一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白及其生產工藝的製作方法

2023-07-03 13:18:21

專利名稱：一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白及其生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子藥物學，生物技術和疾病防治，具體地說是採用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)生產一種抗腫瘤新生血管形成的長效重組蛋白，該蛋白為人Kallistatin(Kal)與人絨毛膜促性腺激素(hCG) β鏈的羧基末端肽(CTP)的融合蛋白(LA-Kal，long acting Kal)。融合蛋白LA-Kal較野生型Kal的體內半衰期顯著增加，提高了抗腫瘤療效。
背景技術：
目前惡性腫瘤已經成為發達國家和地區居於前列的致死性疾病。雖然外科手術， 放療和化療作為的常規治療手段仍在不斷發展，但由於其固有的局限，其療效已基本達到極限，因而迫切需要開發新的治療手段。自從R)lkman於1971年首次闡述腫瘤與新生血管依賴關係，並提出有關分子機制假說以來，以腫瘤新生血管為靶點的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點。Kal是一新型的具有抗血管生成作用的內源性蛋白(Miao RQ, et al. Blood 2002 ； 100 :3對5-52)，其抗血管生成作用與內皮抑素(endostatin)類似。內皮抑素通過其肝素結合活性介導其對血管生成的抑制作用。各種生長因子必須結合細胞表面兩種不同的受體， 才能引發一個信號。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受體，在調節多種生長因子的作用時，發揮關鍵作用。許多生長因子，如VEGF和bFGF是肝素結合生長因子，VEGF和 bFGF與內皮細胞表面的HSPGs結合，可以調節它們與專屬受體的結合。Kal是肝素結合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結合區的生長因子競爭結合HSPGs，因此阻斷了這些生長因子與HSPGs的結合，阻斷了這些生長因子引發的血管生成事件。另外，Kal還是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員，最初被認為是組織胰激肽原酶結合蛋白。越來越多的證據顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關事件中非常重要，其中包括腫瘤生長調節，血管生成，侵入和轉移等。我們的研究發現，在Kal的作用下，HCC中作為細胞增殖的標誌Ki-67染色降低， 顯示Kal與組織胰激肽原酶的結合可能與HCC細胞增殖抑制有關。Kal可以從不同途徑抑制血管生成，因此是抗腫瘤血管生成治療的良好候選者。已進行的Kal的抗腫瘤作用研究主要採用基因治療手段，而基因治療一般需要採用病毒載體，其長期應用的風險是各國衛生部門重點關注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內實現上市並廣泛應用於腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應用於臨床，相關技術比較成熟，是開發基因重組藥物最常規的手段。Kal的發現者Chao等曾採用大腸桿菌表達Kal重組蛋白，但表達量很低。本課題組也曾用大腸桿菌表達人Kal蛋白，表達水平也極低，且雜蛋白多難以純化。畢赤酵母表達系統是近年來建立起來的一種真核表達系統，已成功地表達了大量的重組蛋白，它既具有原核表達系統繁殖快、操作簡單的優點，同時又具有原核表達系統所沒有的優勢如能對表達的目的蛋白進行正確加工、摺疊及適度糖基化，分泌表達的雜蛋白少，易於分離純化等，因此越來越廣泛地用於重組蛋白的表達。本發明人曾利用畢赤酵母表達人Kal蛋白(刁勇，專利申請號20091(^632^0)。但野生型Kal在體內較短的半衰期(1-2小時)，極大地限制了其藥效的發揮，在臨床應用時必須連續反覆注射給藥，病人依從性較差。因此，開發長效蛋白藥物成為研究人員努力的方向。由於蛋白質藥物在體內會被快速清除，所以患者必須頻繁用藥才能保持藥物濃度在治療窗內，限制了其治療效果。