同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條及其方法

2023-05-27 22:34:51

同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條及其方法
【專利摘要】本發明屬於體外診斷領域，具體涉及一種同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條及其方法。所述試條的標記墊（3）包被有不同波長量子點對應標記的各腫瘤標誌物抗體的混合物，分析膜（7）的T帶（4）包被有各腫瘤標誌物抗體的混合物，分析膜（7）的C帶（5）包被有二抗。各被檢物標準曲線採用電子標籤進行儲存並安裝在試條上。所述試條採用具有信號檢測功能的檢測儀讀取電子標籤存貯的標準曲線數據並結合檢測儀測得的待測樣品對應的螢光強度而同步定量檢測樣品中的各腫瘤標誌物濃度。
【專利說明】同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條及其方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於體外診斷領域，具體涉及一種同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條及其方法。

【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是目前病死率較高的病種之一，它給患者的生命健康造成了嚴重威脅，早發現、早診斷、早治療是惡性腫瘤患者獲得生存的最主要途徑。測定腫瘤標誌物的存在或含量，對輔助診斷腫瘤、分析病程、指導治療、監測復發或轉移、判斷預後等具有重要意義和實用價值。
[0003]目前，腫瘤標誌物的血清檢測主要採用血清ELISA方法。該方法需要離心機先分離血清，還需要孵育箱、酶標儀等醫療設備，操作過程複雜，每次只能檢測一種指標，不能隨時隨地檢測，檢測過程至少需要40-60分鐘，且價格昂貴，無法滿足全面高效的健康體檢及臨床診斷要求。
[0004]樣品多種組分同步檢測，特別是多種組分同步快速定量檢測，對檢測領域樣品分析具有非常重要意義，其是人們一直追求的目標，是人們長期渴望解決而未能解決的問題。傳統上測定混合體系中樣品多種組分含量，多採用平行單組分分析法，即每個分析流程只測定其中一種組分含量，多次平行執行該流程，最後得到所有所需組分含量。分析所需時間長，消耗試劑多，分析通量低，勞動量大。
[0005]近年發展的納米量子點(quantum dot, QD)突光發光效率高,激發譜線範圍寬，能「一元激發，多元發射」，發射譜線範圍窄且對稱，光漂白速度慢，螢光壽命長，粒徑與生物分子相近，表面修飾後能多功能化，不同粒徑和種類的量子點混合物產生的特徵波長螢光光譜不交疊，非常適用於樣品多組分分析。
[0006]本發明公開一種同步定量多種腫瘤標誌物的QD免疫層析試條及其方法，以解決血液樣品腫瘤標誌物多指標同步快速定量問題。


【發明內容】

[0007]本發明的第一個目的是公開一種同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條。本發明的第二個目的是公開所述試條的製備方法、標準曲線製作方法、以及用所述試條同步定量血液樣品腫瘤標誌物多指標的方法。
[0008]本發明上述目的是通過如下技術方案實現的:
所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條，包括順次搭接固定在底襯8上的樣品墊1、紅細胞濾膜2、標記墊3、分析膜7、吸水墊6。
[0009]所述標記墊3為玻璃纖維膜。所述分析膜7為硝酸纖維素膜、尼龍膜、或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜，其上具有檢測帶(即T帶)4和質控帶(即C帶)5。所述底襯8為聚脂或塑料板。
[0010]所述標記墊3包被有不同波長量子點對應標記的各腫瘤標誌物抗體的混合物。所述分析膜7的T帶4包被有各腫瘤標誌物抗體的混合物。所述分析膜7的C帶5包被有質控物二抗。
[0011]本發明所述試條的標記墊3的量子點包括ZnS、CdS、HgS、ZnSe、CdSe、HgSe、CdTe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/PbS、CdS/Cd (OH)2,CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe、CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/InP、InAs/CdSe、InAs/ZnSe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SeTe、BaS、BaSe> BaTe> CdS:Mn、ZnS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb 中的任意一種或任意幾種納米粒子的組合，以及由上述任意一種量子點為核、二氧化矽為殼的核-殼型納米複合粒子。
