段))。例如，本發明的抗體可與一個或多個其它分子實體(例如另一抗體(例如用以產生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原 (例如用以產生免疫綴合物，如免疫毒素))進行功能性連接(例如，藉助化學偶聯、基因融合、非共價相互作用等來實現)。本發明的抗體可與另一些治療性部分(例如，放射性同位素、小分子抗癌藥物、重組細胞因子或趨化因子)結合。因此，本發明涵蓋了多種抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子以及融合蛋白，所有這些均與表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞集合併且均可用於將另一些分子靶向這些細胞。通常，就本發明的目的而言，本文所述的所有抗體衍生物如抗體綴合物、雙特異性和多特異性分子和融合蛋白都被術語「抗體」包括在內。另一方面，本發明還囊括了源自非免疫球蛋白結構域的GT468結合蛋白質，尤其是單鏈蛋白質。這種結合蛋白質及其產生方法描述於例如Binz等，OOOONatureBiotechnology 23(10) :1257_1沈8，其通過引用併入本文。應當理解，本文有關免疫球蛋白或源自免疫球蛋白之結合分子的教導也相應地適用於源自非免疫球蛋白結構域的結合分子。特別地，使用這種源自非免疫球蛋白結構域的結合分子有可能阻斷表達GT468靶標和 /或特徵在於其細胞表面與GT468靶標締合之細胞中的GT468，並因此產生本文所述的本發明抗體之治療效果，特別是抑制本文所公開的一種或多種腫瘤細胞活性(例如增殖)。通過例如與抗體的Fc區融合，有可能向這些非免疫球蛋白結合分子賦予抗體的效應分子功能， 儘管這並非強制性的。本發明通常包括通過靶向由細胞表達的GT468和/或與細胞表面締合的GT468來治療和/或診斷疾病，尤其是腫瘤疾病。這些方法提供了此類細胞的選擇性檢測和/或消除，從而使對不表達GT468和/或特徵不在於其細胞表面與GT468締合之正常細胞的不利影響儘可能小。治療或診斷的優選疾病是其中涉及表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的的疾病，如腫瘤疾病，尤其是癌症疾病，如本文所述的癌症疾病。一方面，本發明提供了組合物(例如，藥物和診斷組合物/試劑盒)，其包含本發明的抗體或抗體組合。本發明的藥物組合物可包含可藥用載體，並可任選地包含一種或多種佐劑、穩定劑等。在一個具體實施方案中，所述組合物包含與不同表位結合或具有獨特功能特徵(例如誘導CDC和/或ADCC以及誘導細胞凋亡)之抗體的組合。在本發明的該實施方案中，抗體可組合使用，例如作為包含兩種或更多種抗GT468單克隆抗體的藥物組合物。例如，可在單一治療中將具有不同但互補之活性的抗GT468抗體進行組合以實現期望的治療效果。在一個優選的實施方案中，所述組合物包含與另一誘導細胞凋亡之抗GT468抗體聯用的介導⑶C之抗GT468抗體。在另一實施方案中，所述組合物包含與另一抑制表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞生長的抗GT468抗體聯用的在效應細胞存在下介導高效殺死靶細胞的抗GT468抗體。本發明還包括同時或依序施用兩種或更多種本發明抗GT468抗體，其中優選地至少一種所述抗體是抗GT468嵌合抗體，以及至少一種另外的抗體是人抗GT468抗體，所述抗體與GT468的相同或不同表位結合。優選地，首先施用本發明的嵌合GT468抗體，然後施用本發明的人抗GT468抗體，其中所述人抗GT468抗體優選長期施用(即維持治療)。本發明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子以及組合物可用於多種抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的生長和/或選擇性殺死表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞(其通過使有效量的所述抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物與所述細胞接觸來實現)的方法中，從而抑制該細胞的生長和/或殺死該細胞。在一個實施方案中，所述方法包括殺死表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞，任選地在效應細胞存在的情況下，例如通過CDC、細胞凋亡、ADCC、吞噬或通過兩個或更多個上述機制的組合來實現。可使用本發明抗體抑制或殺死的表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞包括癌細胞。本發明的抗體、綴合物和雙特異性/多特異性分子和組合物可用於治療和/或預防多種疾病，所述疾病涉及表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞， 其通過向患有這些疾病的患者施用所述抗體來實現。可治療(例如，緩解)或預防的疾病實例包括但不限於致瘤性疾病。可治療和/或預防的致瘤性疾病實例包括癌症疾病如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，癌症疾病是肺中的轉移癌。本發明一方面涉及抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的選自運動、遷移、侵襲、生長(增殖)和集落形成的一種或多種活性(優選生長和/或集落形成)的方法，該方法包括使所述細胞與有效量的本發明抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物接觸。優選地，GT468表達在所述細胞的表面上。另一方面，本發明涉及治療或預防表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468 締合之細胞所參與的疾病或病症的方法，該方法包括向對象施用本發明的抗體、綴合物、雙特異性/多特異性分子或組合物。優選地，所述疾病或病症是腫瘤相關的疾病，在一些具體的實施方案中選自乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸癌、 腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，腫瘤是肺中的轉移癌。優選地，GT468在所述細胞的表面上表達。本發明可涉及本文所述試劑和組合物用於對腫瘤疾病進行預防性和/或治療性處理的用途，即用於治療患有腫瘤疾病或有發生腫瘤疾病之風險的患者的用途。在一個方面中，本發明提供了抑制腫瘤生長的方法，所述方法包括施用本文所述的一種或多種試劑和組合物。優選地，本文所述的試劑和組合物以下述方式被施用，所述方式使得當組織或器官中沒有顯著表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的腫瘤時(如胎盤組織和/或睪丸組織)，則治療活性物質不被遞送或不被顯著遞送至該組織或器官。為此，可以局部施用本文所述的試劑和組合物。在一個方面中，本發明提供了用於本文所述治療方法中的本文所述抗體。在一個實施方案中，本發明提供了用於本文所述治療方法中的本文所述藥物組合物。在本發明的一個具體實施方案中，還使用化療藥劑、輻射或者調節(例如增強或抑制)Fc受體(例如Fc-γ受體)之表達或活性的藥劑(例如細胞因子)對施用所述抗體的對象進行治療。在治療期間施用的典型細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素-γ (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。 典型治療劑包括抗腫瘤藥劑，例如阿黴素、順鉬、多西他賽(taXOtere)、5-氟尿嘧啶 (5-fluoruracil)、氨甲蝶呤(methotrexat)、吉西他濱(gemzitabin)和環磷醯胺等。另一方面，本發明涉及使用人GT468或其肽段免疫非人動物(如小鼠)以獲得抗體的免疫策略。用於免疫的優選肽選自SEQ ID NO :2-10和35-82的肽或其衍生物。因此， 在一些優選的實施方案中，本發明的抗體是由使用選自SEQ ID NO :2-10和35-82的肽或其衍生物進行免疫而獲得的抗體。類似地，可以在轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)中產生針對GT468的抗體。所述轉基因非人動物可以是具有包含重鏈轉基因和輕鏈轉基因之基因組的轉基因小鼠，所述重鏈轉基因和輕鏈轉基因編碼抗體的全部或一部分。可以用經純化或經富集的GT468抗原和/或表達GT468或其肽段的核酸和/或細胞製備物來免疫野生型以及轉基因非人動物。優選地，所述非人動物能夠通過進行V-D-J 重排和同種型轉換(isotype switching)來產生針對GT468之人單克隆抗體的多種同種型 (例如，IgG.IgA和/或IgM)。同種型轉換可通過例如經典或非經典的同種型轉換而發生。
因此，在另一方面，本發明提供了從上述非人動物分離的B細胞。然後，可通過與永生化細胞融合使所述經分離的B細胞永生化，從而提供本發明抗體的來源(例如，雜交瘤)。這種雜交瘤(其產生本發明的抗體)也涵蓋在本發明的範圍內。在又一個方面中，本發明涉及用於診斷、檢測或監測腫瘤疾病的方法，所述方法包括通過使用本發明抗體在分離自患者的生物樣品中檢測和/或測定GR468或表達GT468和 /或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的量。生物樣品可分離自患有腫瘤疾病、疑似患有腫瘤疾病或有可能發生腫瘤疾病的患者。在本發明診斷、檢測或監測腫瘤疾病的方法的一個實施方案中，生物樣品和/或對照/參照樣品來自對應於要診斷、檢測或監測腫瘤疾病病變的組織或器官的組織或器官，例如要診斷、檢測或監測的腫瘤疾病是乳腺癌，則生物樣品和/或對照/參照樣品是乳腺組織。此類組織和器官如本文所述，例如與不同的腫瘤疾病和癌症相關聯。在診斷、檢測或監測腫瘤疾病的方法的一個實施方案中，生物樣品來自於下述組織或器官，其中當組織或器官沒有腫瘤時細胞不顯著表達GT468和/或特徵不在於其細胞表面與GT468實質性締合。優選地，所述組織是除胎盤組織或睪丸組織之外的組織。通常，將生物樣品中靶分子的水平與參照水平比較，其中與所述參照水平的偏差指示了對象中腫瘤疾病的存在和/或階段。參照水平可以是在(例如來自健康組織或對象的)對照樣品中測定的水平，或是來自健康對象的中值水平。與所述參照水平的「偏差」是指任何顯著的改變，如提高或降低至少10 %、20 %或30 %，優選地至少40 %或50 %，或甚至更多。優選地，所述生物樣品中GT468或表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468 締合之細胞的存在，或與參照水平相比生物樣品中GT468或表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的量的提高指示腫瘤疾病的存在。通常，本發明方法中定量的檢測和/或測定涉及使用特異性結合靶分子的標記抗體。在一個具體的方面中，本發明涉及用於對腫瘤疾病進行檢測(例如確定位置或部位，例如特定組織或器官)的方法，包括對患者施用與檢測標記偶聯的本發明抗體。所述患者中組織或器官的標記可指出所述組織或器官中腫瘤疾病的存在或風險。如本文所列舉地，本發明的抗體可直接從表達所述抗體的雜交瘤獲得，或者可以在宿主細胞(如CHO細胞或淋巴細胞)中克隆以及重組表達。宿主細胞的另一些實例包括微生物(例如大腸桿菌)和真菌(例如酵母)。或者，它們可以在轉基因非人動物或植物中重組產生。然而，本發明還包括下述實施方案，其中使用本文公開的免疫策略，通過免疫或疫苗接種在患者中原位生產抗體。產生本發明抗體的優選雜交瘤細胞是保藏在DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany)、具有下列名稱和登記號的雜交瘤細胞1. 4E9-1H9，登記號 DSM ACC2822，於 2007 年 3 月 13 日保藏2. 9B6-2A9，登記號 DSM ACC2826，於 2007 年 3 月 13 日保藏3. 59D6-2F2，登記號 DSM ACC2824，於 2007 年 3 月 13 日保藏4. 61C11-2B5，登記號 DSM ACC2825，於 2007 年 3 月 13 日保藏5. 78H11-1H6，登記號 DSM ACC2823，於 2007 年 3 月 13 日保藏6. 22-1A-1，登記號 DSM ACC2895，於 2008 年 3 月 11 日保藏0094]7. 22-2A-1，登記號 DSM ACC2893，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0095]8. 22-9B-1，登記號 DSM ACC2896，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0096]9. 23-33A-1，登記號 DSM ACC2897，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0097]10. 23-19A-1，登記號 DSM ACC2891，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0098]11. F11#33F7D12，登記號 DSM ACC2894，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0099]12.4A12 2D4 1A10，登記號 DSM ACC2892，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0100]13. 4E9 1D12 2D4，登記號 DSM ACC2898，於 2008 年 3 月 11 日保藏
0101]14. 42H11 ICll 2B2，登記號 DSM ACC2961，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0102]15. 51G6 2H3 2B4，登記號 DSM AC(^962，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0103]16. 16-5B-1，登記號 DSM AC(^943，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0104]17. 20-1IA-I，登記號 DSM ACC2956，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0105]18. ^-1Α-2，登記號 DSM AC(^947，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0106]19. 29-8B-1，登記號 DSM ACC2964，於 2008 年 9 月 2 日保藏
0107]20. 35-48B-1，登記號 DSM ACC2959，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0108]21. 35-50A-2a，登記號 DSM ACC2963，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0109]22. 38-10B-1，登記號 DSM ACC2957，於 2008 年 9 月 1 日保藏23.38--IA--1登記號DSMACC2958，於 2008 年 9 月 1日保
24.44--3A--2登記號DSMACC2948，於 2008 年 9 月 1日保
25.45--2k--1登記號DSMACC2949，於 2008 年 9 月 1日保
26.45--8A--2登記號DSMACC2950，於 2008 年 9 月 1日保
27.48--3B--1登記號DSMACC2951，於 2008 年 9 月 1日保
28.48--4A--1登記號DSMACC2952，於 2008 年 9 月 1日保
29.49--3A--1登記號DSMACC2946，於 2008 年 9 月 1日保
30.49--8A--1登記號DSMACC2945，於 2008 年 9 月 1日保
31.51--IA--1登記號DSMACC2944，於 2008 年 9 月 1日保
0119]32. 53-13A-2，登記號 DSM ACC2953，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0120]33. 53-29A-1，登記號 DSM ACC2955，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0121]34. 54-4B-2，登記號 DSM ACC2960，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0122]35. 56-4A-2，登記號 DSM ACC2954，於 2008 年 9 月 1 日保藏
0123]36. 62-9B-1，登記號 DSM ACC3001，於 2009 年 7 月 16 日保藏
0124]本發明的優選抗體是由上述雜交瘤產生或可從中獲得的抗體及其嵌合的和人源化的形式。本發明的另一些優選抗體是具有由上述雜交瘤產生或可從中獲得之抗體的特異生的抗體，尤其是包含由上述雜交瘤產生或可從中獲得之抗體的抗原結合部分或抗原結合位點(特別是可變區)的抗體。
0125]在一些優選的實施方案中，抗體(特別是嵌合形式的本發明抗體)包括含有重鏈宜定區(CH)的抗體，所述重鏈恆定區包含源自人重鏈恆定區(例如SEQ ID而17或對所示胺基酸序列或其片段)的胺基酸序列。在另一些優選的實施方案中，抗體(特別是嵌合形式的本發明抗體)包括含有輕鏈恆定區(CL)的抗體，所述輕鏈恆定區包含源自人輕鏈恆定區(例如SEQ ID NO: 18或22所示胺基酸序列或其片段)的胺基酸序列。在一個特別優選的實施方案中，抗體(特別是嵌合形式的本發明抗體)包括含有CH並且含有CL的抗體， 所述CH包含源自人CH (例如SEQ ID NO 17或M所示胺基酸序列或其片段)的胺基酸序列，所述CL包含源自人CL (例如SEQ ID NO 18或22所示胺基酸序列或其片段)的胺基酸序列。包含SEQ ID NO 17所示胺基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO 20所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO 24所示胺基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO 23所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO 18所示胺基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO 19所示核酸序列的核酸編碼。包含SEQ ID NO :22所示胺基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO 21 所示核酸序列的核酸編碼。上文中使用的「片段」或「胺基酸序列片段」涉及抗體序列的一部分，即表示所述抗體序列在N端和/或C端縮短的序列，當它取代所述抗體時，抗體中的序列保留了所述抗體與GT468結合以及優選地本文所述抗體的功能(例如CDC介導的裂解或ADCC介導的裂解)。優選地，片段的胺基酸序列包含來自所述胺基酸序列之至少80%，優選地至少90%、 95%、96%、97(%、98(%或99(%的胺基酸殘基。本文所述片段的胺基酸序列可由編碼所述胺基酸序列的各核酸序列片段所編碼。本發明還涉及包含編碼本文所述抗體或其部分(例如，抗體鏈)之基因或核酸序列的核酸。所述核酸可包含在載體中，所述載體例如質粒、粘粒、病毒、噬菌體或例如在基因工程中常規使用的其它載體。所述載體還可包含基因，例如允許在合適條件下、在合適的宿主細胞中選擇該載體的標記基因。此外，所述載體可包含表達調控元件，其允許所述編碼區在適當的宿主中正確表達。這樣的調控元件是本領域技術人員已知的，並可包括啟動子、剪接盒和翻譯起始密碼子。優選地，本發明的核酸與上述表達調控序列有效連接，以允許在真核或原核細胞中表達。確保在真核或原核細胞中表達的調控元件是本領域技術人員所熟知的。用於構建本發明核酸分子的方法、用於構建包含上述核酸分子之載體的方法、用於將所述載體引入適當選擇的宿主細胞中的方法、用於導致或實現所述表達的方法是本領域中眾所周知的。本發明的另一方面涉及包含本文所述核酸或載體的宿主細胞。根據以下的詳細說明和權利要求，本發明的其它特徵和優點將是顯然的。


