一種重組表達植酸酶的基因工程菌的製作方法
2023-06-03 06:24:21
一種重組表達植酸酶的基因工程菌的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程【技術領域】，具體提供了一種重組表達植酸酶的基因工程菌。本發明通過將植酸酶基因導入裡氏木黴中，構建了能重組表達該植酸酶的裡氏木黴工程菌株。該工程菌株能高效表達植酸酶，搖瓶發酵酶活為880U/mL。本發明製備得到的重組植酸酶可廣泛應用於飼料中，能大大提高養殖動物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排洩量降低了13.3%，從而有利於增加養殖效益，降低對環境的汙染。
【專利說明】—種重組表達植酸酶的基因工程菌
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物工程【技術領域】，具體涉及一種重組表達植酸酶的基因工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002]植酸酶(Phytase)即肌醇六憐酸水解酶(Myo-1-nositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。植酸酶具有特殊的空間結構，能夠依次分離植酸分子中的磷，將植酸鹽降解為無機磷和肌醇，同時釋放出植酸鹽結合的其他營養物質。可廣泛用作飼料添加劑。目前，利用植酸酶飼餵單胃動物的效果已經得到了驗證。飼料中添加植酸酶後，可以減少5-70%無機磷的用量，糞便中磷的排放量減少了 30-40%以上，不僅大大降低了植酸鹽的抗營養作用，增加生產效益，還能有效的降低環境汙染，因此對植酸酶的研究具有重要的意義。 [0003]目前在天然材料中植酸酶的表達水平較低，酶學性能也不能滿足飼料加工的應用，採用基因工程的手段，不僅可以提高植酸酶的酶活力，還能通過構建工程菌株改造酶的部分性質,使之更加適應工業化生產的條件。
【發明內容】
[0004]本發明為解決現有技術問題，提供了一種重組表達植酸酶的基因工程菌。本發明通過將煙麴黴來源的植酸酶基因轉化入裡氏木黴中，構建了能高效表達該植酸酶的裡氏木黴工程菌株，從而彌補現有技術的不足。
[0005]本發明一方面提供了一種表達載體，其攜帶有編碼植酸酶的基因。
[0006]所述的植酸酶，其胺基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0007]所述的植酸酶，其編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0008]本發明另一方面提供了一種宿主細胞，其攜帶有上述表達載體。
[0009]所述的宿主細胞為裡氏木黴reesie)a
[0010]所述宿主細胞在生產植酸酶中的應用。
[0011]本發明還提供了上述植酸酶在飼料中的應用。
[0012]有益效果
本發明構建的裡氏木黴工程菌株能高效重組表達煙麴黴來源的植酸酶，搖瓶發酵酶活高達880U/mL。本發明製備得到的植酸酶可廣泛應用於飼料中，能大大提高養殖動物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排洩量降低了 13.3%，從而有利於增加養殖效益，降低對環境的汙染。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這並不意味著將本發明限定於所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。
[0015]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al., 2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale etal.，2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋。
[0016]實施例1煙麴黴植酸酶基因的克隆
以煙麴黴(As/76?r^777w5.基因組總DNA為模板,利用上下遊引物進行擴增。
[0017]PCR 擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環；72°C7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，進行測序分析。結果顯示，擴增產物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2，其編碼的胺基酸序列為SEQ ID NO:1。經過NCBI Blast比對發現，該胺基酸序列與煙麴黴的植酸酶序列相似性為89%，為一新的等位基因。
[0018]實施例2表達載體的構建
將實施例1中回收的擴增產物連接到PMD18-T載體，獲得克隆載體pMD-TR質粒，然後用NcoI和KpnI進行雙酶切，回收TR片段；取2 μ I回收產物與NcoI和KpnI雙酶切pKDN_5載體連接過夜導入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達質粒pKDN-TR。
[0019]實施例3轉化與篩選 3.1原生質體製備
接種裡氏木黴reesei )菌絲於PDA平板上生長4天；切取直徑約3 cm的菌落置於約60 mlYEG (0.5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養基中，30°C、200 rpm振蕩培養過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置於盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小時；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，輕輕搖晃，倒於三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000 rpm，離心 10 min ;棄上清，加 10-20 ml STC 液(20% 蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mMCaCl2)懸浮,3000 rpm,離心 10 min ;加適量 STC 懸浮分裝(150 μ?/管，IO8 個/ml )。
