一種利用MeJA和SA提高白樺細胞中白樺酯醇和齊墩果酸含量的方法
2023-07-03 00:55:16
專利名稱：一種利用MeJA和SA提高白樺細胞中白樺酯醇和齊墩果酸含量的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種利用MeJA和SA提高白樺細胞中白樺酯醇和齊墩果酸的方法。
背景技術：
白樺樹皮中具有重要的三萜類物質，其中白樺酯醇和齊墩果酸具有抑制多種腫瘤 和愛滋病毒的功效，因天然、高效、低毒，被譽為是優良的、極具開發潛力的抗愛滋病和腫瘤的先鋒藥物。然而，樹木生長周期長，若獲得白樺酯醇需對樹木進行砍伐或扒皮，破壞資源，加之其結構複雜，人工方法合成效率低，成本高等因素而成為制約其不能進行臨床大規模應用的主要原因。以細胞全能性為基礎建立起來的植物細胞培養技術為植物藥生產提供了一條新途徑。由於利用植物細胞培養法生產植物天然活性物質具有不受氣候、病蟲害等自然條件的影響，而且不佔用土地，不消耗自然資源，生產周期短和人為可控等優點，因而被認為是解決植物藥生產與天然植物資源可持續發展之間矛盾的一種新型生物技術。茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,簡稱MeJA)和水楊酸(salicyl acid, SA)是植物體內普遍存在的小分子化合物，已被證明是植物種間和種內化學通訊物質，是系統獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance, SAR)的重要誘導因子，也是植物受病原菌侵染後活化一系列防衛反應的信號傳導途徑中的重要組成成分，來源於植物內部的內源性誘導子SA和MeJA不僅對植物抗逆、抗病蟲和微生物侵染，誘導植物防禦系統產生植保素，而且也是介導外源真菌誘導子促進植物細胞次生代謝產物合成的重要信號分子，對多種次生代謝產物的合成具有誘導作用，被認為是非常有效的誘導子。研究證明，對細胞培養中多種次生代謝產物紫杉醇、喜樹鹼、異黃酮、甘草皂苷、葛根素等的合成及其相應產物關鍵酶基因具有積極的誘導和促進作用。另有研究發現外源MeJA能誘導水稻葉片中抗菌物質、化感物質萜類的合成，同時促進雲杉、松樹和椰子等單萜、二萜、多萜類樹酯的合成，以抵抗病原菌侵染和蟲咬，並能提高西紅柿和櫻桃抗逆物質積累，延長保險期。而關於MeJA和SA對白樺愈傷組織和懸浮培養細胞中次生產物的誘導合成研究未見報導。
發明內容
為保護白樺自然資源，建立可持續開發利用的資源生產程序，利用來自白樺無菌苗誘導的愈傷組織和懸浮培養細胞，進行MeJA和SA的誘導處理，提高白樺酯醇和齊墩果酸的合成量。為進行工業化法大規模生產白樺酯醇和齊墩果酸類藥物的提供了新方法。技術方案是獲得7 8年生白樺原生植株休眠芽、展葉芽以及種子作為誘導組培苗的外植體，經表面消毒，接種於WPM+1. Omg/L 6-BA培養基進行白樺組培苗的誘導及繼代培養，取生長30天左右的組培苗，將莖段和葉片切成Icm左右，接種於白樺愈傷組織誘導培養基，NT為基本培養基，附加激素O. lmg/L 6-BA和O. Olmg/LTDZ,進行白樺愈傷組織誘導，選擇細胞生長速度快，鬆散且總三萜物質含量高的愈傷組織，進行多次繼代和懸浮培養。懸浮繼代20次以上，獲得高產白樺酯醇和齊墩果酸懸浮細胞。在含IOOmL的液體培養基中加入3g白樺細胞，震蕩培養，在懸浮培養第七天分別添加100uM/L MeJA和50mg/L SA,此後24h 48h收穫，經過濾，烘乾，粉碎，有機溶劑提取步驟，利用液相色譜方法對白樺酯醇和齊墩果酸檢測和定量分析。本專利具有一下特點I)生產環境不受地域、季節 、水質、病蟲害、氣候等自然環境的影響。2)生產周期短，生產過程不產生大量廢渣廢水，安全無汙染，具有生態效益。3)利用低劑量MeJA和SA促進白樺懸浮細胞中白樺酯醇和齊墩果酸的高效積累，降低成本，且有利於實現白樺天然植物資源及其藥用成分的開發利用。
