生物材料的化學清洗的製作方法

2023-05-28 05:08:36 1

專利名稱：生物材料的化學清洗的製作方法
技術領域：
本發明屬於組織工程領域。本發明涉及膠原組織，該膠原組織已進行過處理，除去非膠原成分如細胞、細胞碎片和其它細胞外基質成分，如通常見於天然組織中的蛋白聚糖和葡糖胺聚糖。用鹼、螯合劑、酸和鹽處理組織，從膠原組織基質中除去非膠原成分，而同時控制膨脹量和溶解度，使所得的膠原基質保留其結構組織、完整性和可生物改造性能。此方法不需要使用損害性地影響膠原基質的細胞相容性、強度和可生物改造性的洗滌劑和酶。該膠原組織基質用於植入、修補，或用在哺乳動物宿主中。
背景技術：
簡述組織工程領域將工程方法與生命科學的原理結合，以了解正常和病理哺乳動物組織間中結構和功能的關係。組織工程的目標是開發和最終應用生物替代物來恢復、保持或改善組織功能。(Skalak，R.和Fox，C.F.，「組織工程」，Alan R.Liss Inc.N.Y.(1988))。
膠原是體內的主要結構蛋白，其構成總的體內蛋白的大約三分之一。它包括皮膚、腱、骨和牙中的大部分有機物質，且作為纖維狀包含物出現在許多其它身體結構物中。膠原的一部分性能是其高拉張強度；其離子交換能力，這點部分是由於電解質、代謝物和藥物的結合；其低的抗原性，這點是由於通過螺旋結構遮蓋蛋白抗原的決定體，和其低的伸長性、半滲透性和溶解性。再者，膠原是細胞粘合的天然物質。這些性能以及其它的性能使膠原適合作為可植入生物替代物和可生物改造假體的組織工程和生產的材料。
由於膠原是這些生物替代物中佔大多數的成分，因此需要一種方法來獲得質量穩定的充分量的膠原。目前需要一種改進的方法來除去非膠原成分如細胞、細胞碎片和其它細胞外基質成分，如通常見於天然組織中的蛋白聚糖和葡糖胺聚糖，以產生基本上純的天然膠原基質。一般認為，這些非膠原結構物中有一些是抗原，當植入宿主中時，將誘發慢性炎症反應。現有技術有許多清洗這些膠原組織的方法，然而，這些方法導致膠原成(composition)帶有不同的特性。所用的方法應當是可保持適用於組織工程中的膠原和膠原組織的生物和物理性能的一種方法。
在處理膠原組織，產生基本上是膠原基質的現有技術中，常規地使用洗滌劑和表面活性劑，將細胞和脂質體從組織中萃取出來。洗滌劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)，是兩親分子，其中疏水區結合到蛋白上，並相信增加了此蛋白的負電荷。當植入時，由於電荷的增加導致由於有更多的水被此分子的親水區結合而產生的組織膨脹和破壞氫鍵結合而產生的膠原的熱穩定性降低。膨脹一則使膠原分子的結構打開，使之對細胞酶如膠原酶敏感，二則使膠原基質不穩定，造成構建(construction)弱化。(Courtman等，生物醫學材料研究雜誌，28655-666，1994)。再者，人們認為，SDS殘留物仍結合在膠原上，並阻止細胞遷移入植入物中。(Wilson，G.J等，Ann Thorac Surg，60S353-8，1995；Bodnar E等，「Damage of aortic valvetissue caused by the surfactant sodium dodecyl sulfate，」Thorac cardixvascSurg，3482-85，1986)。由於用在化學清洗方法中的洗滌劑可以不良地結合上並改變在處理的組織中的膠原的可生物改造性，因此本發明者開發出一種不需要洗滌劑的方法。
用酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶和膠原酶化學清洗組織是本領域中已知的，但它的應用將導致天然膠原分子改性，並將不利地影響構建的結構完整性。膠原組織的酶處理在現有技術中已知用來除去和/或修飾與細胞外基質有關的蛋白。蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、分散酶或嗜熱菌蛋白酶在除去膠原端肽中使用，產生非端肽膠原。膠原端肽是膠原分子的非三螺旋部分，被某些研究者認為是弱抗原性的，而另一些研究人員則認為其與膠原的強機械性能有關。膠原組織的有限消化將除去端肽，而不將組織的膠原基質解離，而長時間的消化將解離膠原原纖維成非端肽膠原單體。現有技術中同樣已知，使用酶(它分別通過使用RNA酶和DNA酶來消化內源RNA和DNA)修飾和除去基質中的核酸。由於用酶處理可以影響膠原的結構完整性，本發明的方法包括它們的使用。
從外植哺乳動物組織獲得膠原組織和組織結構物的方法，和由此組織構建假體的工藝，已廣泛用於外科修復或組織和器官的更換中。將此組織一般性地處理，除去有潛在細胞毒性作用的細胞成分和非膠原成分，留下天然組織基質。也進行過對進一步處理的研究，所述處理如交聯、消毒或形成形狀。處理膠原組織，從組織化的組織基質中除去組織成分的現有方法採用洗滌劑、酶或促進基質的無控制的膨脹。Jaffe等的WO 95/28183公開了降低或防止生物假體心臟瓣膜供給礦質後植入方法。此公開的方法提供由控制自溶的非細胞製成的生物材料。自溶是在預選的pH下，使用至少一種緩衝溶液控制進行的，使存在於組織中的自溶酶降解細胞結構成分。Stone的USP 5,007,934，以及Li等的USP 5,263,984均公開了化學清洗韌帶組織的多步驟方法。該方法利用洗滌劑除去與細胞膜或膠原組織有關聯的類脂。Janzen等的USP 5,523,291公開了一種粉碎的可注射植入物組合物，用於從項韌帶得到的軟組織增加。此韌帶用氫氧化鈉強鹼性溶液，接著是鹽酸溶液，之後是碳酸氫鈉進行了一系列浸泡處理。Eckmayer等的USP 5,028,695公開了膠原膜的生產工藝，其中膠原組織是用強鹼，隨後用強酸處理一段時間來重複處理，之後再用無機鹽處理來收縮該膜，之後用溶劑來乾燥之。
發明概述本發明公開了可生物改造的膠原組織基質和化學清洗天然組織產生此組織基質的方法。
本發明克服了獲得基本上是膠原的可生物改造的組織基質的困難。本發明提供可以用作假體用具或用在修復、增加或替代損害和有病的組織與器官的材料的組織基質。