圖1. GT468是在癌細胞中異常活化的滋養層細胞譜系標誌物。(A)在正常組織、 原發性乳腺癌樣品和癌細胞系(1，MCF-7 ；2，MDA-MB-435S ；3，BT-549 ；4，MDA-MB-231 ；5， SNU-16 ；6，LCLC-103H ；7，KYSE_510；8，KYSE_30；9，EF0_27 ； 10，T0V_21G ； 11，T0V_112D ； 12， CA0V-3 ；13，EF0-21 ； 14, FU-0V-1 ； 15, LNCAP ；16，CAPAN_2)中進行；35 個循環的終點 RT-PCR。 (B)在正常組織(1，睪丸；2，胎盤；3，腦；4，肺；5，乳房；6，結腸；7，肝；8，胃；9，腎；10，前列腺；11，胰腺；12，卵巢；13，脾；14，皮膚；15，心肌；16，子宮內膜；17，靜息狀態的PBMC ;18， 增殖狀態的PBMC ；19，腎上腺)、原發性乳腺癌樣品和(C)癌細胞系中進行40個循環的定量實時RT-PCR。(D)在MCF-7和BT-549乳腺癌細胞中，siRNA所介導的GT468沉默的定量實時RT-PCR。(E) siRNA所介導GI~468蛋白表達減少的Wfestern印跡分析。對照細胞或者未處理或者用亂序的非沉默雙鏈體(ns-siRNA)進行轉染。(F)人的正常和腫瘤組織中GT468蛋白水平的Western印跡分析。(G)使用GT468特異性抗體，對來自人的正常乳房組織(左) 和乳腺癌(右)的切片進行免疫組化分析。圖2. GT468是細胞表面相關蛋白質。在轉染GT468特異性siRNA(siRNA#l)或非沉默SiRNA(IiS-SiRNA)後使用抗GT468C端抗體對(A)經甲醇固定的和(B)非固定的MCF-7 和BT-549乳腺癌細胞進行染色。圖3. GT468的表達促進乳腺癌細胞的運動、遷移和侵入。(A)利用Transwell遷移測定，在向上層腔室和下層腔室中添加5% FCS 12小時後進行化動性(chemokinesis) (運動性)分析。(B)利用！^^8恥11遷移測定，在僅向下層腔室添加5^^05(從而獲得梯度)12小時後對MCF-7和BT-549進行細胞趨化分析。(C)在向下層腔室添加5% FCS作為化學引誘劑M小時後對趨化侵入Matrigel進行分析。圖4. GT468的表達促進乳腺癌細胞的增殖。(A)利用GT468特異性siRNA雙鏈體啟動敲低72小時後，對MCF-7和BT-549細胞的增殖進行分析。⑶GT468沉默啟動72小時後，對細胞的細胞周期進行分析，顯示為不同細胞周期狀態之細胞百分比的柱狀圖。(C)在用siRNA轉染72小時後，通過膜聯蛋白V染色來測定細胞凋亡。作為膜聯蛋白V染色的陽性對照，用6 μ M喜樹鹼處理細胞12小時。圖5.可利用GT468的功能拮抗性抗體來開發藥物。在與不同量的抗GT468抗體和對照抗體(同種型對照)一起孵育48小時後，對MCF-7和ΒΤ-549細胞進行增殖分析。圖6.細胞周期蛋白Dl和AKT激酶參與GT468的功能。在用GI~468特異性siRNA 雙鏈體處理72小時後對細胞周期蛋白Dl進行(A)實時定量RT-PCR分析和(B)Western印跡分析。在(C)GI~468敲低72小時後或(D)用抗GT468C端抗體處理1小時後對AKT Ser473 磷酸化進行Astern印跡分析。圖7.確定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的肽ELISA。雜交瘤上清液僅與用於免疫的肽反應。圖8.利用含有針對GT468所產生抗體的雜交瘤上清液對轉染有GT468_eGFP構建體的CHO細胞進行染色。該雜交瘤上清液特異性地染色表達GT468-eGFP的細胞。圖9.可利用GT468的功能拮抗性單克隆抗體來開發藥物。對與雜交瘤上清液一起孵育72小時後的不同癌細胞系進行增殖分析。圖10.確定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的(A)粗裂解物 ELISA(CrELISA)或(B)肽特異性ELISA。雜交瘤上清液僅與(A)GT468裂解物或(B)用於免疫的各種肽反應。圖11.確定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的流式細胞分析。所有雜交瘤上清液均顯示對轉染有GT468之細胞的特異性染色，而在模擬轉染的細胞中則未觀察到染色。圖12.確定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的Western印跡。所有雜交瘤上清液均顯示對轉染有GT468 pcDNA3. 1表達質粒之HEK293細胞的裂解物的特異性反應，而模擬轉染細胞的裂解物則未顯示出信號。在模擬轉染裂解物中雜交瘤上清液 23-33A-1的微弱信號是由於HEK GT468裂解物的溢出所致。圖13.鑑定GT468蛋白中抗體結合表位的肽ELISA。雜交瘤上清液22_1A_1、23-33A-1和23-19A-1均顯示與兩種重疊肽結合，這暗示與GT468線性表位的反應。22-2A-1 和22-9B-1的結合模式暗示與GT468蛋白的構象表位(非連續表位)的反應。圖14.可利用GT468的功能拮抗性單克隆抗體來開發藥物。對與經純化雜交瘤上清液一起孵育72小時或120小時後的不同癌細胞系進行增殖分析。圖15.用於測定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的流式細胞術分析。雜交瘤上清液顯示對用GT468116-212位胺基酸轉染的細胞的特異性染色，而對模擬轉染的細胞未觀察到染色。圖16A、B.用於測定單克隆抗體與未固定的內源性表達GT468的腫瘤細胞(MCF-7、 MDA-MB-468和SK-BR-3乳腺癌細胞)特異性結合的流式細胞術分析。使用不表達GT468的 NUG-C4胃癌細胞作為陰性對照。抗體能夠與表達GT468的腫瘤細胞結合。圖17.用於測定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的Western印跡。所有雜交瘤上清液均顯示對用GT468表達質粒轉染的HEK293細胞裂解物的特異反應性，而模擬轉染的細胞的裂解物顯示無信號。圖18. GT468可通過功能拮抗性單克隆抗體而用於製藥。與純化的雜交瘤上清液孵育72小時後不同癌細胞系的增殖分析。圖19.克隆形成實驗，用於分析針對GT468的單克隆抗體對內源表達GT468的 SK-BR-3細胞集落形成的抑制活性。將細胞與抗體一起孵育減少或抑制了集落形成。圖20A-B.使用實時RT-PCR定量正常組織中的GT468表達。針對每種正常組織類型測試來自三個個體的組織。40個RT-PCR循環後在正常組織中僅可檢測到痕量的GT468轉錄本。超過表達截止值(虛線，所有正常組織的平均表達值+3倍標準差(99%百分位數)) 的唯一正常組織是胎盤和睪丸。誤差線，STD0除了乳腺癌(見圖1)之外，還在來自肺癌、 卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、腎細胞癌、肝癌、肉瘤、甲狀腺癌和頭與頸癌的樣品中發現 GT468的高表達。圖21.癌細胞系中GI~468表達的Wfestern印跡分析。在用GI~468表達質粒轉染的 HEK293細胞(陽性對照)、SK-BR-3 (乳腺癌)、BEW0 (胎盤絨毛膜癌)、JAR (胎盤絨毛膜癌)、 HCT-15 (結腸癌)、LnCaP (前列腺癌)、HeLa (宮頸癌)、MDA_MB_468 (乳腺癌)、JEG-3 (胎盤絨毛膜癌)、JIMT-I (乳腺癌)、LAl-55n (神經母細胞瘤)、PC-3 (前列腺癌)、BT-20 (乳腺癌)和NCI-H929(骨髓瘤)中檢測了 GT468表達。MelHO(惡性黑素瘤)和NUGC4 (胃癌) 被測試為陰性。圖22. GT468可通過功能拮抗性單克隆抗體而用於製藥。與純化的雜交瘤上清液孵育72小時後，GT468陽性MDA-MB-468乳腺癌細胞和GT468陰性NUGC4胃癌細胞的增殖分析。圖23.用於測定雜交瘤上清液中針對GT468所產生抗體之特異性的Western印跡。雜交瘤上清液顯示對用GT468表達質粒轉染的HEK293細胞裂解物的特異反應性，而對模擬轉染的細胞的裂解物未顯示信號。圖24.抗GT468單克隆抗體處理減弱了裸鼠中BEWO胎盤絨毛膜癌異種移植物的腫瘤生長。皮下注射BEWO細胞後，用純化的單克隆抗體QOOyg)處理動物，一周兩次，持續兩周。圖25.鑑定GT468蛋白中的抗體結合表位的肽ELISA。雜交瘤上清液^_8B_1、35-48B-U44-3A-2.49-3A-U49-8A-U51-1A-U53-13A-2 和 62-9B1 各自顯示與一種或多種重疊的肽結合，指示了對GT468線性表位的反應性。29-1A-2和M-4B-2的結合模式指示了對GT468蛋白的構象表位(不連續表位)的反應性。圖26.在實驗性轉移實驗中，抗GT468單克隆抗體處理顯著削弱了 MCF-7乳腺癌細胞的轉移性傳播。靜脈內注射IXlO6個MCF-7細胞後，用純化的單克隆抗體QOOyg)處理動物，一周兩次。接種後5周，使用對人微衛星DNA具有特異性的寡核苷酸，通過定量PCR 測定動物肺中的轉移腫瘤負荷。定義為了使本發明更易於理解，首先對某些術語進行定義。其它定義在通篇詳細說明中闡明。術語「GI~468」優選地涉及人的GT468，特別地涉及⑴包含編碼SEQ ID NO 2胺基酸序列之核酸序列的核酸，例如包含SEQ ID NO :1核酸序列的核酸，或(ii)包含SEQ ID NO :2胺基酸序列的蛋白質，並包括所述序列的任何變體，尤其是突變體、剪接變體、構象、 同工型(isoform)、等位基因變體、物種變體和物種同源物，尤其是天然存在的那些。等位基因變體涉及基因正常序列中的改變，其意義經常是不清楚的。全基因測序經常鑑定出給定基因的大量等位基因變體。物種同源物是與給定的核酸或胺基酸序列具有不同的物種來源的核酸或胺基酸序列。術語「GT468」應當包括(i)GT468剪接變體，(ii)GT468翻譯後修飾的變體，尤其包括具有不同糖基化如N-糖基化狀態的變體，(iii)GT468構象變體，(iv) GT468癌症相關變體和GT468癌症無關變體。在一個實施方案中，術語「GT468」涉及對應於細胞外結構域或胞外域 (ectodomain)的GT468部分，優選地涉及不包含N端疏水結構域的GT468胺基酸序列。術語「GI~468」包括含有SEQ ID NO :2之四 119位胺基酸(優選四 212位胺基酸，更優選23 212位胺基酸)或SEQ ID NO 2變體的相應胺基酸的蛋白質。根據本發明，與GT468有關的術語「細胞外結構域」或「細胞外域」涉及與表達 GT468之細胞的表面相締合的GT468部分。優選地，所述「細胞外結構域」或「細胞外域」存在於細胞外區室中。GT468的「細胞外結構域」或「細胞外域」優選地指全長GT468中缺少 N端疏水結構域的部分。根據本發明，與GT468有關的術語「疏水結構域」涉及並非所述細胞外結構域之一部分的GT468部分，並優選包含位於靠近GT468N端的疏水序列。GT468的 「疏水結構域」可包含位於所述疏水序列之前的位於GT468N端的序列。針對SEQ ID NO 2 來說，所述N端疏水結構域優選包含1 22位胺基酸。應當理解，對本發明GT468多肽的任何疏水結構域或序列的鑑定均是根據本領域用於鑑定疏水結構域或序列所應用的常規標準來實現的。疏水結構域的精確邊界可存在差異，但最有可能的是，所述差異不超過本文最初鑑定之結構域兩端的約5個胺基酸。因此，GT468多肽的細胞外結構域可任選地在本文所鑑定之疏水結構域/細胞外結構域邊界處包含約5個或更少的胺基酸。「細胞表面」按照其在本領域中的慣常含義來使用，並因此包含蛋白質和其它分子有機會與之結合的細胞外部。「在細胞表面上表達的GT468」這一表述是指由細胞表達的GT468與所述細胞的表
面有關。如果GT468位於所述細胞的表面並有機會與添加至細胞的GT468特異性抗體結合，則該GT468與細胞表面相關。在一些優選的實施方案中，特徵在於其細胞表面與GT468 締合的細胞是表達GT468的細胞。應當理解，在GT468由細胞表達的情形中，與所述細胞表面相關的GT468可以僅為所表達GT468的一部分，尤其是如上所述的其細胞外結構域。根據本發明，如果表達和/或締合的水平與胎盤細胞或胎盤組織中的表達和/或締合相比更低，則GT468不在細胞中顯著表達和/或不與細胞表面顯著締合。優選地，表達和/或締合的水平低於胎盤細胞或胎盤組織中表達和/或締合的10%，優選地少於5%、 3 %、2 %、1 %、0. 5 %、0. 1 %或0. 05 %，或甚至更低。優選地，如果表達和/或締合的水平超過腦、肺、乳腺、結腸、肝、胃、腎、前列腺、胰腺、卵巢、脾、皮膚、心肌和子宮內膜中一種或多種非致瘤性、非癌組織中表達和/或締合水平不多於2倍、優選地1. 5倍，優選地不超過所述非致瘤性、非癌組織中的表達和/或締合水平，則GT468不在細胞中顯著表達和/或不與細胞表面顯著締合。優選地，如果表達和/或締合水平低於檢出限和/或如果表達和/或締合水平太低而無法允許添加至細胞的GT468特異性抗體的結合，則GT468不在細胞中顯著表達和/或不與細胞表面顯著締合。根據本發明，如果表達和/或締合水平超過腦、肺、乳腺、結腸、肝、胃、腎、前列腺、 胰腺、卵巢、脾、皮膚、心肌和子宮內膜中一種或多種非致瘤性、非癌組織中表達和/或締合水平優選地多於2倍、優選地10倍、100倍、1000倍或10000倍，則GI~468在細胞中表達和/ 或與細胞表面締合。優選地，如果表達或締合水平高於檢出限和/或如果表達和/或締合水平足夠高從而允許與添加至細胞的GT468特異性抗體結合，則GT468在細胞中表達和/ 或與細胞表面締合。優選地，在細胞中表達的GT468是在所述細胞表面上表達或暴露的細胞。術語「筏(raft)，，是指位於細胞質膜外側區域的富含鞘脂和膽固醇的膜微區。某些蛋白質與上述區域相互作用的能力及其形成「聚集」或「焦點聚集(focal aggregate)「 的能力可影響蛋白質的功能。例如，GT468分子與本發明抗體結合後易位至這些結構中形成了質膜中高密度的GT468抗原-抗體複合物。這種高密度的GT468抗原-抗體複合物可以在⑶C期間有效地激活補體系統。根據本發明，術語「疾病」是指任何病理狀態，包括癌症，特別是本文所述的癌症形式。本發明「與表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞相關的疾病」表示與健康組織或器官中的狀態相比，患病組織或器官的細胞中表達和/或締合優選地被提高。提高是指提高至少10%，尤其是至少20%，至少50%，至少100%，至少200%，至少500%，至少1000%，至少10000%或甚至更多。在一個實施方案中，表達和/或與細胞表面的締合僅存在於患病組織中，而健康組織中的表達被阻抑。根據本發明，與表達GT468和 /或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞相關的疾病包括腫瘤疾病例如癌症疾病。另外，根據本發明，腫瘤疾病如癌症疾病優選地是其中腫瘤細胞或癌細胞表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的疾病。在本文中使用時，「腫瘤疾病」、「腫瘤相關疾病」或「致瘤性疾病」包括特徵是異常調節的細胞生長、增殖、分化、粘附和/或遷移的疾病，其可導致腫瘤和/或腫瘤轉移的產生或產生趨勢。「腫瘤細胞」表示異常的細胞，其通過迅速、失控的細胞增殖而生長，並且在起始新生長的刺激終止後仍繼續生長。
「腫瘤」是指異常的細胞群或組織，其通過迅速、失控的細胞增殖而生長，並且在起始新生長的刺激終止後仍繼續生長。腫瘤顯示出結構組織以及與正常組織功能相協調的部分或全部缺乏，並且通常形成可以是良性、惡變前或惡性的獨特的組織塊。優選地，本發明的「腫瘤疾病」、「腫瘤相關疾病，，或「致瘤性疾病，，是癌症疾病，即惡性疾病，並且腫瘤細胞是癌細胞。優選地，「腫瘤疾病」、「腫瘤相關疾病」或「致瘤性疾病」 的特徵是表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞，並且腫瘤細胞表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GI~468締合。表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞優選地是腫瘤細胞或癌細胞，優選地是本文所述的腫瘤和癌症的腫瘤細胞或癌細胞。優選地，此類細胞是除胎盤細胞和/或睪丸細胞之外的細胞。本發明優選的癌症疾病或癌症選自下組乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、 結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、 骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，癌症疾病選自肺中的轉移癌。根據本發明，「上皮癌(carcinoma) 」是在器官襯裡層(上皮細胞)中開始的癌症。絨毛膜癌是惡性、滋養層和侵略性的癌症，通常在胎盤中。其特徵是早期造血性傳播至肺。肉瘤是導致中胚層增殖的結締組織(骨、軟骨、脂肪)的癌症。這與上皮起源的上皮癌不同。腎細胞癌(Renal cell carcinoma)也稱作腎細胞癌症(renal cell cancer)或腎細胞腺癌，其為起源於近曲小管(proximal convoluted tubule)襯裡的腎癌，所述近曲小管是腎中過濾血並去除廢棄物的非常細小的管道。腎細胞癌是迄今為止成年人中最常見的腎癌類型，並且在所有泌尿生殖系統腫瘤中致死性最高。腎細胞癌的不同亞型是透明腎細胞癌和乳頭狀腎細胞癌。透明腎細胞癌是腎細胞癌的最常見形式。在顯微鏡下觀察時， 組成透明腎細胞癌的細胞看起來非常蒼白或透明。乳頭狀腎細胞癌是第二常見的亞型。這些癌症在一些(如果不是大部分)腫瘤中形成小指樣投影(稱作乳頭)。「轉移」是指癌細胞從其原來的部位傳播到機體另一部分。轉移的形成是非常複雜的過程，其依賴於惡性細胞從原發腫瘤脫離、侵入細胞外基質、穿透內皮基底膜進入體腔和血管以及通過血液運輸而浸潤靶器官。最後，靶部位的新腫瘤生長依賴於血管發生。腫瘤轉移常會發生，甚至在除去原發腫瘤後亦會發生，這是因為腫瘤細胞或組分可保留和發展轉移潛能。在一個實施方案中，本發明的術語「轉移」涉及「遠處轉移」，後者涉及遠離原發腫瘤和局部淋巴結系統的轉移。繼發或轉移腫瘤的細胞與原發腫瘤中的細胞相似。例如，這表示如果卵巢癌轉移至肝，則繼發腫瘤由異常的卵巢細胞而不是異常的肝細胞組成。肝中的腫瘤隨後被稱作轉移卵巢癌而不是肝癌。術語「疾病治療」包括對疾病或其症狀的治癒、縮短持續時間、緩解、預防、減緩，或者抑制疾病或其症狀的進展或惡化，或者防止或延緩疾病或其症狀的發病。本發明的術語「患者」表示人類、非人靈長動物或其他動物，尤其是哺乳動物如牛、 馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或齧齒動物如小鼠和大鼠。在一個尤其優選的實施方案中，患者是人類。根據本發明，樣品可以是可用於本發明的任何樣品(特別是生物樣品，例如組織樣品(包括體液和/或細胞樣品))，並可通過常規的方式(例如，組織活檢(包括鑽取活組織檢查(punch biopsy))以及採集血液、支氣管抽取物、痰、尿、糞便或其它體液)而獲得。 根據本發明，術語「生物樣品，，還包括生物樣品的組分。術語「抗體」是指包含由鏈間二硫鍵連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白，或其抗原結合部分。術語「抗體」還包括所有重組形式的抗體，尤其是本文所述的抗體，例如在原核生物中表達的抗體、非糖基化的抗體以及本文所述的任何抗原結合抗體片段和衍生物。每條重鏈由重鏈可變區(本文中簡寫為VH)和重鏈恆定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中簡寫為VL)和輕鏈恆定區組成。VH和VL區可進一步細分為高變區(稱為互補決定區(CDR))、穿插在較保守區域間的區域(稱為框架區(FR))。每個VH和 VL由三個⑶R和四個FR組成，從氨基端到羧基端依次為FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、 FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的多種細胞(例如，效應細胞)以及經典補體系統的第一組分(Clq))結合。術語「人源化抗體」是指具有基本上源自非人物種之免疫球蛋白的抗原結合位點的分子，其中該分子的其餘免疫球蛋白結構基於人免疫球蛋白的結構和/或序列。所述抗原結合位點可包含融合至恆定區上的全部可變區或者僅有「嫁接」至合適的可變區框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或者經一個或多個胺基酸替換所修飾，例如經修飾使其與人免疫球蛋白更相像。人源化抗體的某些形式保留了所有CDR序列 (例如，包含小鼠抗體中全部六個⑶R的人源化小鼠抗體)。另一些形式具有相比於原始抗體進行改變的一個或多個CDR。術語「嵌合抗體」是指這樣的抗體，其中每條重鏈和輕鏈胺基酸序列的一部分與源自特定物種或屬於特定類別之抗體中的相應序列同源，而所述鏈的其餘部分則與另一物種或類別之抗體中的相應序列同源。通常，輕鏈和重鏈的可變區模擬源自某一哺乳動物物種之抗體的可變區，而恆定部分則與源自另一物種之抗體的序列同源。一個明顯的優勢是，在這種嵌合形式中，使用易於獲得的來自非人宿主生物的B細胞或雜交瘤使得可變區可方便地來源於目前已知的多種來源，並且恆定區來源於例如人細胞製備物。儘管所述可變區具有易於製備的優點並且特異性不受來源的影響，但是當注射入該抗體時，與非人來源的恆定區相比，人的恆定區引起人受試者發生免疫反應的可能性較小。然而，該定義不僅限於這一具體實例。本文使用的術語抗體之「抗原結合部分」(或簡稱為「結合部分」)是指保留了特異性結合抗原之能力的一種或多種抗體片段。已顯示，抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來實現。術語抗體之「抗原結合部分」所涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由 VL,VH,CL和CH結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含由鉸鏈區二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL和 VH結構域組成的Fv片段；(ν)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341 544-546) ； (vi)經分離的互補決定區(⑶R)，以及(vii)兩個或更多個經分離⑶R的組合， 其可任選地由合成的連接子結合。