因此，延長蛋白質藥物體內的半衰期已成為近年來的研究熱點。可提高蛋白質藥物半衰期的技術包括化學修飾、蛋白質融合、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突變體等，許多長效蛋白質藥物已經研製成功並應用於臨床治療。融合蛋白是將兩個或多個基因的編碼區首尾連接，由同一調控序列控制構成的基因表達產物。在分子水平，這個技術具有設計簡單靈活的特性，因為構建突變體時不需要插入連接序列而直接在C端或N端融合。因此，這種技術能廣泛地應用於構建生物活性分子， 而且它的應用性不會因為生物分子的大小或活性而受到限制。常選用半衰期較長，分子量較大的分子作為載體構建融合蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fc片段應用最為廣泛。蛋白質表面的糖鏈是影響蛋白體內半衰期的重要因素。糖基化形式的蛋白質一方面增加了表面側鏈，阻礙蛋白酶對蛋白藥物的降解作用，提高蛋白質穩定性，另一方面使蛋白質藥物分子量增大，減少腎小球濾過。如促紅細胞生成素(EPO)是一個高度糖基化的蛋白，它含有3個N-連接和1個0-連接糖鏈。人EPO的0-連接糖基對於體內外活性及清除速率作用無關，而N-連接糖基化不完全的人EPO體外活性正常，但體內活性則降低到體外活性的1/500，且體內清除率也明顯加快。因此，N-連接糖基化對蛋白質藥物的修飾有重要作用。重組人EPO突變體(Amgen公司的Aranesp)即通過增加了兩個N-連接糖基，使半衰期延長3倍以上，現已經研製成功並上市。病人用藥頻率由一周3次減少到每周1次。

發明內容
針對野生型Kal現有體內半衰期短，影響藥效發揮的問題和缺陷，本發明對野生型Kal進行改造，採用蛋白融合和增加糖基化兩種手段，利用真核細胞CHO進行表達和生產，得到了可以高效表達LA-Kal的分泌型表達細胞株，並建立了可以用於工業化生產的發酵工藝和純化工藝。為了達到上述目的，本發明的技術方案是一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，該融合蛋白含有成熟人 kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGi3)的羧基末端肽(CTP)。所述的人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGi3)的羧基末端肽(CTP)長度為沈-31個
胺基酸。一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產工藝，採用中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)表達，懸浮培養法生產得到其分泌的上清液經柱層析工藝分離純化，得到純度大於 98%的所述的融合蛋白。所述的柱層析工藝分離純化步驟依次包括經硫酸銨沉澱，苯基柱疏水層析，分子篩柱脫鹽，肝素親和層析後，除菌過濾得到融合蛋白。所述的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達的細胞培養基為含5mmol/L穀氨醯胺、 0. 1 % (ff/V) Pluronic F-68 (購於Sigma公司)及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養基(購於Hyclone公司)，其中添加400mg/L的胰島素(購於Sigma公司)，6mg/L的轉鐵蛋白(購於Sigma公司)，100mg/L的丁酸鈉，培養溫度為34°C。
本發明的有益效果為本發明採用的融合蛋白片段是來自人絨毛膜促性腺激素 (hCG) β鏈的羧基末端肽(CTP)，長度不超過30個胺基酸。因CTP本身來自人體天然蛋白， 不會引起免疫反應。一般情況下，蛋白分子量的增加會降低表達效率，但令人意外的發現是，與野生型Kal比較，在C端引入CTP後，表達效率增加了 100%以上。N-連接糖基需要固定的胺基酸序列，即Asn-X-Thr/Ser序列，糖鏈與天冬氨酸 (Asn)的側鏈相連接，X為除脯氨酸外的任何胺基酸。0-連接糖基一般發生於絲氨酸或蘇氨酸的側鏈，目前尚未發現0-連接糖基的固定序列。引入N-連接糖基需要在蛋白序列內突變產生Asn-X-Thr/Ser序列，常常因破壞了原胺基酸序列而引起活性或免疫源性的變化。很有意思的是，CTP本身即含有4個0-連接糖基化位點，與Kal融合後即可以自然增加糖基化程度。本發明採用CHO細胞高水平分泌表達LA-Kal蛋白。由於分泌蛋白水平高，下遊純化非常方便，經兩步層析純度即可達到98%以上，非常便於工藝化生產。