本發明的化學清洗方法使生物材料如天然組織和組織結構物基本上無細胞和基本上無非膠原成分，而同時保持膠原組織基質的結構完整性。由於在化學清洗過程中不用洗滌劑，因此不存在通常會結合於組織基質的洗滌劑殘留物。由於不使用酶，膠原端肽仍留在膠原分子上。該方法包含將正常的細胞天然組織在鹼性pH下與螯合物劑接觸，將此組織在酸性pH下與鹽溶液接觸，並將此組織在生理pH下與鹽溶液接觸，最後淋洗所得的化學清洗後的組織基質。
本發明涉及化學清洗後的由天然的正常細胞組織得到的組織基質。清洗的組織基質是基本上是完好無損地歸還的膠原，它基本上無糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、類脂、非膠原蛋白和核酸如DNA和RNA。重要的是，由於沒有對膠原可生物改造性有不利影響的結合著的洗滌劑殘留物，從而保留了組織基質的可生物改造性。再者，由於在清洗過程中膠原未經受用酶處理或修飾，膠原分子的端肽區完好無損，因此膠原是端肽膠原。
膠原材料通常保持組織得到時的總體形狀，但它可能疊層和結合在一起，形成多層片、管或複雜的成形假體。本發明的結合的膠原層是結構上穩定、柔韌、半透和可縫合的。當此基質材料植入哺乳動物宿主時，經受生物降解，並伴隨著足夠的活細胞替代或新組織形成，這樣原植入的材料最終被改造並由宿主產生的組織和細胞替代。
因此，本發明的目的是提供一種清洗天然組織，產生不表現出與許多現有技術方法有關的許多缺點的組織基質。本發明方法不用洗滌劑或酶而有效地除去天然組織的非膠原成分，產生包含基本上是膠原的組織基質。
另一目的是提供一種可生物改造的組織基質材料，它將允許和利於在植入位點上的組織內生長和/或器官再生。由此材料製成的假體，當移植到受體宿主或患者中時，同時進行可控制的生物改造和充分的活細胞替代，這樣，原植入假體被患者的活細胞改造，形成再生的器官或組織。
本發明的再一目的是提供一種在自移植、異體移植和異種移植適應徵(indication)中使用新穎的多目的可生物改造基質材料的方法。
另一目的是提供可以使用常規外科技術植入的新穎的組織基質材料。
發明詳述本發明提供一種處理用於移植的天然膠原組織的方法。本處理方法設計來產生一種可植入、可移植的膠原生物組織材料—一種包含膠原的細胞外基質，它作為可以由宿主在體內或通過體外的培養物中的活細胞改造的框架(scaffold)。
本發明還涉及一種由處理的天然膠原組織形成的組織工程假體，當植入哺乳動物宿主時，它可以作為功能修補、增加或替代身體部分或組織結構，和經受宿主細胞改造之同時出現的控制的生物降解。該組織材料可以用作假體，用於自移植、異體移植和異種移植適應徵。本發明的假體，在其種種實施方案中，具有雙重性能首先，它用作身體部分替代品，第二，在仍作為身體部分替代品的同時，作為用於宿主細胞向內生長的改造模板。雖然假體將通過各種用具和構建物的結構進行說明，但本發明並不僅限於這些。應當理解，在其材料、形狀和厚度方面進行的用具設計是根據結構物的最終適應徵來選擇的。
本發明的化學清洗方法使生物材料，如天然組織和組織結構物，基本上無細胞和基本上無非膠原成分，而同時保持了膠原組織基質的結構完整性。彈性蛋白有時少量存在於天然組織中，並不被化學清洗方法除去。彈性蛋白的存在在某些應用中是需要的。如本文中所用的，術語「基本上無細胞」是指比天然態的生物材料少至少95％的天然細胞和細胞結構物。「細胞和細胞結構物」是指細胞(活或不活)、細胞存留物、細胞膜和膜結構物。使用主語「基本上無非膠原成分」是指糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、類脂、非膠原蛋白和核酸如DNA和RNA佔在所得的組織基質乾重的不到5％。由於在本化學清洗過程中不使用洗滌劑，因此不存在通常會結合到組織基質上的洗滌劑殘留物。由於不使用酶，因而膠原端肽保留在膠原分子上。再者，當使用滅菌設備、溶液和無菌技術處理時，本化學清洗方法可使生物材料無菌和無內毒素。
術語「結構完整性」是指化學清洗的膠原組織基質承受拉張、壓縮和支撐的能力。即使在化學處理期間會出現一定的膨脹，但由於化學處理步驟中的膨脹被最小化，因此生物材料的結構完整性仍得到保留。不進行控制或過度的膨脹一方面打開了膠原分子的結構，使之對細胞酶如膠原蛋白酶敏感，另一方面又使膠原不穩定，造成構造弱化。當膨脹影響膠原分子的分子內結構時，其通過破壞膠原分子間的天然交聯，在分子內水平上影響材料的總體結構。膠原分子的結構和膠原分子間的交聯一起為材料提供結構完整性。
保持大多數其天然結構完整性的組織基質材料是有用的，例如，當用作假體用具或用作構建多層或複雜用具時。如果材料用於執行負載承受功能如體壁支持物、血管用具或牙科用具，則材料的完整性是很重要的。涉及結構完整性時，術語「可縫合」是指材料的機械性能包括在將假體縫合至天然組織時(一種被稱作吻合術的方法)，允許針和縫合材料穿過假體材料的縫合保持。在縫合時，這些假體不會因縫合所帶來的張力而撕裂，且當縫合打結時，它們也不會被撕裂。假體材料的可縫合性，即，假體縫合時的抗撕裂能力，與假體材料的固有機械強度、移植物的厚度、施加於縫合物的張力和拉緊節的速率有關。
本發明中所定義的生物材料包括但不限於來源於人、牛、豬、狗、羊、貓和馬的採集的哺乳動物組織及其結構物。組織結構物如真皮、動脈、靜脈、心包、心臟瓣膜、硬腦脊膜、腱、腸和筋膜是優選的組織結構，其可以通過本發明方法清洗，產生基本上無細胞和基本上無非膠原成分的組織基質。
哺乳動物組織的優選來源是從小腸，最優選是從豬小腸得的被膜黏膜下層(tunica submucosa)。在天然的小腸中，被膜黏膜下層是器官的連接組織層，且包括淋巴和血管細胞。獲得被膜黏膜下層的方法公開在WO96/31157中，該文被本文引用。為獲得豬被膜黏膜下層(也被稱為「黏膜下層」)，將豬小腸收集，並機械剝離，優選使用腸清洗機械(Bitterling，諾丁漢，英國)。腸清洗機械通過機械作用和水洗滌作用，強行除去脂肪、肌肉和黏膜層。機械作用可以描述為一系列的滾輥(roller)，當無損的腸在其間移動時，滾輥壓緊並將接續的層剝離被膜黏膜下層。由於小腸的被膜黏膜下層比周圍的組織相對而言要更堅硬，因此來自黏膜下層的較軟的成分從被膜黏膜下層除去。機械清洗的結果是，將來自被膜黏膜下層管腔(ablumen)的腸繫膜組織、被膜絨膜和被膜肌肉以及來自被膜黏膜下層腔的被膜黏膜層從被膜黏膜下層除去，這樣只留下腸的被膜黏膜下層。被膜黏膜下層的化學清洗的組織基質也稱作「腸膠原層」或「ICL」。值得說明的是，在一些動物來源中，如食肉動物和雜食動物中，小腸包括緻密層，這一層大部分通過此機械清洗步驟除去。