此外，儘管Fv片段的兩個結構域(VL和VH)由單獨的基因編碼，但是可使用重組方法對它們進行連接，所述重組方法利用能夠將它們製備成單一蛋白鏈(其中VL和VH兩個區域形成單價分子，稱為單鏈Fv(SCFV))的合成連接子來實現； 參見，例如 Bird 等(1988)kience 242 :423-426 ；以及 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也旨在囊括在術語抗體之「抗原結合部分」的範圍內。另一實例是結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)融合至免疫球蛋白鉸鏈區多肽的結合結構域多肽，( )融合至所述鉸鏈區的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區，以及(iii) 融合至所述CH2恆定區的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區。所述結合結構域多肽可以是重鏈可變區或輕鏈可變區。所述結合結構域免疫球蛋白融合蛋白還公開於US 2003/0118592和 US2003/0133939中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得這些抗體片段，並採用與完整抗體同樣的方式來篩選可用的片段。術語「表位」是指能夠與抗體結合的蛋白質決定簇，其中本文的術語「結合」優選地涉及特異性結合。表位通常由具有化學活性的表面分子集合(例如胺基酸或糖側鏈)組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特異性的電荷特徵。構象和非構象表位的區別在於，在變性溶劑存在時，前者(而非後者)的結合喪失。本文使用的術語「不連續表位」是指蛋白質抗原上的構象表位，其由該蛋白質一級序列中至少兩個單獨的區域形成。術語「雙特異性分子」旨在包括具有兩種不同結合特異性的任何試劑，例如蛋白質、肽或者蛋白質複合物或肽複合物。例如，所述分子可與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面上的Fc受體結合或相互作用。術語「多特異性分子」或「異種特異性分子 (heterospecific molecule)，，旨在包括具有兩種以上不同結合特異性的任何試劑，例如蛋白質、肽或者蛋白質複合物或肽複合物。例如，所述分子可以與(a)細胞表面抗原、(b)效應細胞表面上的Fc受體以及(c)至少一種另外組分結合或相互作用。因此，本發明包括但不限於針對GT468以及針對另一些靶標(如效應細胞上的Fc受體)的雙特異性、三特異性、 四特異性和另外的多特異性分子。術語「雙特異性抗體」還包括雙抗體(diabody)。雙抗體是二價、雙特異性抗體，其中VH和VL結構域表達在單一多肽鏈上，然而使用過短的、以致於所述同一鏈上的兩個結構域不能配對的連接子，從而使所述結構域與另一鏈的互補結構域配對並形成兩個抗原結合位點(參見，例如Holliger，P.等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 ；Poljak, R. J.等(1994) Mructure 2 :1121-1123)。本發明還包括本文所述抗體的衍生物，它們就本發明的目的而言包括在術語「抗體」之內。術語「抗體衍生物」是指抗體的任何修飾形式，例如抗體與另一試劑或抗體的綴合物。如本文所使用地，如果抗體是通過免疫動物或通過篩選免疫球蛋白基因文庫而從系統中獲得的，其中所選抗體的胺基酸序列與由生殖系免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少90%、更優選至少95%、甚至更優選至少96%、97%、98%或99%的同一性，則該抗體「源自」特定的生殖系序列。通常，與由生殖系免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列相比，源自特定生殖系序列的抗體將顯示不超過10個(更優選地不超過5個，甚至更優選地不超過4、3、2或1個)胺基酸差異。本文使用的術語「異種抗體(heteroantibody) 」是指兩種或更多種抗體、其衍生物或連接在一起的抗原結合區域，其中至少兩種具有不同的特異性。這些不同的特異性包括針對效應細胞上Fc受體的結合特異性以及針對靶細胞(例如腫瘤細胞)上抗原或表位的結合特異性。本文所述的抗體可以是人抗體。本文使用的術語「人抗體」旨在包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括並非由人生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如，通過在體外進行隨機誘變或位點特異性誘變或者通過在體內進行體細胞突變所引入的突變)。本文使用的術語「單克隆抗體」是指單一分子組成的抗體分子製備物。單克隆抗體顯示針對特定表位的單一結合特異性及親合力。在一個實施方案中，單克隆抗體由雜交瘤產生，所述雜交瘤包含與永生化細胞融合的來自非人動物(如小鼠)的B細胞。本文使用的術語「重組抗體」包括利用重組手段製備、表達、產生或分離的所有抗體，例如(a)從與所述免疫球蛋白基因或由其製備之雜交瘤有關的轉基因或轉染色體動物(例如小鼠)中分離的抗體，(b)從經轉化表達所述抗體的宿主細胞(例如從轉染瘤 (transfectoma))中分離的抗體，(c)從重組的組合抗體文庫中分離的抗體，和(d)利用任何其它手段(包括將免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列剪接)製備、表達、產生或分離的抗體。本文使用的術語「轉染瘤」包括表達抗體的重組真核宿主細胞，如CHO細胞、NS/0 細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、植物細胞或真菌(包括酵母)細胞。本文使用的「異源抗體」的定義與產生這種抗體的轉基因生物有關。該術語是指如下抗體其具有的胺基酸序列或編碼核酸序列對應於不包括所述轉基因生物在內的生物中的序列，並且一般源自非所述轉基因生物的物種。本文使用的「異雜合抗體(heterohybrid antibody) 」是指具有不同生物來源之輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有人的重鏈以及小鼠的輕鏈的抗體是異雜合抗體。優選地，本文所述的抗體是經分離的。本文使用的「經分離抗體」意指基本上不含具有不同抗原特異性之其它抗體的抗體(例如，特異性結合GT468的經分離抗體基本上不含特異性結合非GT468之抗原的抗體)。然而，特異性結合人GT468的表位、同工型或變體的經分離抗體可與其它相關抗原(例如來自其它物種的抗原(如GT468物種同源物))具有交叉反應。此外，經分離抗體可基本上不含其它細胞材料和/或化學製劑。在本發明的一個實施方案中，「經分離」單克隆抗體的組合涉及具有不同特異性且在成熟組合物中被組合的抗體。根據本發明，術語「結合」優選地涉及特異性結合。「特異性結合」是指與結合其他靶標相比，試劑(如抗體)與(預定的)靶標(如抗原或表位)的結合更強。如果試劑結合第一靶標的解離常數(kD)低於結合第二靶標的解離常數，則該試劑與第一靶標的結合較之與第二靶標的結合更強。優選地，與試劑非特異性結合之靶標的解離常數(kD)相比，試劑特異性結合靶標的解離常數(kD)低超過10倍，優選超過20倍，更優選超過50倍，甚至更優選超過100倍、200倍、500倍或1000倍。通常，抗體以相當於約1 X 10_7M或更低之Kd 的親合力結合，其與預先確定之抗原的結合親合力比與非特異性抗原(並非預先確定的抗原或極其相關的抗原，例如BSA、酪蛋白)的結合親合力對應的Kd至少低兩個數量級。本文使用的術語「KD」 (M)意指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。本文使用的「同種型」是指由重鏈恆定區基因編碼的抗體種類(例如，IgM或 IgGl)。
本文使用的「類型轉換」是指抗體的種類或同種型從一種Ig類別變為另一種Ig類別的現象。本文使用的適用於某對象的術語「天然存在」是指可以在自然界中發現該對象。例如，可以從自然來源分離並且尚未在實驗室中被人為有意修飾的生物(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。本文使用的術語「重排」是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構型，其中在編碼基本完整的VH或VL結構域的構象中，V部分分別位於緊鄰D-J或J部分處。可通過與生殖系DNA比較來鑑定重排免疫球蛋白(抗體)的基因座；重排基因座將具有至少一個重組的七聚體/九聚體同源性元件。本文使用的與V部分有關的術語「未重排的」或「生殖系構型」是指V部分未發生重組從而緊鄰D或J部分的構型。本文使用的術語「核酸分子」旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選雙鏈DNA。優選地，本發明所述的核酸已被分離。根據本發明，術語「經分離核酸」是指該核酸(i)被體外擴增，例如通過聚合酶鏈式反應(PCR)來實現，(ii)通過克隆被重組產生， (iii)被純化，例如通過切割和凝膠電泳分離來實現，或者(iv)被合成，例如通過化學合成來實現。經分離核酸是可用於進行重組DNA技術操作的核酸。根據本發明，核酸可以單獨存在或與另一些核酸(其可以是同源的或異源的)組合存在。在一些優選的實施方案中，核酸與表達調控序列功能性連接，所述表達調控序列可以與所述核酸是同源的或異源的，其中術語「同源的」是指核酸在自然條件下也與該表達調控序列功能性連接，而「異源的」是指核酸在自然條件下不與該表達調控序列功能性連接。核酸(如表達RNA和/或蛋白質或肽的核酸)與表達調控序列彼此是「功能性」連接的，如果它們以如下方式彼此共價連接的話所述核酸的表達或轉錄受所述表達調控序列的調控或影響。如果核酸(其含有與編碼序列功能性連接的表達調控序列)將被翻譯成有功能的蛋白質，誘導所述表達調控序列會導致所述核酸的轉錄，而不會造成編碼序列的移碼或者所述編碼序列不能被翻譯成預期的蛋白質或肽。根據本發明，術語「表達調控序列」包括啟動子、核糖體結合位點、增強子以及調節基因轉錄或mRNA翻譯的其它調控元件。在本發明一些特別的實施方案中，所述表達調控序列可以被調節。表達調控序列的確切結構可因物種或細胞類型的功能而不同，但一般包含分別參與起始轉錄和翻譯的5』 -非轉錄序列以及5』 -和3』 -非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更特別地，5』 -非轉錄表達調控序列包含啟動子區域，其包含用於轉錄調控功能性連接之核酸的啟動子序列。表達調控序列還可包括增強子序列或上遊激活序列。根據本發明，術語「啟動子」或「啟動子區域」涉及如下核酸序列，其位於所表達核酸序列的上遊(5』 )並通過為RNA聚合酶提供識別和結合位點來調控該序列的表達。所述「啟動子區域」還可包含針對另一些因子的識別和結合位點，所述因子參與基因轉錄的調節。啟動子可以調控原核基因或真核基因的轉錄。另外，啟動子可以是「誘導型的」(其可以響應於誘導劑而起始轉錄)或「組成型的」(如果轉錄不受誘導劑調控的話)。如果不存在誘導劑，則受誘導型啟動子調控的基因不表達或者僅很低程度表達。在誘導劑存在時，所述基因被開啟或者說其轉錄水平提高。這一般由特異性轉錄因子的結合來介導。本發明優選的啟動子包括SP6、T3和T7聚合酶的啟動子，人TO RNA啟動子、CMV 啟動子及其(例如CMV)人工雜合啟動子(其一部分或多個部分與另外細胞蛋白質(例如人GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶))之基因啟動子的一部分或多個部分融合，並且包含或不包含(一個或多個)額外內含子。根據本發明，術語「表達」以其最一般的含義使用，並包括產生RNA或者產生RNA和蛋白質/肽。其還包括核酸的部分表達。此外，可進行瞬時或穩定表達。在一個優選的實施方案中，根據本發明，核酸分子存在於載體中，並視情況帶有調控該核酸表達的啟動子。本文使用的術語「載體」以其最一般的含義使用，並包括其核酸能夠使所述核酸例如被引入原核和/或真核細胞並視情況被整合進基因組中的任何中介運載體(vehicle)。這種載體優選地在細胞中複製和/或表達。載體包括質粒、噬菌粒、噬菌體或病毒基因組。本文使用的術語「質粒」 一般地涉及可獨立於染色體DNA進行複製的染色體外遺傳物質構建體，通常是環狀DNA雙鏈體。作為用於表達抗體的載體，可使用抗體重鏈和輕鏈存在於不同載體中的載體類型，或者重鏈和輕鏈存在於同一載體中的載體類型。應當理解，本文給出的有關特異性核酸和胺基酸序列(例如所述序列表中所示的序列)的教導還涉及對所述特異性序列進行修飾，所得序列在功能上等同於所述特異性序列，例如表現出與所述特異性胺基酸序列一致或類似特性的胺基酸序列以及所編碼的胺基酸序列表現出與由所述特異性核酸序列編碼之胺基酸序列一致或類似特性的核酸序列。類似地應當理解，本文給出的有關特異性抗體或生產特異性抗體的雜交瘤的教導還涉及下述抗體，所述抗體的特徵是胺基酸序列和/或核酸序列與特異性抗體的胺基酸序列和/或核酸序列相比被修飾，但是功能上等同的。一個重要的特性是保留了抗體與其靶標的結合或者說維持了抗體的效應物功能。優選地，當針對特異性序列進行修飾的序列取代了所述特異性序列時，所述經修飾序列保留了所述抗體與GT468的結合以及優選地如本文所述之抗體的功能(例如CDC介導的裂解或ADCC介導的裂解)。本領域技術人員應理解，可特別地對CDR、高變區和可變區的序列進行修飾而不喪失與GT468結合的能力。例如，CDR區域與本文指明的抗體區域一致或高度同源。「高度同源」是指，在⑶R中可進行1 5處、優選1 4處(例如1 3處或1 2處)替換。此外，可對高變區和可變區進行修飾使它們顯示與本文指明的抗體區域基本同源。應當理解，本文所述的特異性核酸還包括為了在特定宿主細胞或生物體中優化密碼子使用而進行修飾的核酸。生物體之間密碼子使用的差異可引起與異源基因表達有關的多種問題。通過改變原始序列的一個或多個核苷酸進行密碼子優化可導致待表達所述核酸的同源或異源宿主中核酸表達的優化(特別是對翻譯效率的優化)。例如，如果根據本發明使用來源於人並編碼抗體恆定區和/或框架區的核酸(例如用於製備嵌合或人源化的抗體)，可優選地為了優化密碼子使用而修飾所述核酸，特別是如果所述核酸(其任選地與異源核酸(例如源自本文所述之其它生物的核酸)融合)將在非人生物(例如小鼠或倉鼠) 的細胞中表達的話。例如，所述編碼人的輕鏈和重鏈恆定區的核酸序列(如SEQ ID NO 19 和20分別所示的序列)可被修飾為包含一個或多個(優選地至少1、2、3、4、5、10、15、20個， 以及優選地多達10、15、20、25、30、50、70或100或更多個)核苷酸替換，其導緻密碼子使用的優化但不引起胺基酸序列的改變。這樣的核苷酸替換優選地涉及SEQ ID No:19和20中分別的核苷酸替換，其分別選自SEQ ID No :19和20的以下比對中所示的替換(其經修飾的對應物不引起所編碼胺基酸序列的改變)，或者涉及分別編碼人的輕鏈和重鏈恆定區的另一些核酸序列中相應位置的對應替換。優選地，SEQ ID No :19和20的以下比對中分別所示的所有替換(其經修飾的對應物不引起所編碼胺基酸序列的改變)分別由編碼人的輕鏈和重鏈恆定區的核酸序列產生。SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 21 的比對
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AA<3GTCrCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGACAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG 660
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AAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCAGCCCCCATCOAAAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGC 660
CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC 720
ιιιιι ιι ιι ιι ιιιπιιιιιιιιιπιιιι ιιιιιι in imiiiim
CAGCCACGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC 720
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AGCCTGAGCCCCGGCAAGTAG 981 此外，根據本發明，修飾本文所述的胺基酸序列(特別是人的重鏈恆定區的序列) 用以將該序列改造成期望的同種異型(例如在高加索人群中發現的同種異型)可以是理想的。這樣的修飾優選地選自SEQ ID NO: 17中的如下胺基酸替換或者位於人重鏈另一些恆定區中的相應位置K93R、D235E和L237M。優選地，所有這些修飾均包含在人重鏈恆定區的
胺基酸序列中。根據本發明，術語「相應位置」涉及在兩種核酸或蛋白質序列的序列比對中彼此對齊的核苷酸或胺基酸殘基。根據本發明，核酸序列、胺基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段優選地分別具有其來源核酸序列、胺基酸序列或肽的功能特性。此類功能特性包括與其他分子相互作用或者結合。在一個實施方案中，核酸序列、胺基酸序列或肽的變體、衍生物、修飾形式或片段在免疫學上分別等同於其來源的核酸序列、胺基酸序列或肽。優選地，特異性核酸序列與針對該特異性核酸序列進行修飾的核酸序列或者該特異性核酸序列的變體核酸序列之間的同一性程度為至少70%，優選地至少75%，更優選地至少80%，甚至更優選地至少90%或最優選地至少95%、96%、97%、98%或99%。對於 GT468核酸變體來說，同一性程度優選地在具有至少約300個、至少約400個、至少約450 個、至少約500個、至少約550個、至少約600個或至少約630個核苷酸的區域中給出。在一些優選的實施方案中，所述同一性程度針對參考核酸序列(例如序列表中所示的核酸序列)的整個長度給出。優選地，所述兩個序列能夠彼此雜交並形成穩定的雙鏈體，所述雜交優選地在允許多核苷酸之間特異性雜交的條件(嚴格條件)下進行。嚴格條件描述於例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編著，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York, 1989或者Current Protocols in Molecular Biology,F. M. Ausubel ^ISJohn Wiley & Sons，Inc. ,New York 43, 指例如在65°C、在雜交緩衝液(3. 5XSSC、0. 02% Ficoll、0. 02%聚乙烯吡咯烷酮、0. 02% 牛血清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH 7)、0. 5% SDS、2mM EDTA)中雜交。SSC 是 0. 15M 氯化鈉 /0. 15M檸檬酸鈉(pH 7)。雜交後，清洗所述DNA已轉移其中的膜，例如，在2XSSC中室溫下，然後在 0. 1 0. 5XSSC/0. IXSDS 中 68°C下。就本發明的目的而言，胺基酸序列的「變體」包括胺基酸插入變體、胺基酸缺失變體和/或胺基酸替換變體。優選地，相似性程度(優選地，特異性胺基酸序列與針對該特異性胺基酸序列進行修飾的胺基酸序列或者該特異性胺基酸序列的變體胺基酸序列之間(例如顯示基本同源的胺基酸序列之間)的同一性為至少70%、優選地至少80%、甚至更優選地至少90%或最優選地至少95%、96%、97%、98%或99%。對於GI~468多肽變體來說，相似性程度或同一性優選地在具有至少約100個、至少約120個、至少約140個、至少約160個、至少約180個、 至少約200個、至少約210個或212個胺基酸的區域中給出。在一些優選的實施方案中，在一定程度的相似性或同一性證是整個長度範圍的胺基酸序列，如序列表中的胺基酸序列。所有上述經修飾的序列或序列變體均在本發明的範圍內。「序列相似性」表示一致的或經保守性胺基酸替換的胺基酸的百分比。兩個多肽或核酸序列之間的「序列同一性」表示兩序列之間一致的胺基酸或核苷酸的百分比。「同一性百分比」在最優比對後獲得，該百分比純粹是統計學意義上的，兩序列之間的差異隨機分布並覆蓋其全長。常規地，兩個核苷酸序列或胺基酸序列之間的序列比較在對這些序列進行最優比對後進行，所述比較通過分段或通過「比較窗(window ofcomparison) 」來進行，從而確定和比較局部區域的序列相似性。除了手動方式以外，可採用如下方式獲得為了進行比較而對序列進行的最優比對=Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith 和 Waterman，1981，Ads App. Math. 2，482)、Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(Neddleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48，443)、Pearson 和 Lipman 的相似性搜索方法(Pearson 和 Lipman，1988，Proc. Natl Acad. Sci. USA 85,2444)或使用這些算法 (Wisconsin Genetics 軟體包(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)中的 GAP、BESTFIT、FASTA, BLAST P、BLAST N 和 TFASTA)的電腦程式。同一性百分比的計算方式如下確定所比較兩序列之間一致位置的數目，將該數目除以所比較的位置數，所得結果乘以100，從而獲得這兩個序列之間的同一性百分比。「保守性替換」可例如基於所涉及殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質的相似度來進行。例如(a)非極性(疏水)胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺；(c)荷正電的(鹼性)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及(d)荷負電的(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。替換通常可在(a)-(d)組內進行。此外，甘氨酸和脯氨酸可相互替換，這基於它們破壞α螺旋的能力。可在以下組中進行一些優選的替換(i) S和T ； (ii)P和G ；以及(iii)A、V、L和I。 由於遺傳密碼以及重組和合成DNA的技術是已知的，本領域技術人員可容易地構建出編碼所述保守胺基酸變體的DNA。本發明包括已在Fc區進行改變以改變抗體功能或藥代動力學特性的抗體。這些改變可導致Clq結合和⑶C的降低或提高或者Fc γ R結合和ADCC的降低或提高。替換可例如在重鏈恆定區的一個或多個胺基酸殘基中進行，因而造成效應物功能的變化而保留了與經修飾抗體相當的抗原結合能力，參見US 5，624，821和US 5，648，260。可通過對Ig恆定結構域或Ig樣恆定結構域的補救受體(salvage receptor)表位進行修飾(使該分子不包含完整的CH2結構域或完整的Ig Fc區域)來改善抗體的體內半衰期，參見US 6，121，022和US 6，194，551。還可通過在Fc區域中製造突變來提高體內半衰期，例如通過在252位用蘇氨酸替換亮氨酸、通過在2M位用蘇氨酸替換絲氨酸或通過在256位用蘇氨酸替換苯丙氨酸來實現，參見US 6，277，375。此外，可對抗體的糖基化模式進行修飾從而改變抗體的效應物功能。例如，可以在轉染瘤中表達抗體，該轉染瘤不添加通常與所述Fc區域297位之Asn結合的巖藻糖單位， 從而提高了 Fc區域針對Fc-受體的親合力，繼而導致在NK細胞存在下的抗體ADCC提高， 參見Siield等Q0(^)JBC，277 J6733。此外，可進行半乳糖基化修飾來改造CDC。作為替代地，在另一實施方案中，可以沿抗GT468抗體編碼序列的全長或部分引入隨機突變(例如通過飽和誘變來實現)，可對所得的經修飾抗GT468抗體進行結合活性篩選。本文使用的術語「重組的宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意指引入重組表達載體的細胞。應當理解，該術語不僅是指特定對象的細胞，還指這些細胞的子代。由於突變或環境影響所致後代中可出現某些修飾，因此這些子代可事實上有別於親代細胞，但仍包括在本文使用的術語「宿主細胞」的範圍內。重組的宿主細胞包括例如轉染瘤(如CHO細胞、 NS/0細胞和淋巴細胞)。