具體實施例方式I)植物材料來源白樺母樹取自東北林業大學白樺強化種子園，7-8年生嫁接優樹(接穗30年生)休眠芽、種子作為誘導組培苗的外植體誘導(WPM+1. Omg/L 6-BA培養基)白樺組培苗。以白樺組培苗莖段為外植體，NT為基本培養基，附加激素O. lmg/L6-BA和O. Olmg/LTDZ，誘導愈傷組織，挑選生長狀態良好的愈傷組織將其多次繼代後轉移至液體培養基懸浮培養。經過20代以上的轉接，建立穩定的懸浮培養細胞體系，懸浮培養繼代周期為15d，接種量為3g細胞於IOOmL液體培養基中。2)培養條件固體培養基NT培養基+0. lmg/L 6-BA+O. Olmg/LTDZ，蔗糖 20g/L、瓊脂粉5. 3g/L、pH值為6. 0-6. 5。液體培養基為不加瓊脂粉的固體培養基。固體愈傷組織繼代周期為25d，液體培養繼代周期為15d，培養基均以121°C高壓蒸汽滅菌20min，培養溫度為24 26°C，光照強度為20001x，光照時間16h/d，溼度為40%-50%，搖床轉速120r/min。3)誘導子添加MeJA的製備及添加MeJA購買於Sigma公司，取573 μ I MeJA用95%乙醇定容到5ml,配製成0. 5mol/L儲備液。取0. 5mol/L的母液2ml用無菌水定容至50ml,配製成20mmol/L的母液，0. 45 μ m有機濾膜過濾除菌。在懸浮培養的第7d添加終濃度為100 μ mol/L的MeJA，每個處理重複三次，同時設立對照組。分別在MeJA處理後24tT48h收穫細胞。SA的製備及添加SA購買於Sigma公司，取0. 100g SA,以少許95%乙醇溶解後用無菌水定容至50ml,配製成2mg/mL母液,0. 45 μ m有機濾膜過濾除菌。在懸浮培養的第7d添加終濃度為50mg/L的SA，每個處理重複三次，同時設立對照組。分別在SA處理後24h 48h收穫細胞。4)總三萜的提取及含量測定精密稱取0.05g細胞幹樣，加入2ml 95%乙醇並浸泡24h。70°C水浴Ih後再超聲40min，取100 μ L上清液於IOml離心管中並置於70°C水浴蒸乾。加入200 μ L 5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷卻。乙酸乙酯定容至5ml後測定其在551nm的吸光值(對照組為200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。總三萜的標準曲線以齊墩果酸為標準品進行繪製，其回歸方程為y=43. 044x-0. 6438，相關係數R2=O. 997，齊墩果酸在4 32mg/L含量範圍內具有良好的線性關係。5)齊墩果酸和白樺脂醇的提取及含量測定齊墩果酸和白樺脂醇的提取參照譚朝陽[8°]等的方法，具體方法如下精密稱取
0.5g細胞幹樣，加入25mL鹽酸-乙醇溶液(2 8)，加熱回流3h，放冷，搖勻並濾過，精密量取續濾液15mL，加蒸餾水15mL，置於80°C水浴上蒸去乙醇，然後用乙醚萃取3次，每次20mL，合併乙醚萃取液並於40°C低溫蒸乾，加Iml甲醇溶解殘渣，並將其用O. 45 μ m有機濾膜濾過，此為樣品檢測液，然後利用高效液相色譜進行檢測。高效液相色譜(HPLC)檢測條件用Waters公司600-717-2487色譜系統，色譜柱HiQ sil C18V 4. 6mmX250mm ;流動相為乙腈水=9 1 ;柱溫25°C ;靈敏度16AUFS ;流速
1.OmT,/miη ;檢測波長 210nm,進樣 20uL。`齊墩果酸線性關係考察精密吸取濃度為O. 5mg/mL的齊墩果酸標準品溶液O. 2、O. 5、l、2、3、4、5mL，分別置於5mL容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μ L進樣，測定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪製標準曲線。齊墩果酸回歸方程為..I = 107x+33446, R2 = 0.9992。結果表明，齊墩果酸在O. 2-5. O μ g範圍內具有良好的線性關係。白樺脂醇線性關係考察精密吸取濃度為O. 5mg/mL的白樺脂醇標準品溶液O. 2、