機械剝離小腸不同層的其它方法是本領域已知的，如Badylak的USP4,902,508中描述的，該文被本文引用。此專利公開的方法包括柔和地磨擦腸組織，除去管腔層(包括被膜絨膜和被膜肌肉)和至少由被膜黏膜的腔部分組成的內層。餘下的層是被膜黏膜下層及由黏膜肌層和(如果最初存在於所採集的哺乳動物組織中的)緻密層組成的附著基礎層。用任一種方法獲得的腸材料均可以通過許多方法，包括縫合、訂合、粘合組合物、化學結合和熱結合，植入或預形成人體壁或血管用具中。
與某些操作參數有關的術語如量、時間和溫度是針對全文和實施例定義的，這些術語可以有所變化，而不偏離本發明的精神與範圍。在本文中，「有效量」是指獲得所需效果而需要的組合物的體積與濃度。優選組織進行化學清洗的有效量是溶液與組織之比為100∶1v/v，但是體積的多或少可以由普通技術人員通過考慮意欲清洗的組織的形狀、外形體積、厚度、密度和細胞構成性來確定。當考慮到意欲清洗的組織的細胞構成性、基質密度和厚度時，本領域普通技術人員會清楚有效的化學步驟所需的時間。較大、較厚或較密的材料需要較長的時間以使溶液滲透入組織並在其中平衡。環境溫度和用於本發明的溶液溫度優選是常溫，大約為25℃，但可以在高於所用溶液的冰點溫度以上至低於意欲處理的組織材料的變性溫度之間。大約47℃至大約45℃間的溫度足以進行有效的化學處理。攪拌是指機械震動或機械混合，用來改善化學成分向組織中的滲透作用，並減少有效地化學處理所需的時間。術語「緩衝溶液」是指一種含水溶液，其含有至少一種可保持溶液的氫離子濃度或pH的試劑。
在優選的方法中，採集的組織可能需要手工清洗，如通過粗解剖，和/或機械清洗多餘的組織如脂肪和肌肉。在加工或進行最有效地化學處理期間，為了操作的可處理性，對於一些組織可能會需要手工清洗。
組織先通過將組織與有效量的螯合劑，優選是鹼接觸，以可控制地限制組織基質的膨脹。螯合劑通過降低二價陽離子濃度，提高將細胞、細胞碎片和基礎膜結構物從基質中除去的作用。鹼處理將糖蛋白和糖胺聚糖與膠原組織解離，並皂化類脂。本領域已知的可以使用的螯合劑包括，但不限於，乙二胺四乙酸(EDTA)和亞乙基雙(氧乙烯次氮基)四乙酸(ethylenebis(oxyethylenitrilo)tetraacetic acid，EGTA)。EDTA是優選的螯合劑，且可以通過加入氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鈣(Ca(OH)2)、碳酸鈉或過氧化鈉而變得更鹼性。EDTA或EGTA濃度優選介於大約1至大約200mM間；更優選介於大約50至大約150mM間；最優選在大約100mM左右。NaOH濃度優選介於大約0.001至大約1M間；更優選介於大約0.01至大約0.10M間；最優選在大約0.01M左右。其它鹼或鹼性試劑可以由本領域普通技術人員確定，使螯合溶液的pH在有效鹼性pH範圍內。鹼性螯合溶液的最終pH應優選介於大約8至大約12之間，但更優選介於大約11.1至大約11.8之間。在最優選的實施方案中，組織與100mM EDTA/10mMNaOH的水溶液接觸。組織優選是通過浸入鹼性螯合劑中來接觸的，而更有效的處理是通過將組織與溶液一起攪拌一段對處理步驟而言有效的時間來獲得。
之後組織與有效量的酸性溶液，優選含有鹽的溶液接觸。酸處理同樣起除去糖蛋白和糖胺聚糖以及除去非膠原蛋白和核酸如DNA和RNA的作用。鹽處理在酸處理期間控制膠原組織基質的膨脹，並涉及將一些糖蛋白和蛋白聚糖從膠原基質中除去。本領域已知可以使用的酸溶液包括但不限於鹽酸(HCl)、乙酸(CH3COOH)和硫酸(H2SO4)。優選的酸是鹽酸，其濃度優選介於大約0.5至大約2M，更優選介於大約0.75至大約1.25M；最優選在大約1M左右。酸/鹽溶液的最終pH優選介於大約0至大約1，更優選介於大約0至0.75，且最優選介於大約0.1至大約0.5之間。鹽酸和其它強酸對於破壞核酸分子而言是最有效的，弱酸卻不那麼有效。可以使用的鹽優選是無機鹽，包括但不限於氯化物鹽如氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)和氯化鉀(KCl)，而其它有效的鹽可以由本領域技術人員確定。優選的氯化物鹽的使用濃度優選介於大約0.1至大約2M；更優選介於大約0.75至大約1.25M；最優選在1M左右。優選用於此方法的氯化物鹽是氯化鈉(NaCl)。在最優選的實施方案中，組織與1M HCl/1M NaCl的水溶液接觸。組織優選浸入酸/鹽溶液中，通過將組織與溶液一起攪拌一段對處理步驟而言有效的時間來獲得有效的處理。
之後將組織與有效量的鹽溶液，優選與緩衝到大約生理pH的溶液接觸。緩衝的鹽溶液中和該材料，同時降低膨脹。可以使用的鹽優選是無機鹽且包括但不限於氯化物鹽如氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)和氯化鉀(KCl)；和含氮鹽如硫酸銨(NH3SO4)，其它有效的鹽可以由本領域技術人員確定。優選的氯化物鹽的使用濃度優選介於大約0.1至大約2M之間；更優選介於大約0.75至大約1.25M之間；最優選在大約1M左右。優選的用在本方法中的氯化物鹽是氯化鈉(NaCl)。緩衝劑是本領域已知的且包括但不限於磷酸鹽和硼酸鹽溶液，其它的緩衝劑可由本領域普通技術人員針對本方法確定。一種優選的緩衝鹽溶液的方法是優選加入磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)，其中對於鹽溶液來說，磷酸鹽濃度是大約0.001至大約0.02M且鹽濃度是大約0.07至大約大約0.3M。此溶液的pH優選介於大約5至大約9，更優選介於大約7至大約8，最優選介於大約7.4至大約7.6之間。在最優選的實施方案中，組織與pH介於大約7.0至大約7.6的1M氯化鈉(NaCl)/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)接觸。該組織優選通過浸入在緩衝的鹽水溶液中接觸，通過將組織與溶液一起攪拌一段對處理步驟而言有效的時間來獲得有效的處理。