本文使用的「對象」包括任何人或非人動物。術語「非人動物」包括所有脊椎動物， 例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類的靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲類、爬行類等。術語「轉基因動物」是指具有包含一種或多種轉基因(優選重鏈和/或輕鏈轉基因)或轉染色體(整合或不整合進動物的天然基因組DNA中)之基因組並且優選能夠表達該轉基因的動物。例如，轉基因小鼠可具有人的輕鏈轉基因以及人的重鏈轉基因或人的重鏈轉染色體，從而當用GT468抗原和/或表達GT468的細胞免疫時，小鼠產生人抗GT468 抗體。可將人的重鏈轉基因整合進小鼠的染色體DNA中，正如轉基因小鼠例如HuMAb小鼠(如HCo7或HCol2小鼠)中的情形，或者可將人的重鏈轉基因維持在染色體外，正如WO 02/43478中所述的轉染色體(例如，KM)小鼠中的情形。這樣的轉基因小鼠和轉染色體小鼠可通過進行V-D-J重組和類型轉換而能夠產生多種針對GT468的人單克隆抗體同種型 (例如，IgG、IgA 和 / 或 IgE)。本文使用的「減少」或「抑制」意指導致總體降低的能力，其降低水平(例如細胞增殖水平)為優選5%以上、10%以上、20%以上，更優選50%以上，最優選75%以上。短語「抑制細胞活性」或類似的短語包括細胞活性的完全或基本完全的抑制和細胞活性的降低。優選地，所述細胞活性的抑制降低腫瘤細胞生長和/或誘導腫瘤細胞死亡， 並且因此具有腫瘤抑制效應或腫瘤破壞效應。mAb的作用機制儘管下文提供了有關本發明抗體治療效果之機制的考慮，但不應視為以任何方式限制本發明。本文所述的抗體可與免疫系統的組分相互作用，優選地通過ADCC或⑶C來實現。 本發明的抗體還可用於指向有效負載(例如，放射性同位素、藥物或毒素)以直接殺死腫瘤細胞，或者可與常規化療藥劑協同使用，通過互補的作用機制來攻擊腫瘤，所述作用機制可包括抗腫瘤免疫反應，該反應可能因對T淋巴細胞具有化療毒副作用而受到影響。然而，本發明的抗體還可以僅通過與細胞表面上的GT468結合併因此例如阻斷細胞增殖而起效。抗體依賴性細胞毒作用ADCC描述了本文所述效應細胞(特別是淋巴細胞)的細胞殺傷能力，其優選地需要靶細胞被抗體所標記。ADCC優選地發生在抗體與腫瘤細胞上的抗原結合以及抗體Fc結構域與免疫效應細胞表面上的Fc受體(FcR)結合時。已鑑定了 Fc受體的幾個家族，特定細胞群特徵性表達所述Fc受體。可將ADCC看作是直接誘導迅速產生的不同程度腫瘤破壞(其導致抗原呈遞以及誘導針對腫瘤的T細胞應答)的機制。優選地，體內誘導ADCC將導致針對腫瘤的T 細胞應答和源自宿主的抗體應答。補體依賴性細胞毒作用CDC是可由抗體介導的另一種細胞殺死方法。IgM是針對補體活化最有效的同種型。IgGl和IgG3對於經由經典補體活化途徑來介導⑶C也都非常有效。優選地，在該級聯反應中，抗原-抗體複合物的形成導致與參與反應之抗體分子(如IgG分子)的(^2結構域非常接近的多個Clq(Clq是補體Cl的三個亞組分之一)結合位點暴露出來。優選地， 這些暴露出來的Clq結合位點將先前低親合力的Clq-IgG相互作用轉換為高親合力的相互作用，繼而引發涉及一系列其它補體蛋白並導致蛋白質水解釋放效應細胞的趨化/活化劑C3a和Cfe的級聯事件。優選地，補體級聯反應終止於膜攻擊複合物的形成(其在細胞膜中形成小孔，從而促使水和溶質自由進出細胞)。抗體產生本發明的抗體可利用多種技術來產生，包括常規的單克隆抗體方法，例如Kohler 和Milstein，Nature 256 =495(1975)的標準體細胞雜交技術。儘管體細胞雜交方法是優選的，但是原則上也可應用產生單克隆抗體的其它技術，例如病毒轉化或致癌轉化B淋巴細胞或者使用抗體基因文庫的噬菌體展示技術。用於製備分泌單克隆抗體的雜交瘤的優選動物系統是小鼠系統。利用小鼠生產雜交瘤是非常成熟的方法。免疫操作方法以及分離用於融合的經免疫脾細胞的技術是本領域已知的。融合伴侶(例如，小鼠骨髓瘤細胞)和融合操作方法也是已知的。用於製備分泌單克隆抗體的雜交瘤的其它優選動物系統包括大鼠和兔系統(例如 Spieker-Polet 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :9348(1995)中有所描述，還參見 Rossi 等，Am. J. Clin. Pathol. 124 295 (2005)) 在另一優選的實施方案中，可使用攜帶部分人體免疫系統(而非小鼠系統)的轉基因或轉染色體小鼠來產生針對GT468的人單克隆抗體。這些轉基因和轉染色體小鼠包括分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，下文中統稱為「轉基因小鼠」。在此類轉基因小鼠中產生人的抗體可根據W02004 035607中有關⑶20的詳細描述來進行。另一種產生單克隆抗體的策略是直接從根據已有策略產生抗體的淋巴細胞分離基因編碼的抗體，例如參見 Babcock 等，1996，A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy。有關重組抗體工程的詳細信息請參見Welschof和Kraus，Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 VX R Benny K. C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1。免疫為了產生針對GT468的抗體，可使用源自GT468序列的與載體綴合的肽、重組表達 GT468抗原或其片段的富集製備物和/或表達GT468的細胞來免疫小鼠，如上所述。或者， 可用編碼人全長GT468的DNA (如SEQ ID NO 1)或其片段(特別是編碼SEQ ID NO 3-10 和35-82的那些)來免疫小鼠。如果在使用GT468抗原的純化或富集製備物進行免疫時不產生抗體，則還可使用表達GT468的細胞(例如細胞系)來免疫小鼠以促進免疫應答。可使用通過尾靜脈或眼球後取血得到的血漿和血清樣品來監測免疫全過程中的免疫應答。可使用擁有足量效價之抗GT468免疫球蛋白的小鼠進行融合。可以在處死小鼠以及取出脾的3天前使用表達GT468的細胞對小鼠進行腹膜內或靜脈內加強免疫，以提高分泌特異性抗體之雜交瘤的產率。產生單克隆抗體之雜交瘤的獲得為了獲得產生針對GT468之單克隆抗體的雜交瘤，可以從經免疫小鼠分離出脾細胞和淋巴結細胞並使其與適當的永生化細胞系(如小鼠骨髓瘤細胞系)進行融合。隨後， 可對所得雜交瘤進行產生抗原特異性抗體的篩選。然後，可利用ELISA對各孔中分泌抗體之雜交瘤進行篩選。使用表達GT468的細胞，利用免疫螢光和FACS (流式細胞術)可鑑定出特異性針對GT468的抗體。可以將分泌抗體的雜交瘤再次鋪板及篩選，仍然呈抗GT468陽性的單克隆抗體可以通過有限稀釋進行亞克隆。然後，可在體外培養穩定的亞克隆，以在組織培養基中獲得抗體用於表徵。產生單克隆抗體之轉染瘤的獲得使用例如本領域熟知的一系列重組DNA技術和基因轉染的方法(Morrison， S. (1985) Science 229 :1202)，本發明的抗體也可以在宿主細胞轉染瘤中產生。例如，在一個實施方案中，可以將目的基因(例如抗體基因)連接到表達載體(例如GS基因表達系統(W0 87/04462、WO 89/01036和EP 338 841中有所公開)或本領域熟知的其它表達系統中使用的真核表達質粒)中。可以將帶有經克隆抗體基因的純化質粒引入真核宿主細胞(如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293T細胞或HEK293細胞，或者作為替代地其它真核細胞如植物來源之細胞、真菌或酵母細胞)。用於引入這些基因的方法可以是本領域中已知的方法例如電穿孔、lipofectine(脂質體)、lipofectamine (脂質體)等。在將這些抗體基因引入宿主細胞後，可鑑定並選擇表達抗體的細胞。這些細胞代表了隨後可因其表達水平和擴大產生抗體而進行擴增的轉染瘤。可以從這些培養物上清液和/或細胞分離和純化重組抗體。或者，經克隆抗體基因可表達在其它表達系統中，包括原核細胞例如微生物(如大腸桿菌)。此外，所述抗體可以在轉基因非人動物中產生(例如在羊和兔的乳汁中或母雞的卵中)或者在轉基因植物中產生；參見例如Verma，R.等(1998) J. Immunol. Meth. 216 165-181 ；Pollock 等(1999) J. Immunol. Meth. 231 :147-157;以及 Fischer, R.等(1999) Biol. Chem. 380 :825_839。使用部分抗體序列來表達完整抗體(即人源化和嵌合化)a)嵌合化小鼠單克隆抗體被毒素或放射性同位素標記時可用作人的治療性抗體。未經標記的小鼠抗體重複使用時對人體具有高度免疫原性，導致治療效果降低。主要的免疫原性是由重鏈恆定區所介導的。如果對各抗體進行嵌合化或人源化，則可以減少或完全避免小鼠抗體的免疫原性。嵌合抗體是其不同部分來自不同動物物種的抗體，例如具有小鼠抗體可變區和人免疫球蛋白恆定區的抗體。抗體嵌合化通過將小鼠抗體重鏈及輕鏈的可變區與人的重鏈及輕鏈的恆定區結合來實現(例如，如Kraus等，Methods in Molecular Biology 胃歹1」巾白勺 Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN_0_89603_918_8 巾)。 在一個優選的實施方案中，通過將人的κ輕鏈恆定區與小鼠輕鏈可變區結合而得到嵌合抗體。在另一個優選的實施方案中，通過將人的λ輕鏈恆定區與小鼠輕鏈可變區結合而得到嵌合抗體。用於產生嵌合抗體的優選重鏈恆定區為IgGl、IgG3和IgG4。用於產生嵌合抗體的其它優選重鏈恆定區抗體為IgG2、IgA、IgD和IgM。b)人源化抗體與靶抗原相互作用主要是通過位於重鏈和輕鏈六個互補決定區(OTR)的胺基酸殘基來實現的。因此，與CDR外部的序列相比，CDR中的胺基酸序列在各種抗體之間差異更大。由於⑶R序列負責形成大多數抗體-抗原相互作用，因此表達模擬天然特異性抗體性質的重組抗體是可能的，其通過構建包含來自天然特異性抗體之CDR序列以及與其「嫁接」的來自具有不同性質之不同抗體的框架序列的表達載體來實現(例如，參見 Riechmann, L.等(1998)Nature 332 :323-327 Jones, P.等(1986)Nature 321 :522-525 ；以及 Queen，C.等(1989) Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A. 86 10(^9-10033)。這樣的框架序列可從包含生殖系抗體基因序列的公共DNA資料庫獲得。這些生殖系序列不同於成熟抗體基因序列，這是因為它們不包含完整組裝的可變基因(其是由B細胞成熟期間的V(D)J連接形成的)。生殖系基因序列還在整個可變區與高親合力第二抗體庫(secondary repertoire antibody)的序列不同。例如，在框架區1的氨基端部分和框架區4的羧基末端部分中，體細胞突變的頻率相對較低。此外，許多體細胞突變並不顯著改變抗體的結合能力。因此，為了重建與原始抗體具有類似結合性質的完整重組抗體，並不需要獲得特定抗體的整個DNA 序列(參見WO 99/45962)。覆蓋⑶R區域的部分重鏈和輕鏈序列通常足以實現這一目的。 使用所述部分序列來確定哪些生殖系可變基因和連接基因片段負責形成重組抗體可變基因。然後，用生殖系序列來填補可變區的缺失部分。重鏈和輕鏈的前導序列在蛋白質成熟過程中被切割，因而與最終抗體的性質無關。為了添加缺失序列，可通過連接或PCR擴增將克隆的cDNA序列與合成的寡核苷酸結合。或者，可以將整個可變區合成為一組短的、重疊的寡核苷酸，並通過PCR擴增進行結合以產生完全合成的可變區克隆。這個方法具有某些優勢，例如去除或加入特定的限制性酶切位點或者優化特定的密碼子。使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉錄物之核苷酸序列來設計一組重疊的合成寡核苷酸，以產生胺基酸編碼能力與天然序列相同的合成V序列。合成的重鏈和κ鏈序列與天然序列可在三個方面有所不同插入重複核酸鹼基串以有利於寡核苷酸合成以及PCR擴增；根據Kozak規則併入最優翻譯起始位點(Kozak,1991, J. Biol. Chem. 266 19867-19870)；以及對翻譯起始站點上遊的HindIII位點進行改造。對於重鏈和輕鏈可變區來說，經優化的編碼及相應的非編碼鏈序列大致在所述相應非編碼寡核苷酸中點處被分成30 50個核苷酸。因此，對每條鏈來說，寡核苷酸可組裝成150 400個核苷酸片段的重疊、雙鏈集合。然後，將該集合用作產生150 400個核苷酸PCR擴增產物的模板。通常，單個可變區寡核苷酸集合會被分為兩組，這兩組分別進行擴增以產生兩種重疊的PCR產物。然後，利用PCR擴增將這些重疊的產物結合以形成完整的可變區。在PCR擴增中包含重鏈或輕鏈恆定區的重疊片段以產生可容易地克隆進表達載體構建體中的片段也是可取的。隨後，將重建的嵌合或人源化重鏈和輕鏈可變區與克隆的啟動子序列、前導序列、 翻譯起始序列、恆定區序列、3』非翻譯序列、多腺苷酸化序列和轉錄終止序列結合以形成表達載體構建體。可以將所述重鏈和輕鍊表達構建體結合進單一載體，利用共同轉染、依序轉染或單獨轉染的方式轉染進宿主細胞，然後對該宿主細胞進行融合以形成表達這兩種鏈的宿主細胞。本文描述了用於構建針對人IgGK之表達載體的質粒。可以構建所述質粒以使 PCR擴增的V重鏈和V κ輕鏈cDNA序列可用於重建完整的重鏈和輕鏈微基因(minigene)。 這些質粒可用於表達完整的人的或嵌合的IgGl，κ或IgG4，κ抗體。可構建類似的質粒用於表達其它重鏈同種型或者表達包含λ輕鏈的抗體。因此，在本發明的另一方面，使用本發明抗GT468抗體的結構特徵來產生結構相關的保留了至少本發明抗體之功能特性(如與GT468結合)的人源化抗GT468抗體。更具體地，可將小鼠單克隆抗體的一個或多個CDR區域與已知的人框架區和CDR重組結合，以產生本發明另外的重組改造的、人源化的抗GT468抗體。與抗原表達細胞結合
可使用標準結合測定來確定抗體結合GT468的能力，例如實施例中所列出的測定 (例如，ELISA、Western印跡、免疫螢光和流式細胞分析)。抗體的分離和表徵為了純化抗GT468抗體，可將選定的雜交瘤培養在用於純化單克隆抗體的兩升轉瓶中。或者，抗GT468抗體可以在基於透析的生物反應器中產生。在用蛋白G瓊脂糖凝膠或蛋白A瓊脂糖凝膠進行親合層析前，可對上清液進行過濾，必要時進行濃縮。經洗脫的 IgG可以通過凝膠電泳和高效液相色譜法進行檢測以確保純度。可將緩衝溶液更換成PBS， 其濃度可通過使用消光係數1. 43在0D280下測定。可將所述單克隆抗體進行分裝並儲存於-80 0C ο為了確定所選抗GT468單克隆抗體是否結合唯一的表位，可使用定點或多點突變。同種型測定為了測定純化抗體的同種型，可使用多種市售試劑盒(例如Zymed，Roche Diagnostics)進行同種型ELISA。可使用抗小鼠Ig來包被微量滴定板的孔。封閉後，在室溫下將該板與單克隆抗體或純化的同種型對照一起反應2小時。然後，可將孔與小鼠IgGl、 IgG2a,IgG2b或IgG3、IgA或小鼠IgM特異性的、綴合有過氧化物酶的探針一起反應。清洗後，可用ABTS底物(lmg/ml)使該板顯影，並在OD 405 650下進行分析。或者，可根據生產商的說明使用IsoStrip小鼠單克隆抗體分型試劑盒(Roche，貨號1493027)。流式細胞術分析為了測定經免疫小鼠的血清中存在抗GT468抗體或者單克隆抗體與表達GT468之活細胞的結合，可以使用流式細胞術。可以將天然表達GT468或轉染後表達GT468的細胞系以及缺乏GT468表達的陰性對照(在標準培養條件下培養)與雜交瘤上清液中或含有 FBS的PBS中的不同濃度單克隆抗體混合，可在4°C孵育30分鐘。清洗後，可以在與第一抗體染色同樣的條件下將經APC或Alexa647標記的抗IgG抗體與結合GT468的單克隆抗體結合。可使用流式細胞儀對這些樣品進行流式細胞分析，其使用光和側向散射性質來對單個活細胞設門。為了在單次測量中將GT468特異性單克隆抗體與非特異性結合物區分，可使用共轉染方法。可以如上所述對瞬時轉染編碼GT468和螢光標記之質粒的細胞進行染色。 可以在不同於抗體染色細胞的螢光通道中檢測經轉染細胞。由於大多數轉染細胞都表達所述兩種基因，因此GT468特異性單克隆抗體優先結合表達螢光標記的細胞，而非特異性抗體則以相當的比例與未轉染細胞結合。另一種使用螢光顯微鏡的測定可用作流式細胞術測定的補充或替代。可如上所述對細胞進行染色並利用螢光顯微鏡進行分析。免疫螢光顯微鏡為了測定經免疫小鼠的血清中存在抗GT468抗體或者單克隆抗體與表達GT468之活細胞的結合，可以使用免疫螢光顯微鏡分析。例如，在添加了 10%胎牛血清(FCS)、2mM L-穀氨醯胺、100IU/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的DMEM/F12培養基中的標準培養條件下，將自發表達GT468或轉染後表達GT468的細胞系以及缺乏GT468表達的陰性對照培養在腔室玻片上。然後，細胞用甲醇或甲醛固定或不做處理。隨後，可將細胞與針對GT468的單克隆抗體在25°C反應30分鐘。清洗後，可在同樣的條件下將細胞與經Alexa555標記的抗小鼠IgG第二抗體(Molecular Probes)反應。然後通過螢光顯微鏡對細胞進行分析。
