一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片及其製備和應用的製作方法

2023-05-28 02:42:31

專利名稱：一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片及其製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物微系統技術領域，具體涉及一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片及其製備和應用。
背景技術：
傳統藥物篩選方法通過追蹤動物組 織病理的生化途徑確定引起病變的關鍵生物物質，再利用該種物質的靶分子進行藥物篩選，具有技術複雜、低通量、動物實驗多、藥物用量大、成本高等缺點。微圖形技術不僅為藥物篩選研究提供了一種替代昂貴、費時的動物實驗的研究手段，更將研究層級提高到了細胞甚至基因水平，高通量的特徵使藥物篩選與新藥開發的周期大大縮短。在細胞水平上，微圖形化技術可以按照檢測需要構築細胞圖形、固定細胞位置，從而通過實時、快速、精確地檢測細胞對藥物的反應，進行藥物篩選。利用生化材料刺激組織再生、修復已成為組織工程的重要發展方向，研究界面的生化特徵對優化植入位點生化材料的性能起著至關重要的作用。與細胞接觸的界面的形態、剛性及分子結構決定了細胞的貼附、生長、繁殖等過程。微圖形化技術為研究界面上的生化過程提供了一個高效、全新的研究平臺。重大疾病診斷與疾病分型要求檢測設備具有快速、靈敏、高通量的特點，由於生物系統的複雜性，目前常需要幾十個生物傳感器才能確診疾病細分類型。微圖形化技術具備將多種生物受體集成在一片可尋址傳感器上的潛在能力，通過對樣本的並行檢測，簡化疾病診斷流程，為疾病治療贏得寶貴的時間。

發明內容
本發明的目的在於利用親和素和生物素之間的強結合作用，提供一種利用親和素-生物素系統細胞分離與定位方法。一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片，在基底上覆有一層同時具有生物親和性區域和生物鈍化區域的薄膜，所述生物親和性區域為細胞尺度的六甲基二矽胺(HexamethyIdisilazane, HMDS)點陣列，所述生物純化區域為聚乙二醇(polyethyleneglycol, PEG)圖形化區域。上述基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片的製備方法，包含以下步驟( I)生物親和性區域製備在基底上旋塗光刻膠，將光刻膠進行光刻曝光，顯影，然後利用化學氣相沉積(Chemical Vapor Deposition, CVD),用六甲基二娃胺填充光刻膠顯影后凹陷區域，去除光刻膠，形成六甲基二矽胺點陣列；(2)生物鈍化區域製備將上述基底浸入聚乙二醇矽烷溶液中靜置，使基底裸露部分覆蓋生物鈍化材料聚乙二醇，得到生物鈍化區域。利用上述基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片進行細胞分離與定位的方法，其特徵在於，包括以下步驟
(I)細胞陣列的製備將細胞表面用生物素標記，在晶片上滴加牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, BSA)-生物素(biotin-BSA)溶液,利用 BSA 的粘附性,使BSA連接在HMDS點陣列上，形成biotin-BSA點陣列；(2)在biotin-BSA點陣列上均勻滴加親和素，使親和素與生物素相連，形成親和素點陣列；(3)將生物素化細胞均勻接種在親和素點陣列上，孵育，得到牛血清白蛋白-生物素、親和素和生物素化細胞的三明治結構，清洗除去非特異性吸附在聚乙二醇區域上的細胞，在六甲基二矽胺點陣列上得到牢固的細胞陣列，從而定向排布細胞，實現細胞的分離與定位。本發明的有益效果在於1)利用光刻和CVD的方法在玻璃基底上進行圖形化，所用材料簡單，方法簡便，對實驗條件要求不高；2)利對HMDS陣列的大小以及排布 方式的控制，可以對(單)細胞陣列的排布進行控制；3)利用NHS (N-羥基琥珀醯亞胺，N-Hydroxysuccinimide) -LC-Biotin對細胞表面進行生物素化,使其能夠被圖形化的親和素捕獲，該方法對細胞的種類沒有要求，可使用與各種細胞的圖形化；4)利用親和素和生物素之間的強結合作用，細胞與基底結合牢固，在晶片的後續檢測應用中，單細胞陣列不易被破壞；5)所用材料以及生化物質對細胞活性影響不大，能夠使其用於活體細胞的檢測。