在化學清洗處理後，優選通過將組織與有效量的淋洗劑接觸，淋洗至無化學清洗劑。可以使用的試劑如水、等滲鹽溶液和生理pH緩衝的溶液，其與組織接觸一段足以除去清洗劑的時間。優選的淋洗溶液是生理pH緩衝鹽水如磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)。淋洗帶有化學清洗劑的組織的其它方式可以由本領域技術人員確定。將組織與鹼性螯合劑接觸和將組織與含有鹽的酸溶液接觸的清洗步驟可以任一種順序實施，獲得基本上相同的清洗效果。然而，不可將溶液組合而只進行一步處理。
本發明的優選組成(composition)是由天然正常細胞組織得到的化學清洗過的組織基質。清洗過的組織基質基本上是大約93％乾重的無細胞端肽膠原與低於大約5％乾重的糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、類脂、非膠原蛋白和核酸如DNA和RNA。重要的是，由於組織中沒有對膠原可生物改造性有不利影響的結合著的洗滌劑殘留物，因此組織基質的可生物改造性得到保留。此外，由於在清洗過程中，組織未經酶處理，因此膠原分子的端肽區保留下來。
組織基質是從真皮、動脈、靜脈、心包、心臟瓣膜、硬腦脊膜、腱、腸和筋膜得到的。最優選的組成是由小腸得到的化學清洗過的腸膠原層。適合的小腸來源是哺乳動物有機體如人、牛、豬、羊、狗、山羊和馬，其中豬小腸是優選的來源。在一優選的實施方案中，膠原層包括得自豬小腸的被膜黏膜下層。另一實施方案中，膠原層包括小腸的被膜黏膜下層和基底層。基底層由層黏膜肌層和緻密層(如果它存在於天然組織中)組成。
最優選的本發明組成是腸膠原層，用本發明化學清洗方法清洗過，它基本上是膠原，主要是I型膠原，與少於大約5％乾重的糖蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、類脂、非膠原蛋白和核酸如DNA和RNA。膠原層中沒有對膠原的可生物改造性有不利影響的結合著的洗滌劑殘留物。膠原層基本上沒有細胞和細胞碎片，包括內源核酸如DNA和RNA和類脂。再者，當使用滅菌設備、溶液和無菌技術處理時，腸膠原層是無菌且無內毒素的。
一旦膠原組織基質提供了基本上無細胞和基本上無非膠原外細胞基質成分，則可將其用於生產植入或移植的假體。膠原層可以通過使用任一種本領域已知的技術來縫合或結合在一起。用於結合所述層的方法可以採用粘合劑如凝血酶、纖維蛋白或合成材料如氰基異丁烯酸酯或化學交聯劑。其它方法可以採用由雷射、光或微波產生的熱。也可以採用對流爐或加熱液體浴。
膠原層的熱焊接是將本發明的膠原層結合在一起的優選方法。膠原的熱焊接方法描述於WO 95/22301、WO 96/31157和USP 5,571,216，本發明引入這些技術作為參考。ICL(腸膠原層)先是被沿縱向切開，平放在固體平板上。之後將一或多個連續的層一一加上，優選改成垂直方向。第二個固體平板放置在層的上方，並將二個板緊緊夾在一起。之後將完成的裝置，夾著的板和膠原層，在足以進行膠原層結合的條件下加熱一段時間。施加的熱量應當足夠的高，以使膠原結合，但不應高到造成膠原不可逆的變性。加熱和結合的時間將取決於所用的膠原材料層類型、材料的水分和厚度和所施加的熱。加熱的典型範圍是大約50℃至大約75℃，更典型的是60℃至65℃，且最典型的是62℃。時間的典型範圍是大約7分鐘至大約24小時，典型的是大約一小時。加熱程度和加熱的時間長短易於通過變化熱和時間參數，用常規實驗確定。結合步驟可以在常規烘箱中完成，但也可以採用其它的裝置和加熱器具，它們包括但不限於水浴、雷射能或電熱傳導進行。緊接著加熱和結合之後，將膠原層用空氣或水浴在20℃至1℃間的室溫範圍內用空氣或水浴冷卻。需要用快速冷卻，術語稱作驟冷，結束加熱作用，並產生膠原層間的有效結合。為完成此步驟，膠原層可以典型的在水浴中冷卻，所用的溫度優選是大約1℃至大約10℃，最優選的是4℃。雖然低於1℃的冷卻溫度也可使用，但需要小心，不使膠原層冷凍，冷凍會造成結構損害。此外，高於10℃的溫度可以在驟冷中使用，但如果驟冷溫度太高，則冷卻速率太慢，膠原層相互間的固定不充分。
在優選的實施方案中，膠原材料被交聯。交聯賦予形成的假體構建物增加的強度和結構完整性，同時在此構建物植入患體時，通過細胞調節膠原的可生物改造性。膠原交聯劑包括戊二醛、甲醛、碳化二亞胺、六亞甲基二異氰酸酯、二亞氨酸酯(bisimidate)、乙二醛、己二醯氯、二醛澱粉、和某些聚環氧化合物如乙二醇二縮水甘油醚、聚醇聚縮水甘油醚和二羧酸二縮水甘油酯。也可以使用脫氫熱、UV照射和/或糖介導法。膠原也可以在室溫下老化而自然交聯。然而，交聯劑不限於這些，也可以採用其它本領域技術人員已知的交聯劑和方法。應當選擇交聯劑，以產生能被宿主細胞改造的生物相容材料。優選的交聯劑是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。含有EDC和水的交聯溶液也可以含有丙酮。用EDC交聯業已描述於國際專利申請公開WO 95/22301和WO 96/31157中。