可對經甲醇固定或甲醛固定並經Triton X-100透化的細胞中GI~468總水平進行觀察。可研究活細胞以及未經透化、甲醛固定的細胞中GT468的細胞表面定位。此外，可通過與緊密連接標記(如Z0-1)共同染色來分析靶向GT468的緊密連接程度。此外，可以對抗體結合效果以及GT468在細胞膜中的定位進行研究。Western 印跡還可通過Wfestern印跡來測試抗GT468IgG與GT468抗原的反應。簡言之，可製備來自表達GT468之細胞的細胞提取物和適當的陰性對照，並進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，將分離的抗原轉移到硝酸纖維素膜、封閉並用待測試的單克隆抗體進行檢測。可使用抗小鼠IgG過氧化物酶來檢測IgG結合併用ECL底物來顯影。免疫組化還可利用免疫組化來測試抗GT468的小鼠IgG與GT468抗原的反應，其採用本領域技術人員熟知的方式，例如使用經甲醛或丙酮固定的冰凍切片或經甲醛固定的石蠟包埋組織切片，所述切片均來自從例行外科手術期間的患者或者攜帶異種移植腫瘤的小鼠(其接種了自發表達GT468的細胞系或者在轉染GT468後)而得到的非癌組織或癌組織樣品。 對於免疫染色而言，可將與GT468反應的抗體一起孵育，隨後可根據供應商的說明與綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠或山羊抗兔抗體(DAKO) —起孵育。抗體的體外吞噬和細胞殺傷活性除了與GT468特異性結合，可測試抗GI~468抗體介導吞噬和殺死表達GI~468和/ 或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的能力。在測試體內模型前，單克隆抗體活性的體外測試將提供初步的篩選。抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)簡言之，可通過Ficoll Hypaque密度離心來純化來自健康捐贈者的多形核細胞 (PMN)、NK細胞、單核細胞、單個核細胞或其它效應細胞，隨後裂解紅細胞汙染物。清洗過的效應細胞可以在添加了 10%熱滅活胎牛血清的RPMI或作為替代地添加了 5%熱滅活人血清的RPMI中懸浮，並與經51Cr標記的表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的靶細胞混合(以不同的效應細胞對靶細胞的比例)。或者，可以用螢光增強配體(BATDA) 對靶細胞進行標記。可利用螢光計來測量從死細胞釋放出的帶有增強配體的高強度螢光銪螯合物。另一種替代技術可使用螢光素酶轉染進靶細胞。所加入的螢光黃可隨後被活細胞氧化。然後可加入不同濃度的經純化抗GT468IgG。使用不相關的人IgG作為陰性對照。根據所使用的效應細胞類型，測定可在37°C進行4 20小時。可以通過測量培養物上清液中的51Cr釋放或EuTDA螯合物的存在來測定樣品的細胞裂解。或者，可通過螢光黃氧化所導致的發光來測量活細胞。還可測試不同組合的抗GT468單克隆抗體，從而確定多種單克隆抗體是否增強細胞裂解。補體依賴性細胞毒作用(⑶C)使用多種已知的技術，可測試抗GT468單克隆抗體介導CDC的能力。例如，可採用本領域技術人員已知的方式從血液中獲得含補體的血清。可使用不同的方法來測定HiAb 的CDC活性。使用碘化丙錠(PI)排除測定(propidiumiodide exclusion assay)可例如測量51Cr釋放或者可評估膜通透性。簡言之，可清洗靶細胞，並且可將5 X 105/ml靶細胞與不同濃度的mAb在室溫下或在37°C孵育10 30分鐘。然後，可加入血清或血漿至終濃度為20% (體積/體積)，並37°C下孵育細胞20 30分鐘。可將每種樣品的所有細胞加至 FACS管中的PI溶液中。然後可使用FACSArray對該混合物立即進行流式細胞分析。在另一可替代的測定中，可利用貼壁細胞來測定CDC的誘導。在該測定的一個實施方案中，在測定M小時前接種細胞，其密度為組織培養平底微量滴定板每孔3 X IO4個細胞。次日，移除培養基，將細胞一式三份與抗體一起孵育。將對照細胞分別與生長培養基或含0. 2%皂甙的生長培養基一起孵育用以分別測定裂解背景和最大裂解。在室溫下孵育20 分鐘後，移除上清液並向細胞中加入含20% (體積/體積)人血漿或血清的DMEM(37°C預熱)，再於37°C孵育20分鐘。將每種樣品的所有細胞加入碘化丙錠溶液(10 μ g/ml)。然後，用含2. 5 μ g/ml溴化乙錠的PBS替換上清液，並使用Tecan Safire在600nm測量520nm 處激發的螢光。特異性裂解的百分比如下計算特異性裂解=(螢光樣品-螢光背景)/ (螢光最大裂解-螢光背景)X 100。利用單克隆抗體抑制細胞增殖為了測試啟動凋亡的能力，可以將抗GT468單克隆抗體例如與GT468陽性腫瘤細胞或經GT468轉染之腫瘤細胞在37°C—起孵育約20小時。可收穫這些細胞，用 Armexin-V (膜聯蛋白)結合緩衝液(BD biosciences)清洗，並與綴合有FITC或APC (BD biosciences)的Annexin V—起避光孵育15分鐘。可將每種樣品的所有細胞加入FACS 管中的PI溶液(PBS中10yg/ml)中，並立即通過流式細胞術進行評估(如上所述)。或者，可以用市售試劑盒檢測單克隆抗體對細胞增殖的一般性抑制。DELFIA細胞增殖試劑盒 (Perkin-Elmer，貨號AD0200)是一種非同位素型免疫測定，其基於對微量滴定板中增殖細胞DNA合成時摻入的5-溴-2』 -脫氧尿嘧啶(BrdU)的測量來實現。使用銪標記的單克隆抗體來檢測摻入的BrdU。為了能夠檢測抗體，使用Fix溶液將細胞固定並使DNA變性。未結合的抗體被衝掉，加入DELFIA誘導劑使銪離子從經標記抗體解離到溶液中，銪離子在溶液中與DELFIA誘導劑的組分形成高強度螢光螯合物。所測量的螢光(在檢測中應用時間分辨螢光分析(time-resolved fluorometry))與每孔細胞的DNA合成成比例。臨床前研究還可以使用與GT468結合的單克隆抗體在體內模型中測試(例如，在接種了表達 GT468之細胞系的攜帶異種移植腫瘤的免疫缺陷小鼠中，可能在轉染後)，以測定它們在控制表達GT468之腫瘤細胞生長中的功效。可在將表達GT468的腫瘤細胞異種移植進免疫功能低下的小鼠或其它動物中後使用本發明的抗體進行體內研究。可以將抗體施用給無腫瘤小鼠然後再注射腫瘤細胞，以測量該抗體對防止形成腫瘤或腫瘤相關症狀的效果。可以將抗體施用給荷瘤小鼠以測定各抗體對減少腫瘤生長、轉移或腫瘤相關症狀的療效。可以將抗體與其它物質(如細胞增殖抑制藥(cystostatic drug)、生長因子抑制劑、細胞周期阻斷劑、血管發生抑制劑或其它抗體)聯用，以確定組合的協同效果和潛在毒性。為了分析本發明抗體所介導的毒副作用，可用抗體或對照試劑接種動物並對可能與GT468抗體治療有關的症狀進行全程研究。體內應用GT468抗體的可能副作用尤其包括表達GT468的組織(包括胎盤)中的毒性。在人和其它物種(如小鼠)中識別GT468的抗體對於預測向人施用抗GT468單克隆抗體所介導的潛在副作用尤其有用。
表位作圖對本發明抗體所識別的表位作圖可按照「Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) "hj Glenn E. Morris ISBN-089603-375—9 以及「Epitope Mapping A Practical Approach"Practical Approach Series,248 by Olwyn M. R. ffestwood,Frank C. Hay中的詳細說明來進行。I.與GT468結合的雙特異/多特異性分子在本發明的另一個實施方案中，抗GT468抗體可以衍生成或連接至另一功能性分子(例如另一肽或蛋白質(例如，Fab'片段))以產生與多個結合位點或靶表位結合的雙特異性或多特異性分子。例如，本發明的抗體可以與一個或多個其它結合分子(如另一抗體、肽或結合類似物)功能性連接(例如，通過化學偶聯、基因融合、非共價相互作用等來實現)。因此，本發明包括雙特異性和多特異性分子，其包含至少一種針對GT468的第一結合特異性和針對第二靶表位的第二結合特異性。在本發明的一個具體實施方案中，所述第二靶位表位是Fc受體(例如人的Fc-γ RI (⑶64)或人的Fc-α受體(⑶89))或T細胞受體(例如⑶幻。因此，本發明包括能夠結合表達Fc- γ R、Fc- α R或Fc- ε R的效應細胞 (例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))以及表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的雙特異性和多特異性分子。這些雙特異性和多特異性分子可將表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞靶向至效應細胞，並可引發Fc受體介導的效應細胞活性(如吞噬表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞、抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)、細胞因子釋放或產生超氧陰離子。除了抗Fc結合特異性和抗GT468結合特異性以外，本發明的雙特異性和多特異性分子還包含第三結合特異性。在一個實施方案中，所述第三結合特異性是抗增強因子 (enhancement factor, EF)部分，例如與參與細胞毒性的表面蛋白結合從而增強了針對靶細胞的免疫應答的分子。「抗增強因子部分」可以是抗體、功能性抗體片段或與給定分子(例如抗原或受體)結合的配體，從而提高結合Fc受體或靶細胞抗原的效果。「抗增強因子部分」可結合Fc受體或靶細胞抗原。或者，所述抗增強因子部分可以結合與第一和第二結合特異性所結合之實體不同的實體。例如，抗增強因子部分可以結合細胞毒性T細胞(例如， 經由⑶2、⑶3、⑶8、⑶觀、⑶4、⑶40、ICAM-I或其它免疫細胞，從而增強針對靶細胞的免疫應答)。在一個實施方案中，本發明的雙特異性和多特異性分子包含至少一種抗體的結合特異性部分，包括例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv或單鏈Fv。所述抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體或其任意最小的片段(如Ladner等在US4，946，778中所述的Fv或單鏈構建體。所述抗體也可以是如US 2003/0118592和US 2003/0133939中所述的結合結構域免疫球蛋白融
合蛋白ο在一個實施方案中，本發明的雙特異性和多特異性分子包含針對效應細胞表面上存在的Fc- γ R或Fc- α R的結合特異性，以及針對靶細胞抗原(例如GT468)的第二結合特異性。在一個實施方案中，針對Fc受體的結合特異性由單克隆抗體提供，其結合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。本文使用的術語「IgG受體」是指位於1號染色體上的8個γ鏈基因。這些基因編碼總共12種跨膜或可溶性受體同工型，並被分成三類Fc-Y受體: Fc-γ RI (CD64)、Fc-γ RII (CD32)和 Fc-γ RIII (CD16)。在一個優選的實施方案中，Fc-γ 受體是人的高親合力Fc- y RI。產生和表徵這些優選的單克隆抗體由Fanger等在WO 88/00052以及US 4，954，617中描述。這些抗體與Fc-γ RI、Fc-y RII或Fc-γ RIII之表位的結合位點與 Fcy的受體結合位點不同，因此它們的結合基本上不被生理水平的IgG所阻斷。本發明中可用的特異性的抗Fc-YRI抗體包括mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。在另一些實施方案中，抗Fcy受體抗體是人源化形式的單克隆抗體22 (H22)。H22抗體的產生與表徵描述於 Graziano，R. F.等(1995) J. Immunol. 155(10) :4996-5002 以及 WO 94/10332 中。產生H22抗體的細胞系在1992年11月4日保藏於美國典型培養物保藏中心，其名稱為 HA022CL1，登記號為 CRL 11177。在另一些優選的實施方案中，針對Fc受體的結合特異性由與人IgA受體例如 Fc-Q受體(Fc-aRI (⑶89))結合的抗體提供，其結合優選地不被人免疫球蛋白A (IgA 抗體)所阻斷。術語「IgA受體」旨在包括位於19號染色體上的α-基因的基因產物 (Fe- α RI)。已知該基因編碼幾種替代性剪接跨膜同工型(55 IlOkDa)。Fc- α RI (CD89) 在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞上組成型表達，但不在非效應細胞群上表達。Fc-α RI對IgAl和IgA2均具有中等親合力，在暴露於細胞因子(如G-CSF或 GM-CSF)後該親合力增強(Morton，H. C 等(1996)CriticalReviews in Immunology 16: 423-440)。已描述了鑑定為A3、A59、A62和A77的四種Fc-aRI特異性單克隆抗體(其在 IgA 配體結合結構域外部與 Fc-a RI 結合)(Monteiro, R. C 等(1992) J. Immunol. 148 1764)。Fc-aRI和Fc-YRI是用於本發明中的優選誘發受體，這是因為它們(1)主要表達在免疫效應細胞(例如，單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞)上；(2)表達水平高(例如， 每個細胞上有5，000 100，000個)；(3)介導細胞毒性(例如ADCC、吞噬作用)；(4)介導增強的抗原(包括自身抗原)靶向於其的抗原呈遞。在另一個實施方案中，所述雙特異性分子由根據本發明具有互補功能活性的兩個單克隆抗體組成，例如一個抗體主要行使誘導CDC，而另一抗體則主要行使誘導細胞凋亡。本文使用的「效應細胞特異性抗體」是指與效應細胞的Fc受體結合的抗體或功能性抗體片段。本發明中使用的優選抗體與效應細胞之Fc受體結合的位點不與內源性免疫球蛋白結合。本文中使用的術語「效應細胞」是指參與免疫應答效應階段(而非免疫應答的識別和活化階段)的免疫細胞。免疫細胞的實例包括髓系或淋巴來源的細胞，例如淋巴細胞 (例如，包括細胞毒性T細胞(CTL)、殺傷細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、多形核細胞、粒性白細胞、肥大細胞和嗜鹼性粒細胞的B細胞和T細胞)。一些效應細胞表達特異性的Fc受體並具有特異性免疫功能。在一些優選的實施方案中，效應細胞能夠誘導抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)，例如中性粒細胞能誘導ADCC。例如， 表達FcR的單核細胞、巨噬細胞參與特異性殺死靶細胞以及將抗原呈遞給免疫系統的其它組分，或者與展示抗原的細胞結合。在另一些實施方案中，效應細胞可吞噬靶抗原、靶細胞或微生物。效應細胞上特定FcR的表達受到體液因素(如細胞因子)的調節。例如，已發現Fc-γ RI的表達被幹擾素Y (IFN-y)上調。這種增強的表達提高了具有Fc-γ RI之細胞針對靶標的細胞毒性。效應細胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶細胞。「靶細胞」應當指對象(例如，人或動物)中被本發明抗體所靶向的任何不良細胞。在一些優選的實施方案中，靶細胞是表達或過表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞。表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞通常包括腫瘤細胞。可使用化學技術(參見，例如D. M. Kranz 等(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 5807)、「polydoma」技術(參見US 4，474，893)或重組DNA技術來製備本發明的雙特異性和多特異性分子。特別地，使用本領域已知的方法，可通過結合組成型特異性(例如，抗FcR和抗 GT468的結合特異性)來製備本發明的雙特異性和多特異性分子。例如，可分別產生所述雙特異性和多特異性分子的每種結合特異性，然後彼此結合。當結合特異性是蛋白質或肽時，可使用多種偶聯劑或交聯劑用於共價結合。交聯劑的實例包括A蛋白、碳二亞胺、N-琥珀醯亞胺-S-乙醯-硫代乙酯(SATA)、5，5，-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯撐雙馬來醯亞胺(oPDM)、N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺酸琥珀醯亞胺-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷基-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)(參見例如Karpovsky 等(1984) J.Exp· Med. 160 :1686 ;Liu，MA 等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。 其它方法包括描述於 Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78，118-132) ； Brennan 等 (Science(1985) 229 :81-83)以及 Glennie 等(J. Immunol. (1987) 139 :2367-2375)中的方法。優選的結合試劑包括SATA和sulfo-SMCC，這兩種均可從Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)獲得。當結合特異性是抗體時，它們可通過兩條重鏈C端鉸鏈區的巰基鍵合而結合。在一個特別優選的實施方案中，在結合前，對鉸鏈區進行修飾使其包含奇數個巰基殘基，優選一個。或者，兩種結合特異性可以在同一載體中編碼並在同一宿主細胞中表達和組裝。 當雙特異性和多特異性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab，)2或配體XFab融合蛋白時，該方法尤其有用。本發明的雙特異性和多特異性分子(例如，雙特異性分子)可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體(包含一種單鏈抗體和結合決定區(binding determinant) 的單鏈雙特異分子，或者包含兩種結合決定域的單鏈雙特異性分子)。雙特異性和多特異性分子也可以是單鏈分子或者可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性和多特異性分子的方法描述在例如 US 5, 260, 203,US 5, 455, 030,US 4, 881, 175,US 5, 132, 405,US 5,091,513、 US 5，476，786、US 5，013，653、US 5, 258, 498 以及 US 5，482，858 中。雙特異性和多特異性分子與其特異靶標的結合可通過酶聯免疫吸附測定 (ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(例如生長抑制)或Western印跡測定來驗證。通常，這些測定中的每一種均通過使用特異性針對目標蛋白質-抗體複合物的經標記試劑(例如，抗體)來檢測目標蛋白質-抗體複合物。例如，所述FcR-抗體複合物可使用例如識別並特異結合該抗體-FcR複合物的酶聯抗體或抗體片段來檢測。或者，可使用多種其它免疫測定來檢測複合物。例如，可對抗體進行放射性標記並用於放射免疫測定 (RIA)(例如參見 Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays, Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniq ues,The Endocrine Society, 1986 年 3 月)中。 可通過例如使用Y-計數器或閃爍計數器等手段或通過放射自顯影來檢測放射性同位素。II.免疫綴合物另一方面，本發明涉及綴合有治療部分或藥劑(例如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性同位素)的抗GT468抗體。這種綴合物在本文中稱為「免疫綴合物」。包含一種或多種細胞毒素的免疫綴合物被稱為「免疫毒素」。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害特別是殺死細胞的任何藥劑。實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、 吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、 長春鹼、秋水仙鹼(colchicin)、阿黴素、柔紅黴素、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米託蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D、l_脫氫睪酮 (Ι-dehydrotestosterone)、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因(Iidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素及其類似物或同源物。用於形成本發明免疫綴合物的合適治療劑包括但不限於抗代謝物類(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉賓(fludarabin)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decartazine))、烷基化劑類(例如氮芥、塞替派丁酸氮芥(thio印a chlorambucil)、馬法蘭(melphalan)、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C和順式二氯二胺鉬 (II) (DDP)順鉬)、蒽環黴素類(例如柔紅黴素(其前身為道諾黴素)和阿黴素)、抗生素類(例如，更生黴素(其前身為放線菌素)、博來黴素、光輝黴素和氨茴黴素(anthramycin， AMC)以及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼和長春鹼)。在一個優選的實施方案中，所述治療劑是細胞毒性劑或放射毒性劑。在另一實施方案中，所述治療劑是免疫抑制劑。在又一實施方案中，所述治療劑是GM-CSF。