0.5、l、2、3、4、5mL，分別置於5mL容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取20 μ L進樣，測定其峰面積積分值。以濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪製標準曲線。白樺脂醇回歸方程為y = 9*106x+68020，R2 = O. 9994。結果表明，白樺脂醇在O. 2-5. O μ g範圍內具有良好的線性關係。在懸浮培養第七天分別加入100 μ mol/L MeJA和50mg/L SA，誘導後24h 48h，上述方法檢測細胞中總三萜、齊墩果酸及白樺脂醇積累，兩種處理總三萜含量比對照提高21. 69Γ31. 7%，齊墩果酸含量分別比對照提高277. 4Ρ/Γ369. 34%，白樺脂醇含量分別比對照提高44. 429Γ179. 58% ;其中的MeJA和SA兩種處理總三萜最高含量分別可達46. 9mg/g和45. 4mg/g,齊壤果酸最聞含量分別可達O. 85mg/g和I. 07mg/g,白樣脂醇最聞含量分別可達
1.77mg/g 和 O. 95mg/g。本發明的經濟效益以IL培養基接種30g白樺細胞(培養基成本3元/L)，10天為一繼代周期，一繼代周期細胞平均生長5倍，細胞乾濕係數O. 1，以白樺脂醇和齊墩果酸平均含量未誘導處理平均含量O. 5mg/g (O. 1%乾重),誘導子處理後平均提高I倍(約達lmg/g)計算白樺脂醇和齊墩果酸增產(噸):[(3Χ5)36Χ0· 05%Χ0· 1]/1061· 75噸齊墩果酸和白樺脂醇平均市場售價Ig 1000元，其經濟效益可達1750百萬元。以成本750百萬元計算，其純效益也可達1000百萬元。
權利要求
1.將白樺細胞懸浮培養在NT培養基+0.lmg/L6-BA+0. Olmg/LTDZ,接種量3g/100mL，在懸浮培養第七天分別加入100 μ mo I/LMeJA和50mg/L SA,誘導後24tT48h，經高效液相色譜法檢測細胞中總三萜、齊墩果酸及白樺脂醇積累，兩種處理總三萜含量比對照提高21. 69Γ31. 7%，齊墩果酸含量分別比對照提高277. 4Ρ/Γ369. 34%，白樺脂醇含量分別比對照提高 44. 42% 179· 58%ο
2.根據權利要求書I所述的方法，其中的液體培養基為NT培養基+0.lmg/L6-BA+0. Olmg/L TDZ。
3.根據權利要求書I所述的方法，其中的白樺細胞接種量為3g鮮細胞置於含IOOml培養液的250ml三角瓶中，培養基均以121 °C高壓蒸汽滅菌20min，培養溫度為24 26°C，光照強度為20001x，光照時間16h/d，溼度為40%-50%，搖床轉速120r/min。
4.根據權利要求書I所述的方法，其中的MeJA和SA均進行無菌過膜處理，在懸浮培養第七天加入，培養周期為15天，且MeJA和SA加入的終濃度為100 μ mo I/L MeJA和50mg/LSA0
5.根據權利要求書I所述的方法，其中的收穫時間均為誘導子加入第24 48h收穫懸浮細胞。
6.根據權利要求書I所述的方法，其中的MeJA和SA兩種處理總三萜含量分別可達·46. 9mg/g和45. 4mg/g,齊墩果酸含量分別可達O. 85mg/g和I. 07mg/g,白樺脂醇含量分別可達 I. 77mg/g和 O. 95mg/g。
全文摘要
本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種利用MeJA和SA提高白樺細胞中白樺酯醇和齊墩果酸含量的方法。以白樺組培苗莖段接種於NT+0.1mg/L 6-BA和0.01mg/L TDZ培養基誘導白樺愈傷組織，經多次繼代、篩選和懸浮培養獲得總三萜含量高的白樺懸浮細胞。將上述篩選細胞接種於相同液體培養基中，接種量為3g/100ml，震蕩培養第七天分別添加100uM/L MeJA和50mg/L SA,此後24h-48h收穫，檢測細胞中總三萜、白樺酯醇和齊墩果酸含量。兩種處理總三萜含量比對照提高21.6%~31.7%，齊墩果酸含量分別比對照提高277.41%~369.34%，白樺脂醇含量分別比對照提高44.42%~179.58%。該申請發明為解決天然植物藥物來源緊缺和工業化大規模生產白樺酯醇和齊墩果酸藥物提供了一種新途徑。
文檔編號C12P33/00GK102943104SQ20121046207
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者詹亞光, 尹靜, 肖佳雷, 任春林, 範桂枝, 由香玲, 曾凡鎖 申請人:東北林業大學, 詹亞光, 尹靜