在一些實施方案中，額外的膠原層可以在交聯前或後，加到結合的膠原層的外或內表面上。在管狀構建物中，如在血管構建物中，可以將緻密原纖維膠原加到腔表面，產生平滑流動表面，用於其最終應用，如在國際專利申請公開WO 95/22301中描述的那樣，該文被本文引用作為參考。此平滑膠原層同樣促進宿主細胞連接，如在新內膜形成時，它有利於構建物的向內生長和生物改造。如在國際專利申請公開WO 95/22301中描述的，平滑膠原層可以由酸提取的原纖維或非原纖維膠原製成，它主要是I型膠原，但也可以包括其它類型的膠原。所用的膠原可以由任一種哺乳動物源，典型的是牛、豬或羊皮膚或腱得到。膠原優選用酸提取處理，得到高純度的原纖維分散體或凝膠。膠原可以是由膠原源使用弱酸，如乙酸、檸檬酸或甲酸酸提取而得。一旦提取入溶液，膠原可以使用氯化鈉進行鹽沉澱，然後回收，使用標準的技術如離心或過濾。由牛腱中酸提取的膠原的詳情描述於例如USP 5106949中，該文被本文引用作為參考。
肝素可以通過各種已熟知的技術施加到假體上。例如，肝素可以用下列三種方式加入假體。其一，可以通過將假體浸蘸苯甲烴銨肝素(benzalkonium heparin，BA-Hep)溶液，之後風乾之，將BA-Hep溶液施加到假體上。此步驟用離子結合的BA-Hep配合物處理膠原。其二，EDC可以用來活化肝素，之後將肝素共價結合至膠原纖維上。其三，可以用EDC來活化膠原，之後共價結合魚精蛋白至膠原上，之後離子結合肝素至魚精蛋白上。許多本領域已知的其它塗敷、結合和連接步驟同樣也可以使用。
組織基質材料的處理也可以用藥劑如生長因子或藥物與肝素一起或替代肝素來完成。例如，藥劑可以包括例如，促進血管形成和上皮形成的生長因子，如由生長因子衍生的巨噬細胞(MDFG)，由生長因子衍生的血小板(PDGF)，由生長因子衍生的血管內皮細胞(VEGF)；抗任何來自外科植入潛在感染的抗生素；或當假體用作神經再生的導管時引入內部膠原層的神經生長因子。構建物中還可以包括與藥劑一起的或用於替代藥劑的基質成分如蛋白聚糖或糖蛋白或糖胺聚糖。
由此形成的膠原假體可以用中性pH的稀過乙酸溶液滅菌。將膠原滅菌的方法描述於USP 5,460,962中，該文被本文引用作為參考。在優選的方法中，膠原用中性pH的稀過乙酸溶液消毒。過乙酸的濃度優選是大約0.01至0.3v/v％水溶液，中和後的pH介於大約pH6至8之間。另一種選擇是，用咖瑪照射滅菌，典型的是用2.5Mrad的強度，或也可以使用氣體等離子體滅菌。也可以使用本領域已知的其它方法來將膠原滅菌。
提供下列實施例旨在對本發明的實施作更好的闡述，不應被理解為以任何方式限制本發明的範圍。本領域技術人員知道，對於在此描述的方法可以有各種修改，但並不偏離本發明的精神與範圍。
實施例實施例1機械剝離的豬小腸的化學清洗採集豬小腸，並機械剝離，使用Bitterling腸清洗機(英國諾丁漢)，該清洗機械使用機械作用和水洗滌作用，強制性地從被膜黏膜下層除去脂肪、肌肉和黏膜層。機械作用可以描述為一系列的滾輥，當無損的腸在滾輥間通過時，滾輥壓制並從被膜黏膜下層剝離接續的層。由於小腸的被膜黏膜下層比周圍的組織相對而言要更硬和挺，因此來自黏膜下層的較軟的成分被滾輥從被膜黏膜下層壓出。機械清洗的結果是只留下腸的被膜黏膜下層。餘下步驟是在無菌和在室溫下進行的。化學溶液均在室溫下使用。之後將腸縱向切下腔，之後切成15cm的段。將材料稱重，並以大約100∶1v/v的溶液與腸材料的比放置於容器中。
A.向每一裝有腸的容器中加入大約1L的0.22mm(微米)過濾紙(filter)滅菌的100mM乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約18小時。震蕩之後，將EDTA/NaOH溶液從每一容器中除去。
B.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M鹽酸(HCl)/1M氯化鈉(NaCl)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約6至8小時。震蕩之後，將HCl/NaCl溶液從每一容器中除去。
C.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M氯化鈉(NaCl)/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約18小時。震蕩之後，將NaCl/PBS溶液從每一容器中除去。
D.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的10mM PBS。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約2小時。震蕩之後，將磷酸鹽緩衝的鹽水從每一容器中除去。
E.最後，向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的水。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約一小時。震蕩之後，將水從每一容器中除去。
將處理後的樣品切割、固定，用於組織分析。在對照和處理的組織的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的組織樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例2豬心臟瓣膜的化學清洗從1磅小豬獲得豬心，並用擱在冰上的生理pH鹽水裝運。4小時內，使用解剖刀和鑷子將心臟瓣膜從心臟中取出。進行一些進一步的粗解剖，從心瓣周圍除去多餘的組織。一隻瓣膜作為對照，切下樣品塊並固定，用於各種組織分析，另一瓣膜經受化學清洗過程。餘下的步驟在無菌條件和在室溫下進行。化學溶液均在室溫下使用。
將心瓣(valve)置於100mM EDTA/10mM NaOH的1L溶液中大約18小時，同時在震蕩器平臺上攪拌。之後將此心瓣置入1L的1M HCl/1M NaCl中並攪拌8小時。接著將此心瓣置入1L的1M HCl/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)中並攪拌約18小時。之後過攪拌，邊將心瓣用PBS淋洗大約2-4小時，最後用無菌水淋洗大約1小時。將處理的樣品塊切開並固定，用於各種組織分析。