在一個優選的實施方案中，所述治療劑是阿黴素、順鉬、硫酸博來黴素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環磷醯胺或蓖麻毒素A。本發明的抗體還可與放射性同位素綴合，例如碘-131、釔-90或銦-111，以產生細胞毒性放射性藥物用於治療GT468相關疾病(例如癌症)。本發明的抗體綴合物可用於修飾給定的生物應答，所述藥物部分不應理解為僅限於常規的化學治療劑。例如，所述藥物部分可以是具有理想生物活性的蛋白質或肽。這樣的蛋白質可包括例如具有酶促活性的毒素或其活性片段，例如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素；蛋白質，例如腫瘤壞死因子或幹擾素-Y ；或生物應答調節劑，例如淋巴因子、白介素-1( 「IL-1」)、白介素-2( 「IL-2」)、白介素-6( 「IL-6」)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(「GM-CSF」)、粒細胞集落刺激因子(「G-CSF」)或另一些生長因子。用於將這些治療部分與抗體綴合的技術是眾所周知的，參見，例如Arnon等， "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(編)，243-56 頁(Alan R.Liss，Inc.1985) ；Hellstrom 等，「Antibodies For Drug Delivery」，in Controlled Drug Delivery (胃二片反)，Robinson ^ ( IS ) ,623-53 M (Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review，，， in Monoclonal Antibodies ' 84 !Biological And Clinical Applications，Pinchera 等(編),475-506 M (1985) ；"Analysis, Results, And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」， in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin 等(編)，303_16 頁(Academic Press 1985)以及 Thorpe 等，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」，Immunol. Rev.，62 :119-58(1982)。在另一實施方案中，本發明的抗體與連接子-螯合劑(例如tiuxetan)結合，其允許所述抗體與放射性同位素綴合。III.藥物組合物另一方面，本發明提供了組合物，例如藥物組合物，其包含一種本發明抗體或本發明抗體的組合。根據常規技術(例如 Reminton :The Science and Practice of Pharmacy, 第 19 版，Gennaro 編，Mack Publishing Co.，Easton, PA, 1995)，所述藥物組合物可與可藥用載體或稀釋劑以及任何其它已知的輔藥和賦形劑一起配製。在一個實施方案中，所述組合物包含由多種(例如，兩種或更多種)經分離的本發明抗體組成的組合，其通過不同的機制起作用，例如，主要通過誘導CDC起作用的一種抗體與主要通過誘導細胞凋亡起作用的另一抗體聯用。本發明的藥物組合物還可與治療聯用，即與其它藥劑聯用。例如，所述聯合治療可包含本發明的組合物與至少一種抗炎劑或至少一種免疫抑制劑。在一個實施方案中，這樣的治療劑包括一種或多種抗炎劑，例如類固醇藥物或NSAID (非甾體抗炎藥)。優選的藥劑包括例如阿司匹林及其它水楊酸類、Cox-2抑制劑(例如羅非昔布(rofecoxib)(萬絡 (Vioxx))和塞來昔布(celecoxib)(西樂葆(Celebrex) ))、NSAID類(例如布洛芬(摩特林(Motrin)、阿德維爾(Advil))、非諾洛芬(fenoprofen)(苯氧布洛芬(Nalfon))、萘普生 (naproxen)(甲氧萘丙酸(Naprosyn))、舒林酸(sulindac)(奇諾力(Clinoril))、雙氯芬酸(diclofenac)(扶他林(Voltaren))、吡羅昔康(piroxican)(費啶(Feldene))、酮洛芬 (ketoprofen)(奧魯地(Orudis) )、二氟尼柳(diflunisal)(雙氟尼酸(Dolobid))、萘丁美酮(nabumetone)(瑞力芬(Relafen))、依託度酸(etodolac)(羅丁 (Lodine))、奧沙普秦 (oxaprozin) (Daypro)和吲哚美辛(吲哚新(Indocin)))。在另一實施方案中，這樣的治療劑包括導致調節性T細胞耗竭或功能失活的藥劑，如低劑量的環磷醯胺(cyclophosphamid)、抗CTLA4抗體、抗IL-2或抗IL-2受體的抗體。在又一實施方案中，這樣的治療劑包括一種或多種化療劑，例如紫杉醇衍生物、 泰索帝(taxotere)、吉西他濱、5-氟尿嘧啶、多柔比星(阿黴素)、順鉬(鉬)、環磷醯胺 (Cytoxan, Procytox, Neosar)。在另一實施方案中，本發明的抗體可與化療藥劑聯用，其優選地在患有乳腺癌、肺癌、胃癌和/或卵巢癌或其它癌症類型(例如本文所述的癌症類型) 的患者中表現出治療功效。在又一實施方案中，本發明的抗體可與放療和/或自體外周幹細胞或骨髓移植聯用。在另一實施方案中，本發明的抗體可與選自抗CD25抗體、抗EPCAM抗體、抗EGFR、 抗Her2/neu和抗⑶40抗體的一種或多種抗體聯用。在又一實施方案中，本發明的抗體可與抗C3b(i)抗體聯用以增強補體活化。本文使用的「可藥用載體」包括任何及所有生理相容性的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優選地，所述載體適於靜脈內、肌內、皮下、胃腸外、脊柱或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。根據施用途徑，所述活性化合物(即抗體、 雙特異性和多特異性分子)可用某種物質包被，以保護該化合物免受酸類及其它可能使該化合物失活的天然條件的作用。「可藥用的鹽」是指保留了所需的親本化合物生物活性且不表現任何不期望的毒性效應的鹽(參見，例如 Berge，S.M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。這些鹽的實例包括酸加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包括源自無毒無機酸的鹽，例如鹽酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、亞磷酸鹽等，以及來自無毒有機酸的鹽，例如脂肪單羧酸鹽和脂肪二羧酸鹽、苯基取代的烷酸鹽、羥基烷酸鹽、芳香酸鹽、脂肪族和芳香族磺酸鹽等。鹼加成鹽包括源自鹼土金屬的鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等，以及來自無毒有機胺的鹽，例如N，N』 - 二苯基乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺鹽、氯普魯卡因鹽、膽鹼鹽、二乙醇胺鹽、乙二胺鹽、普魯卡因鹽等。本發明的組合物可通過多種本領域已知的方法來施用。本領域技術人員應理解， 施用途徑和/或模式可根據所期望的結果而變化。所述活性化合物可與保護該化合物免於迅速釋放的載體(例如控釋製劑)一起製備，所述控釋製劑包括植入物、透皮貼劑和微囊遞送系統。可使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用於製備這樣製劑的方法一般是本領域技術人員已知的。參見，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J· R· Robinson編， Marcel Dekker, Inc.，New York，1978。為了通過某些施用方式來施用本發明的化合物，可能有必要使用防止該化合物失活的物質來包被該化合物或與該化合物一起施用。例如，所述化合物可以在合適的載體 (例如，脂質體或稀釋劑)中施用給受試者。可藥用的稀釋劑包括鹽水和含水緩衝溶液。脂質體包括水包油包水型CGF乳劑以及常規脂質體(Strejan等(1984) J. Neuroimmunol. 7 27)。可藥用的載體包括用於臨時製備無菌注射用溶液或分散劑的無菌水溶液或分散劑以及無菌粉末。使用這樣的針對藥物活性物質的介質和試劑是本領域已知的。除了與所述活性化合物不相容的常規介質或試劑以外，任何常規介質或試劑在本發明藥物組合物中的用途是在考慮範圍內的。還可將補充性活性化合物摻入所述組合物中。治療組合物通常在製備和儲存條件下須是無菌的且穩定的。所述組合物可配製成溶液、微乳(microemulsion)、脂質體或其它適合高濃度藥物的有序結構。所述載體可以是溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。可例如通過使用包衣(如卵磷脂)、通過維持分散劑中所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情形中，優選地，所述組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。延長吸收注射用組合物可以通過在該組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現。無菌注射用溶液可通過在合適溶劑中摻入所需量的活性化合物以及一種以上列舉之成分或其組合來製備，需要時，隨後進行滅菌微濾。一般地，分散劑通過在無菌運載體(vehicle)中摻入活性化合物來製備，所述運載體含有基礎分散介質以及所需的以上列舉之另一些成分。在用於製備無菌注射用溶液的無菌粉末的情形中，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，從其先前無菌過濾的溶液產生活性成分加任何其它所需成分的粉末。調整給藥方案以提供最佳的理想應答(例如，治療應答)。例如，根據治療情形的迫切程度，可施用單次團注(single bolus)，可施用隨時間的若干分次劑量，或者可成比例地減少或增加劑量。尤其有利的是，配製劑量單位形式便於施用以及使劑量均一的胃腸外組合物。本文使用的「劑量單位形式」是指對於待治療對象來說適合作為單次劑量的物理分散單位；每單位含有預定量的活性化合物，經計算其與所需的藥物載體一起產生預期的治療效果。本發明劑量單位形式的規格由以下因素決定或直接取決於以下因素(a)活性化合物的獨特特徵和待實現的特定治療效果，和(b)用於治療敏感型個體的活性化合物在化合方面的固有局限性。可藥用抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)，丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。對於治療組合物來說，本發明的製劑包括適於經口、經鼻、外用(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或胃腸外施用的製劑。所述製劑可以方便地以單位劑量形式呈現並可以通過藥物領域已知的任何方法來製備。可與載體物質聯用以產生單一劑型的活性成分的量將取決於待治療對象以及具體施用方式而變化。可與載體物質聯用以產生單一劑型的活性成分的量一般是產生治療效果的組合物的量。一般地，以100%計，所述活性成分的量從約0. 01 %至約99%，優選地從約0. 1 % 至約70 %，最優選地從約1 %至約30 %。本發明的適於陰道施用的製劑還包括陰道栓劑、衛生棉條、霜劑、凝膠劑、膏劑、泡沫劑或噴霧劑，其含有本領域已知的合適載體。用於外用或透皮施用本發明組合物的劑型包括粉末、噴霧劑、油膏劑、膏劑、霜劑、洗液劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑。所述活性化合物可在無菌條件下與可藥用載體以及所需的任意防腐劑、緩衝劑或推進劑混合。本文使用的短語「胃腸外施用」意指除腸內和外用施用以外的施用方式，通常通過注射來實現，其包括但不限於靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、 腹膜內、經氣管、皮下、角質下、關節腔內、包膜下、蛛網膜下、椎管內、硬膜外和胸骨下 (intrasternal)注射和輸注。可用於本發明藥物組合物中的合適的含水和非含水載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當的混合物、植物油(如橄欖油)和注射用有機酯類(如油酸乙酯)。可例如通過使用包衣物質(如卵磷脂)、通過維持分散劑中所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。這些組合物還可包含輔藥，如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌步驟以及通過包含多種抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇 (chlorobutanol)、苯酚山梨酸等)來防止微生物的存在。所述組合物中包含等滲劑(如糖、氯化鈉等)也是可取的。此外，注射用藥物形式的延長吸收可通過包含延長吸收的試劑 (如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。在一個實施方案中，本發明的單克隆抗體採用結晶形式通過皮下注射來施用，參見Yang等(2003)PNAS，100(12) :6934-6939.當本發明化合物作為藥物施用給人和動物時， 它們可以單獨施用或作為藥物組合物(含有例如與可藥用載體聯用的0. 01 99. 5% (更優選地，0. 1 90% )的活性成分)施用。不管選用何種施用途徑，通過本領域技術人員已知的常規方法，將本發明的化合物(其可採用合適的水合形式)和/或本發明的藥物組合物配製成可藥用劑型。本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以不同，從而獲得針對特定患者、組合物和施用模式的有效實現期望治療應答而對患者無毒性的活性成分的量。所選劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括本發明所應用具體組合物的活性、施用途徑、施用時間、所應用具體化合物的排洩速率、治療持續時間、與所應用具體組合物聯用的其它藥物、化合物和/或物質、年齡、性別、體重、病症、總體健康狀況和所治療患者的既往醫治史等醫學領域眾所周知的因素。具有本領域普通技術的醫生或獸醫可以容易地確定所述藥物組合物的所需有效量並開具處方。例如，醫生或獸醫一開始可以採用低於所需水平的藥物組合物中所應用本發明化合物的劑量，以實現期望的治療效果，並逐漸增加劑量直至達到預期效果。一般來說，本發明組合物的合適日劑量為有效產生治療效果之最低劑量的化合物量。這樣的有效劑量一般取決於上述因素。優選採用靜脈內、肌內、腹膜內或皮下方式施用，優選在鄰近靶部位處施用。需要時，治療組合物的有效日劑量可作為2次、3次、4次、5次、6次或更多次亞劑量分別施用(以一天中的合適間隔)，任選地，採用單位劑型。儘管本發明的化合物有可能單獨施用，但優選作為藥物製劑(組合物)來施用所述化合物。在一個實施方案中，本發明的抗體可通過輸注來施用，優選在較長時間內(例如超過M小時)緩慢持續輸注，以減少毒副作用。還可通過持續輸注2 M小時(如2 12小時)來進行施用。必要時，可重複該方案一次或多次，例如，在6個月或12個月後。可通過在生物樣品中施用後測量循環抗GT468單克隆抗體的量來確定或調整劑量，其通過使用靶向抗GT468抗體的抗獨特型抗體來實現。在另一實施方案中，所述抗體通過維持治療來施用，例如，在6個月或更長時間內
每周一次。在另一實施方案中，本發明的抗體可以通過包括以下步驟的方案來施用一次性輸注針對GT468的抗體，然後輸注綴合有放射性同位素的針對GT468的抗體。該方案可以在例如7至9天後重複。治療組合物可與本領域已知的醫療設備一起施用。例如，在一個優選的實施方案中，本發明的治療組合物可以與無針頭皮下注射設備一起施用，例如US 5，399，163、US 5，383，851、US 5，312，335、US 5，064，413、US 4，941，880、US 4，790，824 或 US 4，596，556 中所述的設備。可用於本發明的眾所周知的植入物和組件(module)的實例包括描述於以下文獻中的那些US 4，487，603，其公開了用於以受控速率配藥的可植入式微型輸注泵； US 4，486，194，其公開了用於通過皮膚施用藥物的治療設備；US 4，447，233，其公開了用於以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；US 4，447，224，其公開了用於連續藥物遞送的可變流量(variable flow)可植入式輸注裝置；US 4，439，196，其公開了具有多個腔室分區的滲透性藥物遞送系統；以及US 4，475，196，其公開了滲透性藥物遞送系統。許多其它這樣的植入物、遞送系統和組件是本領域技術人員所熟知的。在一些實施方案中，可以配製本發明的抗體以確保在體內正確分配。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水性的化合物。為了確保本發明的治療化合物能穿越血腦屏障(需要時)，可將它們配製在例如脂質體中。有關製備脂質體的方法，參見例如US 4，522，811、US 5，374，548 和US 5，399，331。脂質體可包含一個或多個選擇性運送到特定細胞或器官中並因此提高藥物靶向遞送的部分(參見例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29 :685)。靶向部分的實例包括葉酸或生物素(參見例如Low等的US 5，416，016)、甘露糖苷⑴mezawa等，(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 :1038)、抗體(P. G. Bloeman 等(1995)FEBS Lett. 357 140 ；M. Owais 等(1995)Antimicrob. Agents Chemother. 39 :180)和表面活性蛋白 A 受體 (Briscoe 等(1995)Am. J. Physiol. 1233 :134)。在本發明的一個實施方案中，本發明的治療化合物被配製在脂質體中。在一個更優選的實施方案中，所述脂質體包含靶向部分。在一個最優選的實施方案中，所述脂質體中的治療化合物通過團注注射至鄰近期望區域的部位(例如腫瘤部位)來遞送。所述組合物必須是達到易於注射之程度的流體。它必須在生產和儲存條件下是穩定的，並且必須針對微生物(如細菌和真菌)的汙染作用而進行防腐。在另一實施方案中，本發明的抗體可配製以防止或減少其穿越胎盤運送。這可以通過本領域已知的方法來實現，例如通過抗體的聚乙二醇化或通過使用F(ab)2』片段來實現。還可參考「Cunningham-Rundles C, Zhuo Ζ, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. "J. Immunol. Methods, 152 :177-190 ；Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74 279-283o有關腫瘤治療的「治療有效劑量」可通過目標腫瘤應答(可以是完全的或部分的) 來測量。完全應答(complete response, CR)被定義為無疾病的臨床、放射學或其它證據。 部分應答(partial response, PR)源於總的腫瘤體積減少了超過50%。進展的中間時間是表徵目標腫瘤應答持續時間的量度。有關腫瘤治療的「治療有效劑量」還可通過其穩定疾病進程的能力來測量。化合物抑制癌症的能力可以在動物模型系統中評價，其預示對人體腫瘤的功效。或者，組合物的這一特性可以通過利用本領域技術人員已知的體外測定來研究該化合物抑制細胞生長或細胞凋亡的能力而評估。治療有效量的治療化合物可以減少腫瘤的體積，或以其它方式緩解對象中的症狀。本領域普通技術人員能夠基於如下因素確定這樣的量對象的體積、對象症狀的嚴重程度以及所選的具體組合物或施用途徑。所述組合物必須是無菌的以及達到該組合物可利用注射器進行遞送之程度的流體。除了水以外，所述載體可以是等滲緩衝鹽溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當的混合物。適當的流動性可例如通過使用包衣(如卵磷脂)、通過維持分散劑所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑來維持。在許多情形中，組合物中優選地包含等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)以及氯化鈉。注射用組合物的長時間吸收可通過在該組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。當所述活性化合物被如上所述適當保護時，該化合物可以經口施用，例如，與惰性稀釋劑或可吸收食用載體一起施用。