圖1是本發明LA-Kal融合蛋白的構建圖；將人Kal cDNA序列與hCG β -CTP序列(羧基端28肽對應的序列)連接在一起， 在5』端引入Hind III酶切位點，在3』端引入EcoR I酶切位點。圖2是本發明實施例PCR方法檢測傳代細胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal中Kal基因圖；M:DNA 分子量標準；1 陰性對照；2 :CH0_Kal ;3 :CH0-LA_Kal (31) ;4 CHO-LA-Kal (28) ；5 =CHO-LA-Kal (26) ；6 陽性對照；圖3是本發明實施例RT-PCR方法檢測傳代細胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal的Kal 表達情況圖；M:DNA 分子量標準；1 陰性對照；2 :CH0_Kal ;3 :CH0-LA_Kal (31) ;4 CHO-LA-Kal(28) ；5 =CHO-LA-Kal(26)；圖4是本發明實施例Wfestern Blot方法測定細胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal的 Kal表達情況圖；1 =CHO-Kal ；2 =CHO-LA-Kal (28) ；3 陰性對照；圖5是本發明實施例肝素柱分離純化LA-Kal圖；1 肝素柱上樣穿透峰；2 0. lmol/L NaCl洗滌峰；3 :0. 3mol/LNaCl洗滌峰；4 0. 5mol/L NaCl 洗脫峰；M :mark ；圖6是本發明實施例腫瘤生長曲線圖。
具體實施例方式1、表達載體的構建根據人Kal cDNA 的 NCBI 參考序列(Reference Sequence :NM_006215. 2)，以及 hCG^鏈的NCBI參考序列(Reference kquence :NM_033378. 1)，委託大連寶生物公司全合成人Kal cDNA與hCG β -CTP的融合序列(圖1，見序列表SEQ ID No. 1)。hCG β -CTP為 hCGi3鏈C端第118-145位胺基酸序列。在融合序列的5』和3』端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點，以便構建真核表達載體。將含有Kal全長cDNA序列與hCGP -CTP序列的融合序列進行HindIII和EcoRI 雙酶切，連接於hvitrogen公司生產的pcDNA3. 1質粒的HindIII和EcoRI雙酶切位點，得到 pcDNA3. I-LA-Kal (28)表達質粒。同法構建pcDNA3. I-LA-Kal (31)表達質粒，區別在於hCG-CTP為hCG鏈C端第 115-145位胺基酸序列。同法構建pcDNA3. I-LA-Kal (26)表達質粒，區別在於hCG-CTP為hCG鏈C端第 130-145位胺基酸序列。同法構建僅含有Kal全長cDNA序列的pcDNA3. I-Kal表達質粒，區別在於不含有 hCG-CTP。轉化大腸桿菌後，經菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委託大連寶生物公司進行測序。2CH0細胞的轉染及穩定高效表達株的篩選分別將含有Kal基因的質粒pcDNA3. I-Kal和pcDNA3. I-LA-Kal線形化，按 hvitrogen的脂質體轉染試劑盒Lipofect AMINE 2000的工作手冊要求轉染生長狀態良好的CHO-Kl細胞，同時轉染不含任何Kal基因的空載體作為對照。用0. 8-lmg/ml的G418 進行篩選；挑取單克隆擴增和傳代，G418(購於Sigma公司)維持量為0. 5mg/ml，最終形成可以穩定表達Kal及LA-Kal的傳代細胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal。PCR檢測結果顯示，在篩選的傳代細胞系中分別擴增到與Kal單個基因大小相符的片段(如圖2所示)，表明Kal基因已經整合到CHO細胞的基因組上；同時RT-PCR結果顯示，在篩選的傳代細胞系中分別擴增到與Kal單個基因大小相符的片段(如圖3所示)， 表明整合在CHO細胞基因組上的Kal基因可以轉錄表達。在細胞傳代至20代後，均能檢測到相應的Kal基因；將細胞凍存後復甦，PCR和RT-PCR同樣能檢測到相應的基因，表明凍存和復甦過程中沒有造成外源基因的丟失。