在對照和處理的心瓣的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的心瓣樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例3豬動脈、心包和筋膜的化學清洗從450磅的大母豬中獲得股動脈、整個心包和筋膜的片斷。這些組織用擱在冰上的生理pH鹽水裝運。將這些進一步解剖，除去多餘的組織。每一組織的樣品不經清洗，作為對照樣品，並固定，用於各種組織分析，而此組織餘下的部分經受化學清洗過程。餘下的程序在無菌條件和在室溫下進行。化學溶液均在室溫下使用。
將組織分別置於100mM EDTA/10mM NaOH的1L溶液中並在震蕩器平臺上攪拌大約18小時。之後將組織各自分別置入1L的1M HCl/1M NaCl中並攪拌8小時。接下來，將組織分別置入1L的1M HCl/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)中並攪拌18小時。之後過攪拌，邊將組織分別用PBS淋洗大約2-4小時，最後用滅菌水淋洗大約1小時。將處理的樣品塊切開並固定，用於各種組織分析。
在對照和處理的心瓣的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的組織樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例4不同順序的化學清洗本方法在無菌條件和在室溫下進行。化學溶液均在室溫下使用。
機械剝離的豬腸如實施例1中所述切成五個15cm的段。
向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M鹽酸(HCl)/1M氯化鈉(NaCl)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約8小時。震蕩之後，將HCl/NaCl溶液從每一容器中除去。
向每一容器中加入大約1L的0.22mm(微米)過濾紙滅菌的100mM乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約18小時。震蕩之後，將EDTA/NaOH溶液從每一容器中除去。
向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M鹽酸(HCl)/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約18小時。震蕩之後，將NaCl/PBS溶液從每一容器中除去。
向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的10mM PBS。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約1小時。震蕩之後，將此磷酸鹽緩衝的鹽水從每一容器中除去。
最後，向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的水。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約一小時。震蕩之後，將水從每一容器中除去。
切下處理的樣品塊並固定，用於組織分析。在對照和處理的組織的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的組織樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例5不同的鹼和螯合劑根據實施例1中所描述的方法清洗機械剝離的豬腸黏膜下層。本方法在無菌條件和在室溫下進行。化學溶液均在室溫下使用。按照實施例1的化學清洗程序，但用其它的類似性質的鹼螯合劑來替代其步驟A中的鹼螯合劑A.向每一裝有腸的容器中加入大約1L的0.22mm(微米)過濾紙滅菌的或者是100mM亞乙基雙(氧乙烯次氮基)四乙酸(EGTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液；100mM EDTA/10mM氫氧化鈣(Ca(OH)2)溶液；或者是100mM EDTA/10mM碳酸鉀(K2CO3)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約18小時。震蕩之後，將鹼性螯合劑溶液從每一容器中除去。
B.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M鹽酸(HCl)/1M氯化鈉(NaCl)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上震蕩大約6至8小時。震蕩之後，將HCl/NaCl溶液從每一容器中除去。
C.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M氯化鈉(NaCl)/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約18小時。震蕩之後，將NaCl/PBS溶液從每一容器中除去。
D.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的10mM PBS溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約1小時。震蕩之後，將此磷酸鹽緩衝的鹽水從每一容器中除去。
E.最後，向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的水。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約一小時。震蕩之後，將水從每一容器中除去。
將樣品固定，用於組織分析。在對照和處理的組織的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的組織樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例6不同的酸和鹽試劑根據實施例1中所描述的方法清洗機械剝離的豬腸黏膜下層，在步驟B中使用替代的酸試劑或替代的鹽試劑進行化學清洗。本方法在無菌條件和在室溫下進行。化學溶液均在室溫下使用。