IV.本發明的用途和方法本發明的抗體(包括免疫綴合物、雙特異性/多特異性物質以及本文所述的組合物及其它衍生物)具有多種治療用途，包括治療表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與 GT468締合之細胞參與的疾病。例如，所述抗體可施用給培養中的細胞(例如，體外或離體)，或施用給人類對象(例如，在體內)，以治療或預防如本文所述的多種疾病。本文使用的術語「對象」旨在包括人和非人動物，其響應於針對GT468的抗體。優選的對象包括患有可通過殺死患病細胞(尤其是特徵在於與正常細胞相比，GT468的表達模式改變和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之模式改變的細胞)而得以糾正或緩解之疾病的人類患者。例如，在一個實施方案中，本發明的抗體可用於治療患有致瘤性疾病(例如，特徵在於存在表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之腫瘤細胞的疾病，包括例如乳腺癌)的對象。可進行治療和/或預防的致瘤性疾病的實例包括所有表達GT468的癌症以及腫瘤實體，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。這些癌症可以處於早期、中期或晚期(例如，轉移)。在一個實施方案中，所述癌症疾病是肺中的轉移癌。本發明所述的藥物組合物和治療方法還可用於免疫或接種疫苗，以預防本文所述的疾病。在另一個實施方案中，本發明的抗體可用於檢測GT468或特定形式之GT468的水平，或者其膜表面上含有GT468之細胞的水平，然後可將上述水平與如上面所述的某些疾病或疾病症狀建立關聯。或者，所述抗體可以用於清除表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞或與其相互作用，從而暗示這些細胞成為疾病的重要介導物。這可以通過使樣品和對照樣品與抗GT468抗體在允許抗體和GT468之間形成複合物的條件下接觸來實現。檢測抗體和GT468之間形成的任何複合物並在樣品和對照樣品(即參照樣品) 中進行比較。可最初測試本發明抗體與治療或診斷用途有關的體外結合活性。例如，可使用本文所述的流式細胞測定來測試所述抗體。此外，可以測定抗體誘導至少一種效應物介導之效應細胞活性(包括抑制表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的生長和/或將其殺死)的活性。 例如，可測定所述抗體誘導CDC和/或細胞凋亡的活性。本文中描述了測定CDC、同質性粘附、分子聚簇(molecular clustering)或細胞凋亡的操作步驟。本發明的抗體可用於在體內或體外引起一種或多種以下的生物活性抑制表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的生長和/或分化；殺死表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞；在效應細胞存在下，介導表達GT468和/ 或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的吞噬作用或ADCC ；在補體存在下，介導表達 GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的⑶C ；介導表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的細胞凋亡；誘導同質性粘附；和/或誘導結合GT468 後的易位進脂筏。在一個具體的實施方案中，所述抗體用於在體內或體外治療、預防或診斷多種 GT468相關疾病。GT468相關疾病的實例包括癌症，如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，癌症疾病是肺中的轉移癌。在體內和體外施用本發明抗體組合物的合適途徑是本領域眾所周知的，並可以由本領域普通技術人員來選擇。如上所述，本發明的抗GT468抗體可以與一種或其它多種治療劑(例如，細胞毒性劑、放射毒性劑、抗血管發生劑或/和免疫抑制劑)一起施用，以降低針對本發明抗體的免疫應答。所述抗體可與所述試劑連接(作為免疫複合物)或可與所述試劑單獨施用。在後一種情形中(單獨施用)，所述抗體可以在所述試劑施用前、後或同時施用，或者可以與另一些已知治療(例如抗癌療法，如放療)共同施用。這樣的治療劑包括抗腫瘤劑(如以上列出的)等。將本發明的抗GT468抗體與化療藥劑共同施用提供了兩種抗癌藥劑，其通過不同的機制產生針對腫瘤細胞的細胞毒作用。這種共同施用可以解決由於腫瘤細胞發生耐藥性或抗原性改變使其對抗體不發生反應所導致的問題。在本發明的另一具體實施方案中，另外使用抗血管發生劑(包括靶向VEGF或 VEGFR的抗體)以及一種或多種抑制血管發生的化合物對施用所述抗體的對象進行治療。 用這些藥物進行預先治療或平行應用可改善抗體對實體腫瘤(bulk tumor)的穿透。在本發明的另一具體實施方案中，另外使用抑制生長因子受體信號傳導的化合物 (包括與EGFR受體結合的單克隆抗體以及抑制由EGFR、Herl或Her2/neu受體啟動之信號傳導的化合物)對施用所述抗體的對象進行治療。靶標特異性效應細胞(例如與本發明組合物(例如抗體、多特異性和雙特異性分子)結合的效應細胞)也可用作治療劑。用於靶向的效應細胞可以是人的白細胞例如巨噬細胞、中性粒細胞或單核細胞。另一些細胞包括嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞和其它具有 IgG受體或IgA受體的細胞。需要時，可以從待治療的對象獲得效應細胞。所述靶標特異性效應細胞可作為生理可接受溶液中的細胞懸浮物來施用。所施用的細胞量可以在108 109數量級，但根據治療目的而變化。一般地，該數量將足以實現在靶細胞(例如表達GT468 和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞)上定位並通過例如吞噬作用殺死細胞。 施用途徑也可以改變。用靶標特異性效應細胞治療可與其它除去靶細胞的技術一起進行。例如，使用本發明組合物的抗腫瘤治療和/或帶有這些組合物的效應細胞可以與化療聯用。此外，針對腫瘤細胞排斥，可使用聯合免疫療法指導兩種獨特的細胞毒性效應物群體。例如，抗GT468 抗體與抗Fc-RI或抗CD3連接可用於與IgG受體或IgA受體特異性結合劑聯用。本發明的雙特異性和多特異性分子還可用於調節效應細胞上的Fc- Y R或Fc- α R 水平，例如通過對所述細胞表面上的受體加帽(capping)或清除來實現。抗Fc受體的混合物也可用於這一目的。具有補體結合位點(例如來自IgGl、-2或-3或IgM的結合補體的部分)的本發明組合物(例如，抗體、多特異性和雙特異性分子以及免疫綴合物)也可以在補體存在下使用。在一個實施方案中，使用本發明的結合劑和適當的效應細胞來離體治療包含靶細胞的細胞群可以補充添加補體或含補體的血清。包被有本發明結合劑的靶細胞的吞噬作用可以通過與補體蛋白結合來改善。在另一實施方案中，包被有本發明組合物的靶細胞也可以被補體裂解。在另一實施方案中，本發明的組合物不激活補體。本發明的組合物也可以與補體一起施用。因此，包含抗體、多特異性或雙特異性分子以及血清或補體的組合物也涵蓋在本發明的範圍內。這些組合物的優勢在於補體位於緊鄰抗體、多特異性或雙特異性分子的位置。另外，本發明的抗體、多特異性或雙特異性分子以及補體或血清可單獨施用。本發明組合物與靶細胞的結合可導致GT468抗原-抗體複合物易位至細胞膜的脂筏中。這種易位形成了高密度的抗原-抗體複合物，其可有效地激活和/或增強CDC。包含本發明抗體組合物(例如，抗體和免疫綴合物)以及使用說明書的試劑盒也涵蓋在本發明的範圍內。所述試劑盒還可包含一種或多種額外的試劑，如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射毒性劑，或者一種或多種額外的本發明抗體(例如，具有互補活性的抗體)。因此，用本發明抗體組合物進行治療的患者還可施用(在施用本發明抗體之前、 同時或之後)另一治療劑，如增強或提高本發明抗體療效的細胞毒性劑或放射毒性劑。在另一些實施方案中，所述對象還可以額外地用調節(例如增強或抑制)Fc-Y受體或Fc-α受體表達或活性的藥劑來治療，其通過例如用細胞因子治療對象來實現。優選的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、 幹擾素-Y (IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。其它用於提高本文所述抗體和藥物組合物之治療效果的重要試劑有葡聚糖，其是由多種植物和微生物(例如，細菌、藻類、真菌、酵母和穀物)產生的支鏈葡萄糖殘基的均一多糖(homopolysaccharide)。也可使用生物體產生的葡聚糖片段。優選地，葡聚糖是β (1,3)葡萄糖的多聚物，其中至少某些骨架葡萄糖單位(例如3 6%的骨架葡萄糖單位)具有分支(如β (1，6)分支)。在一個具體的實施方案中，本發明提供了用於檢測樣品中GT468抗原的存在或測量GT468抗原的量的方法，其包括在允許抗體或其部分與GT468之間複合物形成的條件下， 使樣品和對照樣品與特異性結合GT468的抗體接觸。然後，檢測複合物的形成，其中與對照樣品相比，樣品間不同複合物形成指示樣品中GT468抗原的存在。在另一個實施方案中，本發明提供了用於在體內或體外檢測表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的存在或對其定量的方法。該方法包括(i)向對象施用綴合有可檢測標記的本發明組合物；以及(ii)檢測對象中的所述可檢測標記，以鑑定含有表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的區域。上述方法可用於尤其是診斷GT468相關疾病和/或GT468相關疾病(如癌症疾病)的定位。優選地，樣品中GT468的量高於對照樣品中GT468的量指示樣品所來源的對象(尤其是人)中存在GT468相關疾病。在如上文所述的方法中使用時，可以為本文所述的抗體提供發揮以下功能的標記(i)提供可檢測的信號；(ii)與第二標記相互作用，以修飾第一或第二標記提供的可檢測信號，例如FRET(螢光共振能量轉移)；(iii)通過電荷、疏水性、形狀或其他物理參數影響遷移率，例如電泳遷移率，或(iv)提供捕獲部分，例如親合力、抗體/抗原或離子絡合作用。適合作為標記的是例如以下的結構螢光標記，發光標記，生色團標記，放射性同位素標記，同位素標記(優選地是穩定的同位素標記)，同重素標記(isobaric label)，酶標記，顆粒標記(尤其是金屬顆粒標記、磁顆粒標記、聚合物顆粒標記)，小有機分子如生物素，受體的配體或結合分子如細胞粘附蛋白或凝集素，包含可以通過使用結合試劑等來檢測的核酸和/或胺基酸殘基的標記序列。標記以非限制性的方式包括硫酸鋇，碘西他酸，碘番酸，胺碘苯丙酸鈣(calcium ipodate)，泛影酸鈉，泛影葡胺，甲泛葡胺，丁醯碘泛酸鈉和放射性診斷劑，包括正電子發射體如氟-18和碳-11，Y發射體如碘-123、鎝-99m、碘-131和銦-111， 用於核磁共振的核素，如氟和釓。在另一實施方案中，本發明的免疫綴合物可用於將化合物(例如，治療劑、標籤、 細胞毒性劑、放射毒性劑、免疫抑制劑等)靶向至其表面與GT468相關的細胞，其通過將所述化合物與抗體連接來實現。因此，本發明還提供了用於離體或體內定位表達GT468和/ 或特徵在於其細胞表面與GT468締合的細胞(如循環腫瘤細胞)的方法。以下實施例對本發明進一步舉例說明，其不應被解釋為限制本發明的範圍。
實施例實施例1 材料和方法本文提及的技術和方法以眾所周知的方式以及如Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2 IK (1989)Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N. Y中所述或如下所述來進行。所有的方法包括試劑盒和試劑的使用均按照製造商的信息來進行。組織和細胞系重組DNA工作得到官方許可並依照liheinland-Pfalz州政府的規定進行。組織來自於在例行診斷或治療過程中得到的人的剩餘材料並儲存於_80°C備用。乳腺癌細胞系 MCF-7 和 BT549 在 DMEM/10% FCS 中培養。RNA 的分離、RT-PCR 和實時 RT-PCR如前所述(Koslowski, M. ， Sahin, U. ， huber, C. & Tureci， 0. (2006) Hum. Mol. Genet. 15，2392-2399)進行RNA提取、第一鏈cDNA合成、RT-PCR和實時RT-PCR。對於終點分析來說，在35個循環的RT-PCR中使用GT468-特異性寡核苷酸(有義5，-AAA TTT GGC AGC TGC CTT CAC-3，；反義 5，-TGA TGC CAC ATT CAG TAA CAC-3，，60°C退火)。在 40 個循環的RT-PCR中一式三份進行實時定量表達分析。與HPRT (有義5，-TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA-3，；反義 5，-GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT-3，，62°C退火)進行歸一化後，使用 ΔΔ CT計算對腫瘤樣品中的GT468轉錄物相對於正常組織進行定量。PCR反應的特異性通過從任意選擇的樣品中克隆和測序擴增產物而得到驗證。生物信息學針對滋養層細胞特異性分子的電子克隆(in silico cloning)，對在別處詳述的數據採集策略進行修改和調整(Koslowski, Μ.，Bell, C, Seitz, G.，Lehr, H. Α.，Roemer, K. ，Muntefering, H. ，Huber, C, Sahin, U. & Tureci， 0. (2004) Cancer Res. 64,5988-5993 ； Koslowski,Μ. ,Tureci,0. ,Bell,C,Krause,P. ,Lehr,H. Α. ,Brunner,J. ,Seitz,G. ,Nestle, F. 0. ，Huber, C. & Sahin， U. (2002)Cancer Res. 62,6750-6755 ；Koslowski, M. ， Sahin, U.， Huber, C. & Tureci，0. (2006)Hum. Mol. Genet. 15,2392-2399)。簡言之，將 GenBank 的分級關鍵詞檢索與數位化的cDNA文庫消減結合。對於關鍵詞檢索來說，使用ENTREZ檢索和檢索系統(Retrieval System) (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/Entrez)訪 |、n] GenBank 白勺 Ρ Sl ·歹[J JC U # JJc注釋為特異性表達在胎盤或滋養層組織中的基因。隨後，使用序列同源性檢索程序 BLASTN(http://ncbi. nlm. nih. gov/blast)將每個核苷酸序列與所有的人核苷酸序列進行比對以防冗餘。作為第二道篩選，針對所有克隆進行了電子Northern (eNorthern)，其通過關鍵詞檢索由對每個目的基因進行針對NCBI之EST資料庫的BLAST檢索(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)而獲得。需要考慮到的是，在公共區域中的某些cDNA文庫未得至時合當的注釋(Scheurle, D. ，De Young, Μ. P. ，Binninger, D. Μ. ，Page, H. ，Jahanzeb, Μ. & Narayanan, R. (2000)Cancer Res. 60，4037-4043)。對於數位化消減來說，使用了 NCBI中的癌症基因組解剖計劃的cDNA xProfiler 工具(http://cgap. nci. nih. gov/Tissues/xProfiler)，其用於比較 cDNA 文庫的兩個集合 (A和B)的基因表達，其中每個集合可以是單一文庫或若干文庫。集合A和集合B的檢索選項設置為「人(Homo Sapiens)」(針對「生物體」)和「所有EST文庫」(針對文庫組合)以檢索dbEST中的所有cDNA文庫。從胎盤和滋養層組織製備的與檢索選項匹配的所有cDNA 文庫與排除了混合組織文庫的集合A進行比對。對於集合B來說，選擇從除了胎盤、滋養層細胞、睪丸、卵巢及完整胎兒以外的正常組織製備的所有cDNA文庫。使用EMBOSS CpGPlot 軟體(Rice, P.，Longden, I. & Bleasby，A. (2000) Trends Genet. 16，276-277)對 61^468 啟動子區域進行分析。另外，使用 MEMSAT3 (Jones, D. Τ.， Taylor， W. R. & Thornton， J. Μ· (1994) Biochemistry 33,3038-3049) > TMpred(Hofmann, K. & Stoffel, W. (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374,166)和 GOR IV(Gamier, J., Osguthorpe, D. J. & Robson, B. (1978) J. Mol. Biol. 120,97-120)分析 GT468 的蛋白序列。抗血清、免疫螢光和免疫化學通過定製抗體服務(Squarix，Marl, Germany)得到針對GT468的胺基酸117-127 產生的多克隆抗血清。按照製造商的說明，使用VECTOR NovaRED Substrate試劑盒 (Vector, Burlingame, CA)對組織冰凍切片進行免疫組化分析。對於^festern印跡分析來說，使用從Triton-X裂解之細胞提取的30yg總蛋白。提取物在還原型樣品緩衝液(Roth， Karlsruhe, Germany)中稀釋，進行 SDS-PAGE，隨後電轉移到 PVDF 膜(Pall，Easthills, NY)上。使用與 pAKT(Cell Signaling, Danvers, MA) ,AKT(Cell Signaling, Danvers,ΜΑ), 細胞周期蛋白 Dl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)和 β-肌動蛋白(Abeam, Cambridge, UK)反應的抗體進行免疫染色，隨後用綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗小鼠和山羊抗兔的第二抗體(Dako，Glostrup，Denmark)檢測第一抗體。siRNA 雙鏈體GT468 的 siRNA 雙鏈體 ^jiagen，Hilden，Germany)(有義 5，-r (CCA UGA GAG UAG CCA GCA)dTdT-3，，反義 5，-r (UUG CUG GCU ACU CUC AUG G)dAdG_3，)靴向 GT468mRNA 序列(NM_021796. 3)的670 690位核苷酸。使用亂序siRNA雙鏈體(有義5，-r (UAA CUG UAU AAU CGA CUA G) dTdT-3，，反義 5，-r (CUA GUC GAU UAU ACA GUU A)dGdA_3，)作為對照。對於GT468沉默研究來說，按照製造商的說明使用HiPerfect轉染試劑Oliagen)用 IOnM siRNA雙鏈體轉染細胞。使用另一組靶向342 362位核苷酸的GT468siRNA雙鏈體 (有義 5』-r (GGU UCA GGA CAA AGU CCA A) dTdT-5，，反義 5，_r (UUG GAC UUU GUC CUG AAC C)dGdG-3，)再現了所有結果。轉染siRNA後的細胞增殖分析