[0012]本發明所述同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條的製備方法包括下述步驟:
A.量子點偶聯抗體:
a)取不同波長量子點分別用磷酸緩衝液(PBS)調pH=6-9，加入EDC (1_(3_ 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽)和NHS (N-羥基硫代琥珀酸亞胺)室溫活化10-60min。
[0013]b)分別對應加入各腫瘤標誌物的相應抗體旋渦振蕩反應0.5_3h。
[0014]c)分別對應加入BSA封閉反應0.5_2h。
[0015]d)離心純化產物。
[0016]取沉澱用PBS緩衝液重懸分散，4°C保存。
[0017]B.試條組件製備:
B)樣品墊1:選用纖維素膜切成一定規格的膜塊，將該膜塊放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的PBS中浸泡，取出，乾燥備用。
[0018]b)紅細胞濾膜2:選紅細胞濾膜切成一定規格膜塊，乾燥備用。
[0019]c)標記墊3:選用玻璃纖維膜切成一定規格膜塊，加入用不同波長量子點對應標記的各腫瘤標誌物抗體的混合物溶液於該膜塊上，乾燥膜塊備用。
[0020]d)分析膜7:選用纖維素膜切成一定規格的膜塊，自膜塊底邊起由下自上相隔一定距離分別噴點0.5-10mg/ml各腫瘤標誌物抗體的混合物作T帶4,噴點0.5-10mg/ml 二抗作C帶5，乾燥膜塊備用。
[0021]吸水墊6:選用具有吸水作用的纖維素膜切成一定規格的膜塊，乾燥備用。
[0022]C.試條組件組裝:
上述製備好的試條組件按樣品墊1、紅細胞濾膜2、標記墊3、分析膜7、吸水墊6順次搭接粘貼於底襯8上，切成一定規格的試條，裝入塑料盒中，與乾燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。
[0023]本發明所述量子點免疫層析試條同步定量多種腫瘤標誌物用的標準曲線的製備方法包括如下步驟:
Ca)配製各腫瘤標誌物標準品系列濃度，並滴加到所述的量子點免疫層析試條上。
[0024](b)用檢測儀分別讀取T帶的螢光強度(ODt)和C帶的螢光強度(0D。)，計算獲得ODtADc 比值或 ODt/ (0Dt+0Dc)比值。
[0025]rc；以標準品系列濃度作X軸，0Dt/0Dc比值作Y軸，或以標準品系列濃度作X軸，ODt/ (0Dt+0Dc)比值作Y軸，得到螢光強度與濃度對應標準曲線。
[0026]本發明所述試條用於同步定量多種腫瘤標誌物的方法包括如下步驟:
用電子標籤存貯標準曲線數據。所述電子標籤包括具有信息存貯功能的RFID (射頻識別標籤)、二維碼、條碼、或IC卡晶片。
[0027](b)存貯有標準曲線數據的電子標籤安裝在量子點免疫層析試條上，或安裝在裝載試條的試條盒上。
[0028]用具有信號檢測功能的檢測儀讀取電子標籤存貯的標準曲線數據並結合檢測儀測得的待測樣品對應的螢光強度而得到樣品中的各腫瘤標誌物濃度。
[0029]本發明具有如下有益效果:
(I)一次加樣即可實現樣品腫瘤標誌物多指標同步快速定量檢測。
[0030](2)所述試條的樣品墊I與標記墊3之間設有紅細胞濾膜2，該紅細胞濾膜(2)可能阻止血液中的紅細胞通過而只能讓其血清濾過，血液樣品毋需用離心設備等分離血清，用全血就能直接進行檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1:本發明所述同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條的結構側視圖圖2:本發明所述量子點免疫層析試條用於同步定量檢測腫瘤標誌物AFP (甲胎蛋白)
和CEA (癌胚抗原)而得到的標準曲線
圖3:本發明所述量子點免疫層析試條用於同步定量檢測AFP和CEA而得到的螢光光譜圖
上述圖1-2中，T表示檢測帶(Test), C表示質控帶(Control)
序號表示如下:
1.樣品墊，2.紅細胞濾膜，3.標記墊，4.檢測帶，5.質控帶，6.吸水墊，7.分析膜，8.底襯。

【具體實施方式】
[0032]實施例:同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條用於同步定量檢測血液腫瘤標誌物AFP、CEA
1.試條結構結合圖1予以說明。圖1中，所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條，其包括順次搭接固定在底襯8上的樣品墊1、紅細胞濾膜2、標記墊3、分析膜7、吸水墊6。
[0033]所述試條的標記墊3為玻璃纖維膜。所述分析膜7為硝酸纖維素膜、尼龍膜、或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜，其上具有檢測帶(即T帶)4和質控帶(即C帶)5。所述底襯8為聚脂或塑料板。
[0034]所述標記墊3包被有CdSe/ZnS QD546標記的AFP單抗(即anti_AFP McAb-QD546)和CdSe/ZnS QD622標記的CEA單抗(B卩ant1-CEA McAb-QD622 )的混合物。所述分析膜7的T帶4包被有AFP抗體(ant1-AFP)和CEA抗體(ant1-CEA)的混合物。所述分析膜7的C帶5包被有二抗質控物羊抗鼠抗體。