A.向每一裝有腸的容器中加入大約1L的0.22mm(微米)過濾紙滅菌的100mM乙二胺四乙酸四鈉鹽(EDTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約18小時。震蕩之後，將EDTA/NaOH溶液從每一容器中除去。
B.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的或者是1M乙酸(CH3COOH)/1M氯化鈉(NaCl)溶液；或者是1M H2SO4/1M NaCl溶液。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約6至8小時。震蕩之後，將溶液從每一容器中除去。
C.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的1M氯化鈉(NaCl)/10mM磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約18小時。震蕩之後，將NaCl/PBS溶液從每一容器中除去。
D.向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的10mM PBS。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約1小時。震蕩之後，將此磷酸鹽緩衝的鹽水從每一容器中除去。
E.最後，向每一容器中加入大約1L的0.22mm濾紙滅菌的水。之後將容器放置於轉速為大約200rmp的震蕩器臺上大約一小時。震蕩之後，將水從每一容器中除去。
切下處理後的樣品塊並固定，用於組織分析。在對照和處理的組織的橫斷和縱斷樣品上進行Hemotoxylin與eosin(H E)和Masson三色染色。處理的組織樣品表現為無細胞和細胞碎片，而對照樣品表現正常並如所預期的有非常多的細胞。
實施例7用乙酸纖維素凝膠電泳和Alcian藍分析測定ICL(腸膠原層)的糖胺聚糖(GAG)含量為確定ICL的GAG含量，用化學清洗的ICL的提取液進行乙酸纖維素電泳，隨後進行Alcian藍染色。
將經過概述於實施例1中的化學清洗方式的ICL樣品切成0.125cm2的片，並放置入微量離心管中。為消化樣品，向每一管中加入100μl木瓜蛋白酶(在0.1M磷酸鈉中的0.1mg/ml木瓜蛋白酶、0.1M氯化鈉、0.005MEDTA、0.9mg/ml半胱氨酸中，pH5.8)，並將之在60℃下溫育大約18小時。平行製備含有已知量GAG(肝素)的標準。之後加入Dowex(0.4g HCl形式)和3ml水。在旋轉除去Dowex樹脂後，取出1ml並凍幹。之後將樣品於100μl純化水中再水合，並離心大約5分鐘。
使用Newton等人(1974)的方法，將樣品分到乙酸纖維素板(sheet)上。將乙酸纖維素板浸泡於0.1M氯化鋰/EDTA緩衝液(pH5.8)中，輕輕滲開。將樣品(各5μl)塗在板的陰極端，並在5mA下電泳30分鐘。
電泳之後，將板即刻浸入Alcian藍染色溶液(0.2％Alcian藍8GX，0.05M氯化鎂、0.025M乙酸鈉緩衝液(pH5.8)的50％乙烯(ethylene alcohol)醇溶液)並在室溫下放置于震蕩器平臺上大約30分鐘。之後將板用至少三次脫色溶液(0.05M氯化鎂、0.025M乙酸鈉緩衝液(pH5.8)的50％乙烯醇溶液)在震蕩器平臺上總計脫色大約30分鐘。用肝素消化的ICL未觀察到GAG染色，並且只可查出低到0.005微克的肝素標準。
這些結果顯示，留在化學清洗過的ICL的GAG的總量低於1％(乾重)。
實施例8用二氯甲烷提取測定的ICL類脂含量將ICL平放在塑料平板上，並風乾2小時。一旦變幹，就將ICL切成大約1cm2的小塊，其中，將1.100g轉移到索格利特套管(soxhlet thimble)中。
向Kontes牌圓底燒瓶24/40中加入90ml二氯甲烷。將索格利特安裝在通風櫥中，燒瓶底置於熱水浴中，並且冰鄰卻的水流過蒸餾器。
提取四小時，之後將索格利特卸下，將含有溶劑和提取物的圓底燒瓶留在熱水浴中，直到二氯甲烷蒸發到只剩5ml。之後將此二氯甲烷轉移到11×13玻璃培養試管中，沸騰蒸出餘下的溶劑。向試管中加入2ml二氯甲烷，並將試管即刻塞好，並試管置於-20℃冰箱中。
之後測定提取物的重量。將上述玻璃試管置於冰浴中。在微量天平(Spectrum Supermicro)上平衡Ludiag 1.12ml鋁質稱量皿的重量。向此稱量杯皿加入10μl再懸浮的提取物，並將稱量皿放置在熱板上45秒鐘，蒸除溶劑。讓稱量皿冷卻大約190秒，並放置在微量天平上。之後對20μl和30μl提取物體積重複上述過程。
結果表明，類脂的百分率為幹的化學清洗過的ICL重量的不到大約0.7％。相反，非化學清洗的ICL含有較高部分的類脂；為幹的未用本發明方法清洗過的ICL重量中的至少大約1.5％。
實施例9ICL的胺基酸分析膠原是特徵在於其三螺旋區的蛋白，它具有三組重複的胺基酸甘氨酸-X-Y，其中X通常是脯氨酸，而Y經常是羥基脯氨酸。羥基脯氨酸通常用作將膠原定性與定量的胺基酸(Udenfriend，《科學》，1521335-1340，1966)。
為測定完整的ICL胺基酸分析，用機械清洗(不是化學清洗的)豬ICL和化學清洗的ICL進行PICO-TAG HPLC。對二種材料的羥基脯氨酸含量進行測定和比較。