轉染siRNA雙鏈體M小時後，將IX IO4細胞在添加了 10% FCS的培養基中培養 48小時。根據製造商的說明使用DELFIA細胞增殖試劑盒(Perkin Elmer，Boston，MA)，利用WallacVictor2多標計數儀(PerkinElmer，Boston, ΜΑ)，通過測量摻入新合成的DNA鏈的BrdU來分析增殖。細胞周期分析細胞以不同濃度培養在添加了 10% FCS的培養基中。轉染siRNA雙鏈體72小時後，收穫細胞並進行乙醇固定，在進行流式細胞DNA含量分析之前用碘化丙錠染色。使用 CellQuest Pro (BD，Franklin Lakes, NJ)和 Flow Jo (Tree Star, Ashland, OR)流式細胞分析軟體對處於細胞周期不同階段的細胞進行定量。通過在siRNA轉染後48小時和72小時進行ArmexinV染色來對凋亡細胞進行定量。細胞遷移和體外侵入測定細胞遷移測定在帶有8. Ομπι孔膜的 transwell 小室(BD Biosciences, San Jose, CA)中進行，在試驗前將細胞培養在無血清培養基中12小時。對於siRNA實驗來說，細胞在如上所述的siRNA雙鏈體轉染M小時後被轉移到無血清條件下。將含有4X IO4細胞的400 μ 1無血清培養基加入上層小室。下層小室含有800 μ 1添加了 5% FCS的培養基作為趨化劑。M小時後，用冰冷的甲醇固定遷移到膜下側的細胞；切下膜，置於顯微鏡玻片上並用Hoechst (Dako，Glostrup, Denmark)封片用於螢光顯微鏡分析。對每個膜的5個隨機視野(100倍放大)中的細胞計數。所有實驗均一式三份進行。使用同樣的實驗裝置， 將趨化劑加至小室的上層和下層，對細胞的化動性(chemokinesis)進行分析。對於體外侵入測定來說，上層小室中備有100 μ 1的用無血清培養基稀釋至lmg/ml的Matrigel (BD Biosciences, San Jose, NJ)。小室在37°C孵育5小時後用於凝膠化(gelling)。與抗體孵育後的細胞增殖分析內源性表達 GT468 的癌細胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、MCF-7 和 MDA-MB-231 與雜交瘤上清液(用DMEM細胞培養基以1 2稀釋)孵育72小時。根據製造商的說明使用DELFIA細胞增殖試劑盒(Perkin Elmer, Boston, ΜΑ)，利用WalIacVictor2多標計數儀 (Perkin Elmer)，通過測量摻入新合成的DNA鏈中的BrdU來分析增殖。或者，分別將內源性表達GI~468的癌細胞系SK-BR-3和MCF-7與經HPLC純化的雜交瘤上清液(用DMEM細胞培養基稀釋至所示濃度)孵育72小時或120小時。如上所述分析增殖。或者，分別將內源性表達GT468的癌細胞系SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468和作為對照的GT468陰性黑色素瘤細胞系MelHo與稀釋在DMEM(SK_BR_3、MCF-7、MDA-MB-468) 或RPMI (MelHo)細胞培養基中的經FPLC純化的雜交瘤上清液(10 μ g/ml和50 μ g/ml) 孵育72小時。根據製造商的說明使用DELFIA細胞增殖試劑盒(Perkin Elmer)，利用 WallacVictor2多標計數儀(Perkin Elmer)，通過測量摻入新合成的DNA鏈中的BrdU來分析增殖。免疫螢光顯微術使用免疫螢光顯微術分析來證實經免疫小鼠的血清中抗GT468抗體的存在或者單克隆抗體與表達GT468之活細胞的結合。將用GT468-eGFP轉染的CHO細胞在標準培養條件下(在添加了 10%胎牛血清(FCS)、2mM L-穀氨醯胺、100IU/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的DMEM/F12培養基中)培養在腔室玻片上。然後，用甲醇或甲醛/0. 皂苷固定細胞。在25°C，將細胞與抗GT468抗體一起孵育60分鐘。清洗後，在同樣的條件下，將細胞與標記有Alexa555的抗小鼠IgG第二抗體(Molecular Probes) 一起孵育。GT468 肽特異性 ELISA在37 °C，用相應的 61^468 肽(5 或 10 μ g/ml)包被 MaxiSorp 或 Microwell 板 (Nunc)I小時。在4°C，用PBS 3% BSA封閉過夜。用PBS清洗後，向板中添加雜交瘤上清液 (用 PBS/3% BSA 以 1 5 或 1 10 稀釋，或用在 2XPBS/6% BSA，pH 7. 3 以 1 2 稀釋) 或純化的抗體(在PBS/3% BSA, pH 7. 3中稀釋為1 μ g/ml)並在室溫下孵育1小時(以 90rpm進行軌道振搖)。用PBS清洗後，加入在PBS 3% BSA，pH7. 3中的第二抗體(綴合有 HRPO 的山羊抗小鼠 IgG，亞類 l+h+2b+3，Jackson Immunoresearch)，並在室溫下以 90rpm 軌道振搖培養1小時。使用PBS的最後一次清洗步驟後，加入由IOOmM醋酸鈉(pH 5. 2)中 ImM或1.5mM ABTS組成的底物溶液。在使用前，臨時在底物溶液中補充0. 3 μ 1/ml的30% H202。30 60分鐘後，使用Tecan Safire Plate讀數儀(Tecan)來測量405nm處的吸光值。產生人的抗GT468單克隆抗體之雜交瘤的產生基於標準操作，從先前使用下文所述不同免疫方案進行免疫的動物中分離小鼠的脾並在PEG存在下與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然後，使用肽特異性ELISA、GT468CrELISA以及通過IF轉染GT468-eGFP的CHO細胞來篩選所得到的產生GT468特異性免疫球蛋白的雜交瘤。將來自於免疫小鼠的脾淋巴細胞單細胞懸液與P3)(63Ag8U. 1非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1597)(或在56-4A-2和62-9B-1的情況下為P3X63Ag8. 653小鼠骨髓瘤細胞(ATCC, CRL 1580))以 2 1 的比例用 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641) 進行融合。細胞以約3X IO4/孔在平底微量滴定板上鋪板，隨後是在含10%胎牛血清、2% 雜交瘤融合和克隆添加物(HFCS，Roche Diagnostics, CRL 1 363 735)外加 lOmMHEPES、 0. 055mM 2-巰基乙醇、50 μ g/ml慶大黴素和IXHAT (Sigma，CRL H0262)的選擇性培養基中孵育兩周。10天至14天後，利用肽特異性ELISA篩選各孔中的抗GT468單克隆抗體。對分泌抗體的雜交瘤重新鋪板，如果仍是抗GT468單克隆抗體陽性的，則通過有限稀釋進行亞克隆。然後，將穩定的亞克隆進行體外培養以得到組織培養基中少量的抗體用於表徵。從每個雜交瘤中至少選擇一個保留了親本細胞反應性(通過ELISA和IF)的克隆。從雜交瘤上清液中純化單克隆抗體使用HiTrap MabSelect SuRe ，通過進行單步驟親和層析，從雜交瘤上清液中製備抗體。用IOOmM檸檬酸鹽(pH 3. 0-ρΗ 4. 0，取決於抗體同種型)洗脫後，立即用IM Tris, PH 8.0中和收集到的級分。為了進一步進行實驗，將抗體製備物以5L PBS透析兩次，無菌過濾(0.2μπι)並儲存於4°C下。分型為了對雜交瘤上清液分型，按照製造商所述，使用IsoStrip小鼠單克隆抗體分型試劑盒(Roche)。使用表達GT468之細菌裂解物的粗裂解物進行CrELISA 抗原的製備
用GT468pQE質粒或非插入型pQE (後文中稱為「參考」)轉化大腸桿菌XLOLR細菌，並在LB培養基中培養至A600納米 0，35E。用2mMIPTG誘導蛋白表達，使細胞在37°C 再培養4小時。利用考馬斯凝膠分析監測蛋白表達的適當誘導及其動力學。將細菌旋轉沉降，並用含有0. 2mM蛋白酶抑制劑AEBSF鹽酸鹽(AppliChem)的少量體積PBS (pH 7. 2)中再次懸浮。細胞置於冰上並用超聲(Branson Sonic Power A Smithkline)破碎。將GT468 和參考裂解物稀釋至含0. 2mM AEBSF和20% (體積/體積)甘油的PBS中的總蛋白濃度為 2mg/ml。將等分樣品用液氮速凍並存放在_70°C備用。 酶聯免疫吸附測定使用前，將GT468以及參考裂解物稀釋於包被緩衝液(lOOmMHEPES，pH 7. 2)中，然後轉移至平底F96 Maxisorp微孔板(50 μ 1/孔，Nunc)，並在37°C吸附2小時。抗原固定後，用含0. 吐溫20的清洗緩衝液(50mM Tris，150mM氯化鈉，pH 7. 2) 清洗板兩次，然後用不含去汙劑的清洗緩衝液清洗兩次。每孔中加入50ml 1 100稀釋的人血清，並在軌道搖床上室溫孵育1小時。在一些實驗中，人血清在進行測定之前要進行預處理。每種人血清樣品都在包被有GT468或參考裂解物的孔中一式兩份平行測試。如上所述再次清洗板，並與用含50mM HEPES (pH 7.4)的3% (重量/體積)奶粉以1 5000稀釋的50 μ 1/孔的第二抗體(山羊抗人IgG-APDianova)室溫孵育1小時。在室溫下，用100 μ 1/ 孔的底物溶液[2mg 每毫升 ALP 緩衝液(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)含 4-銷基苯基磷酸二鈉鹽六水合物(Merck)]使板顯影30分鐘，立即用微板讀數儀(Victor2 ffallac, Perkin-Elmer, Turku, Finland) 讀取405nm 處的吸光值。流式細胞術分析收穫轉染有GT468pcDNA3. 1或非插入型質粒(模擬)的HEK293細胞，用冰冷甲醇固定，並用PBS/10% FCS封閉30分鐘。細胞與雜交瘤上清液孵育1小時，用PBS/1FCS清洗兩次，每次10分鐘，與山羊抗小鼠Cy3第二抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)
一起孵育。另外，收穫用GT468質粒DNA或無插入的質粒(模擬)轉染的HEK293細胞或者 SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468、NUG-C4 細胞，並用 PBS/5% FCS/0. 疊氮化鈉封閉。將細胞與稀釋於PBS/5% FCS/0. 疊氮化鈉中5ug/ml純化的抗體或雜交瘤上清液一起孵育1 小時，用PBS/5% FCS/0. 疊氮化鈉進行3次5分鐘的清洗，並與山羊抗小鼠APC第二抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories) 一起孵育。使用來自 Becton Dickinson 的 FACSarray分析細胞。克隆形成實驗克隆形成實驗或集落形成實驗是分析單個細胞生長成為集落之能力的體外細胞存活實驗。進行該實驗來測定GT468抗體對集落產生能力的效力。將表達GT468的SK-BR-3 細胞接種於48孔板(2000個細胞/孔)中。允許細胞在FPLC純化的來自雜交瘤上清液的抗體(45μ g/ml)存在下生長2周，所有實驗一式三份進行。將集落固定並用6%戊二醛(體積/體積)和0. 5%結晶紫(重量/體積)染色。使用Olympus小型數位相機(C-750Ultra Zoom)從經染色和乾燥的平板獲得圖像，並目測分析。Western 印跡
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使用基於1Triton-X的裂解緩衝液(50mM HEPES (pH 7. 4),10% (體積/體積)甘油，(體積 / 體積)Triton X-100,150mM NaCl, 1. 5mM MgCl2, 5mM EDTA, IOOmM NaF)來製備轉染有GT468pcDNA3. 1或非插入型質粒(模擬)的HEK293細胞的全細胞裂解物。提取物在還原型樣品緩衝液中(Roth)稀釋，進行SDS-PAGE並電轉到PVDF膜(Pall)上。使用與GT468反應的多克隆抗體(Koslowski等2007)或來自雜交瘤上清液的FPLC純化的抗體(5yg/ml)進行免疫印跡，然後用綴合有辣根過氧化物酶的山羊抗兔第二抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories)檢測第一抗體。早期處理異種移植物(xenograft)模型將5X106個GT468陽性BEWO胎盤絨毛膜癌細胞皮下注射進裸鼠中。接種腫瘤細胞後3天，用純化的單克隆抗體QOO μ g靜脈注射，每組8隻動物)處理動物。每周兩次給予抗體，持續2周。使用卡尺監測腫瘤生長。實驗性轉移實驗注射雌激素依賴性MCF-7細胞之前一周，通過皮下植入17 β -雌二醇長期釋放丸(lmg，60天釋放；Innovative Research of America)來製備無胸腺的裸鼠。靜脈注射 IX IO6個MCF-7細胞後，用純化的單克隆抗體QOOyg) —周兩次處理動物。注射細胞五周後，使用實時PCR對無胸腺小鼠(每組5-8隻動物)肺中的腫瘤負荷進行定量。使用QIAamp DNA Mini試劑盒Oliagen)提取來自肺組織的DNA，並從200ng DNA中擴增人17號染色體 α -衛星區的 226bp 片段(有義 5，-CAG CTG ACT AAA CAG AAG CAG-3，；反義 5，-GAG TTG AAT GCA GTC ATC ACA G_3，)。參照來自正常對照小鼠的正常肺，定量腫瘤負荷(DNA拷貝數)。實施例2 :GT468在多種腫瘤中異常活化並且高度表達為了鑑定胎盤特異性滋養層細胞基因，對全基因組數據採集策略進行了改動，該策略是我們曾為電子鑑定生殖細胞特異性分子而開發的(Koslowski，Μ.，Bell, C，Seitz, G. , Lehr, H. Α. , Roemer, K. ,Muntefering H. , Huber, C,Sahin,U. & Tureci,0· (2004)Cancer Res. 64, 5988-5993 ；Koslowski, Μ. , Tureci, 0. , Bell, C, Krause, P. , Lehr, H. Α. , Brunner, J. ， Seitz, G. ， Nestle, F. 0. ， Huber, C. & Sahin， U. (2002) Cancer Res. 62,6750-6755 ； Koslowski, Μ. ， Sahin, U. ， Huber, C. & Tureci， 0. (2006)Hum. Mol. Genet. 15,2392—2399)。 原則上，將GenBank的分級關鍵詞檢索與數位化的cDNA文庫消減結合用於預測真正的胎盤特異性基因。GT468是通過該方法鑑定的。通過終點RT-PCR和定量實時RT-PCR在一整套正常和腫瘤組織標本中研究 GT468mRNA。經證實，GT468的表達僅限於胎盤。在所有其它正常組織標本中，樣品轉錄量低於或僅處於高靈敏度RT-PCR的檢出限(圖1A、B、C，表1)。唯一例外的是睪丸，然而其轉錄物水平低於胎盤中觀察到水平的3 4個對數。表1.利用終點RT-PCR分類的GT468在組織和細胞系中的表達
權利要求
1.能夠與GT468結合併具有一種或多種以下活性的抗體(i)殺死表達GT468的腫瘤細胞，(ii)抑制表達GT468的腫瘤細胞的增殖，(iii)抑制表達GT468的腫瘤細胞的集落形成，和(iv)抑制表達GT468的腫瘤細胞的轉移。
2.權利要求1所述的抗體，其中所述一種或多種活性通過所述抗體與所述細胞所表達 GT468之胞外結構域的結合來誘導。
3.權利要求1或2所述的抗體，其中所述表達GT468的腫瘤細胞是癌細胞。
4.權利要求3所述的抗體，其中所述癌細胞來自於選自以下的癌症乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌尤其是腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式，和肺中的轉移癌。
5.權利要求1至4中任一項所述的抗體，其是單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體，或者抗體片段。
6.權利要求1至5中任一項所述的抗體，其中GT468具有SEQID NO 2的胺基酸序列。
7.權利要求1至6中任一項所述的抗體，其中所述抗體與GT468特異性結合。
8.權利要求1至7中任一項所述的抗體，其與GT468的天然表位結合。
9.權利要求1至8中任一項所述的抗體，其可通過包括以下步驟的方法來獲得用含有選自SEQ ID NO :2-10和35-82之胺基酸序列的蛋白質或肽或者其免疫原性片段或衍生物、或者表達所述蛋白質或肽或者其免疫原性片段或衍生物的核酸或宿主細胞來免疫動物。
10.選自以下的抗體(i)由以如下登記號保藏的克隆所產生的或可由所述克隆獲得的抗體DSM ACC2822 (4E9-1H9)，DSM ACC2826 (9B6-2A9)，DSM ACC2824(59D6-2F2)， DSM ACC2825 (61C11-2B5), DSM ACC2823 (78H11-1H6)，DSM ACC2895 (22-1A-1)， DSM ACC2893 (22-2A-1)，DSM ACC2896 (22-9B-1)，DSM ACC2897 (23-33A-1)，DSM ACC2891(23-19A-1)， DSM ACC2894(F11#33F7D12)， DSM ACC2892(4A12 2D4 1A10)， DSM ACC2898(4E9 1D12 2D4)，DSM ACC2961 (42H11 ICll 2B2)，DSM ACC2962(51G6 2H3 2B4), DSM ACC2943(16-5B-1)，DSM ACC2956(20-11A-1)，DSM ACC2947 (29-1A-2)， DSM ACC2964 (29-8B-1)，DSM ACC2959 (35-48B-1)，DSM ACC2963 (35_50A_2a)， DSM ACC2957 (38-10B-1)，DSM ACC2958 (38-1A-1)，DSM ACC2948 (44-3A-2)， DSM ACC2949(45-2A-1)， DSM ACC2950(45-8A-2)， DSM ACC2951(48-3B-1)， DSM ACC2952 (48-4A-1)，DSM ACC2946 (49-3A-1)，DSM ACC2945 (49-8A-1)， DSM ACC2944(51-1A-1)， DSM ACC2953(53-13A-2)， DSM ACC2955(53-29A-1)， DSM ACC2960(54-4B-2), DSM ACC2954(56-4A-2), or DSM ACC3001(62-9B-1)，(ii)作為(i)所述抗體的嵌合或人源化形式的抗體，(iii)具有(i)所述抗體的特異性的抗體，和(iv)包含(i)所述抗體的抗原結合部分或抗原結合位點的抗體。
11.權利要求10所述的抗體，其中(i)所述抗體的抗原結合部分或抗原結合位點包含(i)所述抗體的可變區。
12.能夠產生權利要求1至11中任一項所述抗體的雜交瘤。
13.以如下登記號保藏的雜交瘤DSMACC2822 (4E9-1H9), DSM ACC2826 (9B6-2A9), DSM ACC2824(59D6-2F2)， DSM ACC2825(61C 11-2B5), DSM ACC2823(78H11-1H6)， DSM ACC2895 (22-1A-1)，DSM ACC2893 (22-2A-1)，DSM ACC2896 (22-9B-1)，DSM ACC2897 (23-33A-1)，DSM ACC2891 (23-19A-1)，DSM ACC2894(F11#33F7D12)，DSM ACC2892(4A12 2D4 1A10), DSM ACC2898 (4E9 1D12 2D4)，DSM ACC2961 (42H11 ICll 2B2), DSM ACC2962(51G6 2H3 2B4)， DSM ACC2943(16-5B-1)， DSM ACC2956(20-11A-1), DSM ACC2947 (29-1A-2)，DSM ACC2964 (29-8B-1)，DSM ACC2959 (35-48B-1)， DSM ACC2963 (35-50A-2a)，DSM ACC2957 (38-10B-1)，DSM ACC2958 (38-1A-1)， DSM ACC2948 (44-3A-2)，DSM ACC2949 (45-2A-1)，DSM ACC2950 (45-8A-2)， DSM ACC2951 (48-3B-1)，DSM ACC2952 (48-4A-1)，DSM ACC2946 (49-3A-1)， DSM ACC2945 (49-8A-1)，DSM ACC2944 (51-1A-1), DSM ACC2953 (53-13A-2)， DSM ACC2955(53-29A-1)， DSM ACC2960(54-4B-2)， DSM ACC2954(56-4A-2)或 DSM ACC3001(62-9B-1)。
14.綴合物，其包含與治療劑偶聯的權利要求1至11中任一項所述抗體。
15.權利要求14的綴合物，其中所述治療劑是毒素、放射性同位素、藥物或細胞毒劑。
16.藥物組合物，其包含權利要求1至11中任一項所述抗體和/或權利要求14或15 的綴合物，以及可藥用載體。
17.抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的生長的方法，其包括使所述細胞接觸權利要求1至11中任一項所述抗體和/或權利要求14或15的綴合物。
18.殺死表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的方法，其包括使所述細胞接觸有效量的權利要求1至11中任一項所述之抗體和/或權利要求14或15的綴合物。
19.抑制表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞的轉移性傳播的方法，其包括使所述細胞接觸有效量的權利要求1至11中任一項所述之抗體和/或權利要求14或15的綴合物。
20.治療或預防對象中與表達GT468和/或特徵在於其細胞表面與GT468締合之細胞有關的疾病或病症的方法，其包括向所述對象施用權利要求1至11中任一項所述的抗體、 權利要求14或15的綴合物或權利要求16的藥物組合物。
21.權利要求20的方法，其中所述疾病或病症是腫瘤相關疾病。
22.權利要求21的方法，其中所述腫瘤相關疾病是癌症。
23.權利要求22所述的方法，其中所述癌症選自乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌尤其是腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、 骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式，和肺中的轉移癌。
全文摘要
本發明提供了可用作治療和/或預防與表達GT468細胞相關之疾病的治療劑的抗體，所述疾病包括腫瘤相關疾病例如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結腸癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌(尤其是腎細胞癌)、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉移形式。在一個實施方案中，所述腫瘤疾病是肺中的轉移癌。
文檔編號C07K16/30GK102164963SQ200980136101
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月16日 優先權日2008年9月16日
發明者烏爾·沙欣, 厄茲萊姆·圖雷奇, 米夏埃爾·科斯洛夫斯基, 裡塔·米特納赫特-克勞斯 申請人:加尼梅德藥物公司, 約翰內斯·古滕伯格美因茲大學