篩選得到的細胞株在含有G418的培養基裡正常傳代，取培養上清冷凍乾燥獲得濃縮的細胞總蛋白。Western Blot方法測定Kal的表達(如圖4所示)，可見細胞株CHO-Kal 和CHO-LA-Kal均有Kal蛋白的表達。因LA-Kal中，hCG β-CTP序列連接於Kal的C末端，不影響Kal的抗原抗體結合， 所以可以採用市售ELISA試劑盒進行含量測定。在細胞密度相同的情況下，LA-Kal的細胞上清內表達水平是Kal的2倍左右，表明CTP序列可能有助於重組蛋白的表達與分泌。3懸浮培養法生產Kal及LA-Kal將細胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal在IOL生物反應器中懸浮培養，接種密度 2.5父105細胞/1111，培養基為含511111101/1穀氨醯胺、0.1% (ff/V) Pluronic F-68 及 25 μ g/mL 硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養基。培養3天後ELISA方法測定Kal的表達水平。基於溫度和培養基中特定添加劑對CHO細胞蛋白表達的影響，我們採用L9 (34)正交試驗，考察溫度(A)、胰島素(B)、丁酸鈉(C)和轉鐵蛋白(D)四種主要因素對目的產物表達的影響。按正交試驗設計表1，表1為正交試驗因素水平表。配製不同的培養基，接種 CHO-LA-Kal後在IOL生物反應器中培養3天，測定LA-Kal的表達水平，結果見表2，表2為正交分析試驗結果及極差分析表。結果表明4個因素對細胞表達水平的影響順序依次是B>0>々>(，即胰島素>轉鐵蛋白>溫度>丁酸鈉。最佳培養條件為在含5mmol/L穀氨醯胺、0. 1 % (ff/V) Pluronic F-68及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養基中，添加400mg/L的胰島素，6mg/L的轉鐵蛋白，100mg/L的丁酸鈉，培養溫度為34°C。4 純化Kal及LA-Kal的純化過程包括發酵上清液的硫酸銨預處理和連續的三步層析。CHO上清液用1.5mol/L硫酸銨沉澱，離心。棄沉澱，預處理後上清經Phenyl Superose介質(購於GE公司)疏水層析，平衡緩衝液為1. 5mol/L硫酸銨，20mM/L Tis-HCl (PH 6. 0)；然後採用 1. 2，1. O 和 0. 3mol/L 硫酸銨，20mmol/L Tris-HCl (pH 6. 0)梯度洗脫；用G25分子篩柱脫鹽，平衡緩衝液和洗脫液均為20mmol/L Tris-HCl (pH 6.0)；洗脫液透析後經過肝素親和層析，用20mmol/L Tris-HCl (pH 6. 0),0. 1-0. 5mol/L NaCl溶液梯度洗脫；除菌過濾得到LA-Kal蛋白原液。肝素柱純化各步驟產物的SDS-PAGE見圖5。5體外對血管內皮細胞的影響本實驗部分所用LA-Kal的CTP長度為28個胺基酸。5.1細胞增殖抑制取對數生長期的HUVEC細胞，按每孔4X IO3個接種於96孔板，每組設4個復孔，分別作用24、48、7濁。實驗組每孔加含重組Kal終濃度分別為5、10、20、40 μ g/和80 μ mol/L 的15%新生牛血清DMEM(購於Hyclone公司)，對照組加等體積的15%新生牛血清DMEM， 並設空白對照。將培養板移入37°C、5% CO2飽和溼度培養箱中，每隔24h取一塊96孔板， 每孔加入20 μ 1 MTT (購於Sigma公司)，37°C、5% CO2飽和溼度培養箱中孵育4h，小心吸除培養液，加入150 μ 1 DMSO (購於Sigma公司)，振蕩IOmin (1000r/min)，在酶標儀上測定 492nm吸光值(OD)。實驗重複3次。結果Kal及LA-Kal的體外細胞增殖抑制活性無明顯差異。5. 2細胞遷移抑制取對數生長期的血管內皮細胞HUVEC細胞，製成單細胞懸液，以5 X IO4/孔接種於 96孔板中，細胞貼壁(約90%融合生長)後，以移液器槍頭在孔的底部劃「一」字形劃痕， 以磷酸鹽緩衝液(PBQ衝洗，實驗組加含不同濃度重組Kal(10、20、40ymOl/L)的無血清 DMEM，對照組只加無血清DMEM，每組設4個復孔，即刻攝像記錄，於37°C、5% C02飽和溼度培養箱中培養24h後分別攝像記錄，用「電子尺」軟體分別測量每組0、24h劃痕兩側細胞間的距離，用Oh劃痕邊緣的距離減去24h遷移邊緣的距離，取3次測量平均值表示遷移距離。 