使用CEM AVC80烘箱(CEM Corp.；Matthews，NC)，對來源於每一條件下的重量為大約0.31至大約0.36g的ICL樣品塊進行進一步乾燥。由這些乾燥的ICL塊上切出重量為大約9.5至大約13.1mg的更小的樣品。將樣品放入螺旋蓋培養試管中，之後將樣品在1％苯酚的6M HCl溶液中在110℃水解(每一條件，n＝3)大約16小時。ICL水解物之後用0.1M HCl稀釋以標準化材料濃度至1mg/ml。對於標定的玻璃試管(6×55)，20ml水解物和8ml 1.25mmol/ml L-正亮氨酸作為內標。之後將樣品冷凍並冰幹。通過向試管中加入20ml的2∶2∶1的乙醇∶水∶三乙胺來再乾燥，冷凍和冰幹。之後將樣品在室溫下通過加入20ml試劑(7∶1∶1∶1乙醇∶水∶三乙胺∶PITC)衍生20分鐘，接著冰凍和冰幹。最後將樣品懸浮於200mlPICO-TAG樣品稀釋劑中，並等分成小份入HPLC管。
胺基酸標準物用下列方式製備將0.1ml胺基酸標準物(產品#A-9531，Sigma)加入到1.9ml 0.1M HCl中。使用0.1M HCl以1∶1的比率製成五種系列稀釋液。體積為100ml的每種系列稀釋液和8ml的1.25mmol/ml L-正亮氨酸一起加入玻璃試管(6×55)中，之後用與ICL樣品同樣的方式製備。
將樣品和標準物上3.9×150mm PICO-TAG胺基酸柱(Part#88131；Waters Corp.；Miford，MA，美國)。分析時，樣品注射量為10ml，標準物注射量為20ml，每一處理重複三次。
結果表明，對於化學清洗的ICL材料而言，在材料中的主要膠原胺基酸的含量接近純化的膠原製劑。使用羥基脯氨酸衡量膠原含量，計算出ICL中的膠原按重量計的百分率為膠原乾重的至少93％。相反，非化學清洗的ICL含有高含量的非膠原胺基酸；介於ICL乾重大約11至25％的是非膠原材料。
雖然在上文中，為了清楚和理解的目的，採用例解說明和實施例的方式對發明作了一定程度的詳細描述，但對於本領域技術人員而言，在本發明權利要求書的範圍內可以進行某些變化和修改，這點是不言自明的。
權利要求
1.一種從天然哺乳動物組織中除去非膠原成分以產生基本上是膠原組織基質的無洗滌劑和無酶的方法，包含(a)將組織與有效量的螯合劑的鹼性溶液接觸；(b)將組織與有效量的含有鹽的酸性溶液接觸；(c)將組織與有效量的緩衝到大致生理pH的鹽溶液接觸；和(d)將組織與有效量的淋洗劑接觸。
2.權利要求1的方法，其中，步驟(a)的螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)和亞乙基雙(氧乙烯次氮基)四乙酸(EGTA)。
3.權利要求2的方法，其中，螯合劑的濃度介於大約1至大約200mM之間。
4.權利要求2的方法，其中，螯合劑的濃度介於大約50至大約150mM之間。
5.權利要求1的方法，其中，步驟(a)的鹼性試劑選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉或過氧化鈉。
6.權利要求5的方法，其中，鹼性試劑的濃度介於大約0.001至大約1M之間。
7.權利要求1的方法，其中，步驟(b)的酸性溶液選自鹽酸、乙酸和硫酸。
8.權利要求7的方法，其中，酸性溶液的濃度介於大約0.5至2M之間。
9.權利要求7的方法，其中，酸性溶液的濃度介於大約0.95至1.25M之間。
10.權利要求7的方法，其中，酸性溶液的濃度為1M左右。
11.權利要求1的方法，其中，酸-鹽溶液的pH介於0至大約1之間。
12.權利要求1的方法，其中，酸-鹽溶液的pH介於0至大約0.75之間。
13.權利要求1的方法，其中，酸-鹽溶液的pH介於0.1至大約0.5之間。
14.權利要求1的方法，其中，步驟(b)或(c)之一的鹽是無機鹽。
15.權利要求1的方法，其中，步驟(b)或(c)之一的鹽選自氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀和硫酸銨。
16.權利要求1的方法，其中，步驟(b)或(c)之一的鹽濃度為大約0.1至大約2M。
17.權利要求1的方法，其中，步驟(b)或(c)之一的鹽濃度為大約0.75至大約1.25M。
18.權利要求1的方法，其中，步驟(b)或(c)之一的鹽濃度為1M左右。
19.權利要求1的方法，其中，所述的組織選自真皮、動脈、靜脈、心包、心臟瓣膜、硬腦脊膜、骨、軟骨、腱、筋膜和腸。
20.權利要求19的方法，其中，所述的腸組織包括小腸的被膜黏膜下層。
21.權利要求19的方法，其中，所述的組織來源於人、牛、豬、羊、狗、貓或馬。
22.權利要求1的方法，其中淋洗劑選自水或生理緩中鹽水。
23.權利要求1的方法，其中，步驟(b)的方法是在步驟(a)前進行的。
24.一種從天然哺乳動物組織中除去非膠原成分以產生基本上是膠原組織基質的無洗滌劑和無酶的方法，包含(a)將組織與pH介於大約8至大約12的乙二胺四乙酸的鹼性溶液接觸；(b)將組織與pH介於大約0至大約1的氯化鈉的酸性溶液接觸；(c)將組織與pH介於大約5至大約9的氯化鈉溶液接觸；和(d)淋洗組織。
25.權利要求1至24的任一種方法獲得的可生物改造膠原組織基質。
26.一種從天然哺乳動物組織得到的可生物改造的膠原組織基質組成，它基本上沒有在所述天然組織中見到的非膠原和非彈性蛋白成分，其無洗滌劑殘留物和酶修飾，用於修復或替代損害的或有病的包含膠原和彈性蛋白的身體部分的移植中。
27.一種從小腸的天然被膜黏膜下層得到的無洗滌劑殘留物的可生物改造的膠原組織基質組成，其中組織基質包含端肽膠原；彈性蛋白，其中彈性蛋白低於總組成的10％；和非膠原和非彈性蛋白組分，其中所述的組分低於總組成的5％。
全文摘要
本發明涉及膠原組織,該膠原組織已進行過處理,以除去非膠原成分如細胞、細胞碎片和其它細胞外基質成分,如通常見於天然組織中的蛋白聚糖和葡糖胺聚糖。用鹼、螯合劑、酸和鹽處理組織,從膠原組織基質中除去非膠原成分,而同時控制膨脹量和溶解度,使用所得的膠原基質保留其結構組織、完整性和可生物改造性能。此方法不需要使用損害性地影響膠原基質的細胞相容性、強度和可生物改造性的洗滌劑和酶。該膠原組織基質用於植入、修補,或用在哺乳動物宿主中。
文檔編號C12N5/08GK1267201SQ98804844
公開日2000年9月20日 申請日期1998年5月8日 優先權日1997年5月8日
發明者金格爾·A·亞伯拉罕, 小羅伯特·M·卡爾, 保羅·D·肯普, 瑞安·默瑟, 琳達·貝克 申請人:奧加諾吉尼西斯公司