圖1是細胞陣列結構圖。圖2是HMDS與PEG鈍化區域圖形化流程圖。圖3是單細胞製備流程圖。
具體實施例方式下面將結合附圖和具體實施例做進一步說明。分離定位後的細胞陣列結構，如圖1所示。該發明先用光刻和CVD在HMDS與PEG在玻璃基底上進行圖形化，再在HMDS陣列上利用Biotin-BSA、親和素以及細胞的三明治結構形成(單)細胞陣列。1. HMDS與PEG鈍化區域的圖形化處理用Piranha洗液超聲清洗載玻片，除去載玻片表面的金屬離子以及有機物；在清洗完的載玻片上旋塗光刻膠，並前烘；將光刻膠進行光刻曝光並進行中烘；在NaOH顯影液中顯影得到光刻膠圖形並堅膜；利用化學氣相沉積，在HMDS蒸汽中冷卻，將載玻片沒有光刻膠部分沉積HMDS ;利用丙酮去膠，除去所有光刻膠，形成HMDS點陣列；在PEG-Silane (矽烷)溶液中靜置，使載玻片裸露部分覆蓋生物鈍化材料PEG ;最終，在載玻片上得到疏水的與生物粘附性良好的HMDS點陣列，而在其餘地方覆蓋難以生物粘附的材料PEG，如圖2所示。2.細胞陣列的製備I)細胞表面的生物素化利用NHS (N-輕基琥拍醯亞胺，N-Hydroxysuccinimide)-LC-Biotin 對細胞表面進行生物素化，使NHS-Biotin與細胞表面蛋白質的胺基反應，將生物素與細胞表面蛋白質相連，使活細胞表面生物素化。
2)細胞陣列的裝配在HMDS與PEG鈍化區域的圖形化載玻片上均勻滴加20 ii g/ml的biotin-BSA溶液，利用BSA的粘附性，使BSA連接在HMDS點陣列上，形成biotin-BSA點陣列。在biotin-BSA點陣列上均勻滴加20 u g/ml的親和素溶液，利用親和素與BSA上的生物素之間的強結合作用，使親和素與生物素相連，形成親和素島陣列。將5X106/ml生物素化的細胞溶液均勻接種在親和素島陣列上，，孵育30分鐘。由於親和素與生物素之間的強結合作用，細胞與親和素島陣列相連。清洗除去非特異性吸附在PEG區域上的細胞，形成細胞陣列。特 別的，當HMDS島陣列在單細胞尺度上時，其上形成的biotin-BSA、親和素點陣列都在單細胞尺度上，從而接種細胞後形成單細胞陣列，如圖3所示。
權利要求
1.一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片，其特徵在於，在基底上覆有一層同時具有生物親和性區域和生物鈍化區域的薄膜，所述生物親和性區域為細胞尺度的六甲基二矽胺點陣列，所述生物鈍化區域為聚乙二醇圖形化區域。
2.權利要求1所述基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片的製備方法，其特徵在於， 包含以下步驟(1)生物親和性區域製備在基底上旋塗光刻膠，將光刻膠進行光刻曝光，顯影，然後利用化學氣相沉積，用六甲基二矽胺填充光刻膠顯影后凹陷區域，去除光刻膠，形成六甲基二矽胺點陣列；(2)生物鈍化區域製備將上述基底浸入聚乙二醇矽烷溶液中靜置，使基底裸露部分覆蓋生物鈍化材料聚乙二醇，得到生物鈍化區域。
3.利用權利要求1所述基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片進行細胞分離與定位的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)細胞陣列的製備將細胞表面用生物素標記，在晶片上滴加牛血清白蛋白-生物素溶液，使牛血清白蛋白連接在六甲基二矽胺點陣列上，形成牛血清白蛋白-生物素點陣列；(2)在牛血清白蛋白-生物素點陣列上均勻滴加親和素，形成親和素點陣列；(3)將生物素化細胞均勻接種在親和素點陣列上，使生物素化細胞被親和素抓取，得到牛血清白蛋白-生物素、親和素和生物素化細胞的三明治結構，清洗除去非特異性吸附在聚乙二醇區域上的細胞，在六甲基二矽胺點陣列上得到牢固的細胞陣列，從而定向排布細胞，實現細胞的分離與定位。
全文摘要
本發明公開了屬於生物微系統技術領域的一種基於親和素-生物素系統細胞圖形化晶片及其製備和應用。此方法利用光刻和化學沉積的方法製備親生物性的六甲基二矽胺點陣列以及生物鈍化的聚乙二醇圖形化區域；然後在六甲基二矽胺點陣列上形成牛血清白蛋白-生物素、親和素和生物素化細胞的三明治結構，從而定向排布細胞，實現細胞的分離與定位。本發明的方法所用材料簡單，方法簡便；通過對HMDS陣列的大小以及排布方式的控制來實現對細胞陣列的排布進行控制；可用於各種細胞的圖形化；在晶片的後續檢測應用中，單細胞陣列不易被破壞；所用材料以及生化物質對細胞活性影響不大，能夠使其用於活體細胞的檢測。
文檔編號C40B40/02GK103013821SQ20121051103
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月3日 優先權日2012年12月3日
發明者任大海, 尤政, 夏亦秋, 王俊, 謝錦宇 申請人:清華大學