[0035]試條製備方法
所述試條的製備方法包括如下步驟: A.量子點偶聯抗體:
a)取發射波長為546nm和622nm的水溶性CdSe/ZnSQD546、CdSe/ZnS QD622分別用PBS緩衝液調pH=6-9，分別加入EDC (1-(3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基硫代琥珀酸亞胺)室溫活化10-60min ；
b)分別加入AFP單抗(即ant1-AFPMcAb),CEA單抗(ant1-CEA McAb)旋渦振蕩反應
0.5-3h ；
c)分別加入牛血清白蛋白(BSA)，避光封閉反應0.5-2h;
d)離心純化各產物；
取各產物沉澱分別用PBS緩衝液重懸分散，得到ant1-AFP McAb-QD546, ant1-CEAMcAb-QD622各量子點偶聯物溶液。4°C保存各量子點偶聯物溶液。
[0036]B.試條組件製備:
a)樣品墊1:選用纖維素膜作材料，將其切成具有一定規格的膜塊，將該膜塊放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的磷酸緩衝液(PBS)中浸泡，取出，乾燥備用。
[0037]b)紅細胞濾膜2:選紅細胞濾膜切成一定規格膜塊，乾燥備用。
[0038]c)標記墊3:選用玻璃纖維膜作材料，將其切成具有一定規格的膜塊，加CdSe/ZnS QD546 標記的 AFP 單抗(即 ant1-AFP McAb-QD546)和 CdSe/ZnS QD622 標記的 CEA 單抗(SPant1-CEA McAb-QD622 )的混合物溶液於該膜塊上，乾燥膜塊備用。
[0039]d)分析膜7:選用硝酸纖維素膜(NC膜)作材料，將其切成具有一定規格的膜塊，自膜塊底邊起由下自上相隔一定距離分別噴點0.5-10mg/ml AFP抗體(ant1-AFP)和
0.5-10mg/ml CEA抗體(ant1-CEA)的混合物作T帶4,噴點0.5-lOmg/ml 二抗質控物羊抗鼠抗體作C帶5，乾燥膜塊備用。
[0040]吸水墊6:選用具有吸水作用的纖維素膜切成一定規格的膜塊，乾燥備用。
[0041]C.試條組件組裝
上述製備好的試條組件按樣品墊1、紅細胞濾膜2、標記墊3、分析膜7、吸水墊6順次相互搭接粘貼於塑料底襯8上，切成一定規格的試條，裝入塑料盒中，與乾燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。
[0042]試條標準曲線建立
Ca)取AFP、CEA標準品分別用磷酸緩衝液(PBS)以倍比稀釋方式配成標準品系列濃度若干份。
[0043](b)將每一標準品濃度分別滴加在10條量子點免疫層析試條上在相同條件下用檢測儀進行檢測(即:每一標準品濃度分別用10條量子點免疫層析試條在相同條件下用檢測儀檢測10次)，分別讀得其T帶螢光強度(ODt)與C帶螢光強度(0D。)，得到平均值和ODt/ODc比值。
[0044]rc；以標準品系列濃度作X軸，以0Dt/0D。比值作Y軸，得到螢光強度與濃度對應標準曲線見圖2。
[0045]也可以標準品系列濃度作X軸，以ODt/ (0Dt+0Dc)比值作Y軸，得到螢光強度與濃度對應標準曲線,本實施例未顯示。
[0046]用量子點免疫層析試條同步定量檢測AFP、CEA 方法如下: 6?)用RFID電子標籤(射頻識別標籤)存貯標準曲線數據(該標準曲線數據也可採用二維碼、條碼、或IC卡晶片等存貯介質進行儲存，本實施例未顯示)。
[0047](b)存貯有標準曲線數據的RFID電子標籤貼附於試條上，或直接貼附在裝載試條的試條盒上。
[0048]Ce)用具有信號檢測功能的檢測儀讀取RFID電子標籤存貯的標準曲線數據並結合檢測儀測得的待測樣品對應的螢光強度而得到樣品中的AFP、CEA濃度。
[0049]圖3所示本發明所述量子點免疫層析試條同步定量檢測血液腫瘤標誌物AFP、CEA時T帶所測得的螢光光譜圖。其中I為AFP的量子點(CdSe/ZnS QD546)突光峰、II為CEA的量子點(CdSe/ZnS QD622 )螢光峰。
[0050]特別需要指出的是:(1)本發明實施例及其附圖僅是為了說明本發明，本領域人員不應以此限制本發明的保護範圍；(2)本發明所述同步定量腫瘤多指標的量子點免疫層析試條及其方法理所當然包括由相同試條結構、原理和方法所實現的腫瘤標誌物單項指標檢測；(3)本發明還可以有其它改進方法。因此，凡是對本發明所述試條及其方法採用任何等同替換或等效變換形成的其它技術方案，均落在本發明權利要求的保護範圍中。
【權利要求】
1.一種同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條，包括順次搭接固定在底襯(8)上的樣品墊(I)、紅細胞濾膜(2)、標記墊(3)、分析膜(7)、吸水墊(6)，分析膜(7)具有T帶(4)和C帶(5),其特徵在於:標記墊(3)包被有不同波長量子點對應標記的各腫瘤標誌物抗體的混合物，分析膜(7)的T帶(4)包被有各腫瘤標誌物抗體的混合物，分析膜(7)的C帶(5)包被有二抗。