[0020]轉化與驗證
取2Pg pKDN-TR DNA加入到150μ1原生質體中，接著加入500μ1 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置25 min ;然後分2_3次再加Iml 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置25min，把原生質體加到50 ml左右熔化後冷卻至45-55°C的上層半固體培養基(0.l%MgS04, 1%KH2P04,
0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18.3%山梨醇，0.35%瓊脂糖)，輕輕混勻後倒入含IOOPg/ml潮黴素下層基礎培養基平板(2%葡萄糖，0.5% (NH4) 2S04, 1.5%KH2P04, 0.06%MgS04,
0.06%CaCl2，1.5%瓊脂)，28°C黑暗培養數天至轉化子長出。
[0021]提取轉化子基因組DNA為模板，利用引物擴增潮黴素基因驗證轉化子。PCR擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物並進行測序分析。將其中一株陽性轉化子命名為裡氏木黴TR-01(Trichoderma reesei TR-01)。
[0022]實施例4發酵與酶活測定
4.1發酵驗證將陽性轉化子Trichoderma reesei TR-Ol接種於麗發酵培養基(1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5% 玉米漿，0.44%(NH4)2SO4,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐溫-80，
0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000)培養，28°C培養48小時，然後25°C培養48小時；所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 g條件下離心10 min，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進行電泳檢測，在23kDa左右處出現一條帶，即為重組表達的植酸酶。
[0023]酶活測定
酶活定義:在溫度為37°C、pH為5.0的條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉中釋放I μ mo I無機磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
[0024]測定方法:準確稱取0.6804g在105°C烘至恆重的基準磷酸二氫鉀(5.9)於100ml容量瓶中，用乙酸緩衝液(5.1)溶解，並定容至100ml，濃度為50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸緩衝液(5.2)稀釋成不同濃度，與待測試樣一起反應測定。以無機磷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，列出直線回歸方程(y=ax + b )。 [0025]反應後的試樣在水浴中靜置IOmin，在離心機(6.7)上以4000r/min離心IOmin，上清液以標準曲線的空白調零，在分光光度計(6.3) 415nm波長處測定樣品空白(Atl)和樣品溶液(A)的吸光值，A-Atl為實測吸光值。用直線回歸方程計算植酸酶的活性。
[0026]植酸酶活性按下式計算 U=FXC / (mX30)
式中:
U —試樣中植酸酶的活性，U/g
C -根據實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的酶活性，U。
[0027]F -試樣溶液反應前的總稀釋倍數。
[0028]m —試樣質量，g。
[0029]30 — 反應時間，min。
[0030]採用上述方法測得裡氏木黴工程菌搖瓶發酵上清液酶活約為880U/mL。
[0031]本發明構建的裡氏木黴工程菌能夠高效重組表達煙麴黴的植酸酶，且多次傳代後，依然能保持遺傳穩定性。
[0032]實施例5養殖動物飼餵實驗
採購I日齡羅氏308白羽肉公雞，分為對照組和實驗組，每個處理組16個重複，每個重複8羽雞，生產試驗期為35天，其中對照組為飼餵普通商品日糧，實驗組為飼餵添加本發明重組植酸酶的普通商品日糧，測量試驗過程中採食量、料重比、體重的變化以及磷的排放情況，實驗結果如表1和表2所示:
【權利要求】
1.一種表達載體，其攜帶有編碼植酸酶的基因。
2.如權利要求1所述的表達載體，其特徵在於，所述的植酸酶，其胺基酸序列為SEQIDNO:1。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特徵在於，所述的植酸酶，其編碼基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO: 2。
4.一種宿主細胞，其攜帶有權利要求1所述表達載體。
5.權利要求4所述的宿主細胞為裡氏木黴reesie、。
6.權利要求5所述宿主細胞在生產植酸酶中的應用。
7.權利要求6所 述植酸酶在飼料中的應用。
【文檔編號】C12N1/15GK103725707SQ201310608963
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】李佩佩, 許麗紅, 王華明, 黃亦鈞 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司