遷移速度=遷移距離+遷移時間，重複實驗3次。結果Kal及LA-Kal的體外抑制細胞遷移的活性無明顯差異。5. 3體外管道形成抑制在已包被Matrigel的96孔板中，每孔添加200 μ 1含1 X IO4個HUVEC細胞的懸液 (用無血清DMEM配製)。實驗組加含不同濃度重組Kal(10、20、40ymol/L)的無血清DMEM， 對照組只加無血清DMEM，每組設4個復孔。37°C、5 % CO2條件下繼續培養，每隔4h觀察不同處理組之間的細胞管狀排列情況及完整程度，顯微鏡下隨機取上、下、左、右、中心5個視野，計數管狀結構數量，取每個視野的平均值。結果Kal及LA-Kal的體外抑制細胞管道形成的活性無明顯差異。
6體內藥動學SD大鼠靜脈注射重組Kal，劑量為lmmol/kg。在規定時間經靜脈取血，ELISA方法測定血藥濃度。根據血藥濃度經時曲線計算生物半衰期。結果Kal在大鼠體內的半衰期為1. 5士0. 3小時，而LA-Kal (CTP長度為31個胺基酸)則為6. 3士 1. 5小時，LA-Kal (CTP長度為觀個胺基酸)則為6. 5士 1. 6小時，LA-Kal (CTP 長度為26個胺基酸)則為5. 9士 1. 2小時，均較野生型Kal有明顯延長。6體內抑瘤作用取7周齡雄性BALB/c裸鼠，隨機分成3組，每組10隻，麻醉後背側部分別接種 A549細胞，接種量為2 X IO6個細胞，細胞懸浮於100 μ LPBS中。接種7d後，每日經皮下注射重組Kal，劑量為0. lmmol/kg,以生理鹽水為對照。定期觀察並測定腫瘤體積，腫瘤體積 =0. 52XaXb2, a和b分別為腫瘤的長徑和短徑。裸鼠皮下接種A549細胞7d時，腫瘤大小約為50mm3。腫瘤體積經時曲線見圖6。 給藥組腫瘤生長速率顯著小於對照組。LA-Kal組腫瘤生長速率明顯小於Kal組，自25d起兩組腫瘤體積大小有顯著性差異(P < 0. 05)。說明生物半衰期的延長對提高Kal的體內抗腫瘤活性有重要作用。表 權利要求
1.一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，其特徵在於該融合蛋白含有成熟人 kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈的羧基末端肽)。
2.如權利要求1所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，其特徵在於所述的人絨毛膜促性腺激素β鏈的羧基末端肽長度為沈-31個胺基酸。
3.一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產工藝，其特徵在於採用中國倉鼠卵巢細胞表達，懸浮培養法生產得到其分泌的上清液經柱層析工藝分離純化，得到純度大於98%的權利要求1所述的融合蛋白。
4.如權利要求3所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的柱層析工藝分離純化步驟依次包括經硫酸銨沉澱，苯基柱疏水層析，分子篩柱脫鹽，肝素親和層析後，除菌過濾得到融合蛋白。
5.如權利要求3所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產工藝，其特徵在於所述的中國倉鼠卵巢細胞表達的細胞培養基為含5mmol/L穀氨醯胺、0. 1% (W/V) Pluronic F-68及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養基，其中添加400mg/L的胰島素，6mg/L的轉鐵蛋白，100mg/L的丁酸鈉，培養溫度為34°C。
全文摘要
本發明公開了一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，該融合蛋白含有成熟人kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGβ)的羧基末端肽(CTP)；及其生產工藝。本發明採用CHO細胞高水平分泌表達LA-Kal蛋白。由於分泌蛋白水平高，下遊純化非常方便，經兩步層析純度即可達到98％以上，非常便於工藝化生產。
文檔編號C07K1/22GK102358755SQ20111032239
公開日2012年2月22日 申請日期2011年10月20日 優先權日2011年10月20日
發明者刁勇, 黃曉平 申請人:華僑大學