2.根據權利要求1所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條，其特徵在於:所述標記墊(3)的量子點包括 ZnS、CdS、HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, CdTe, ZnTe, ZnO, PbSe、HgTe、CaAs、InP、InAs、InCaAs、CdS/ZnS、CdS/Ag2S、CdS/PbS、CdS/Cd (0H)2、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdSe/CuSe, CdSe/HgTe、CdSe/HgSe、CdSe/HgSe/CdSe、CdTe/HgS、CdTe/HgTe、InAs/InP、InAs/CdSe, InAs/ZnSe、MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SeTe, BaS, BaSe, BaTe,CdS:Mn> ZnS:Mn> CdS:Cu> ZnS:Cu> CdS:Tb> ZnS:Tb中的任意一種或任意幾種納米粒子的組合，以及由上述任意一種量子點為核、二氧化矽為殼的核-殼型納米複合粒子。
3.根據權利要求1所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條，其特徵在於:所述標記墊(3)為玻璃纖維膜，所述分析膜(7)為硝酸纖維素膜、尼龍膜、或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜，底襯(8)為聚脂或塑料板。
4.一種如權利要求1所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括如下步驟: A.量子點偶聯抗體: a)取不同波長量子點分別用PBS緩衝液調pH=6-9JpAEDC (1_(3_ 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽)和NHS (N-羥基硫代琥珀酸亞胺)室溫活化10-60min ； b)分別對應加入各腫瘤標誌物的相應抗體旋渦振蕩反應0.5-3h ； c)分別對應加入BSA封閉反應0.5-2h; d)離心純化產物；
取沉澱用PBS緩衝液重懸分散，4°C保存； B.試條組件製備: a)樣品墊(I):選用纖維素膜切成一定規格的膜塊，將該膜塊放入含有0.1%-10%BSA和0.01%-10%Tween 20的PBS中浸泡，取出，乾燥備用； b)紅細胞濾膜(2):選紅細胞濾膜切成一定規格膜塊，乾燥備用； c)標記墊(3):選用玻璃纖維膜切成一定規格膜塊，加入用不同波長量子點對應標記的各腫瘤標誌物抗體的混合物溶液於該膜塊上，乾燥膜塊備用； d)分析膜(7):選用纖維素膜切成一定規格的膜塊，自膜塊底邊起由下自上相隔一定距離分別噴點0.5-10mg/ml各腫瘤標誌物抗體的混合物作T帶(4),噴點0.5-10mg/ml 二抗作C帶(5)，乾燥膜塊備用； W吸水墊(6):選用具有吸水作用的纖維素膜切成一定規格的膜塊，乾燥備用； C.試條組件組裝: 上述製備好的試條組件按樣品墊(I)、紅細胞濾膜(2)、標記墊(3)、分析膜(7)、吸水墊(6)順次搭接粘貼於底襯(8)上，切成一定規格的試條，裝入塑料盒中，與乾燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。
5.一種如權利要求1所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條用於同步定量多種腫瘤標誌物的標準曲線的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括如下步驟: Ca)配製各腫瘤標誌物標準品系列濃度，並滴加到所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條上； (b)用檢測儀分別讀取T帶的螢光強度(ODt)和C帶的螢光強度(0D。)，計算獲得ODt/ODc 比值或 ODt/ (0Dt+0Dc)比值； Tc)以標準品系列濃度作X軸，0Dt/0Dc比值作Y軸，或以標準品系列濃度作X軸，ODt/(0Dt+0Dc)比值作Y軸，得到螢光強度與濃度對應標準曲線。
6.一種如權利要求1所述的同步定量多種腫瘤標誌物的量子點免疫層析試條用於同步定量多種腫瘤標誌物的方法，其特徵在於，該定量方法包括下述步驟: (a)用電子標籤存貯標準曲線數據； O)存貯有標準曲線數據的電子標籤安裝在所述量子點免疫層析試條上，或安裝在裝載試條的試條盒上； 用具有信號檢測功能的檢測儀讀取電子標籤存貯的標準曲線數據並結合檢測儀測得的待測樣品對應的螢光強度而得到樣品中的各腫瘤標誌物濃度。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，其中所述的電子標籤包括具有信息存貯功能的RFID、二維碼、條碼、或IC卡晶片。
【文檔編號】G01N33/574GK104267182SQ201410501474
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月27日 優先權日:2014年9月27日
【發明者】王春英, 馬義才, 侯飛 申請人:成都領御生物技術有限公司