一種大規模誘發植物基因突變的方法
2023-05-28 13:28:11 3
專利名稱：一種大規模誘發植物基因突變的方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體涉及一種大規模誘發植物基因突變的方法特別是利用轉座子標籤法建立棉花基因突變庫的方法。
背景技術：
利用轉座子標籤法克隆高等植物或真核生物的重要功能基因，是一種非常行之有效的、具有廣泛應用前景的基因克隆策略。若要克隆到在生產上有重要利用價值的功能基因，首先必須獲得有關基因的突變體。利用轉座子在植物基因組中隨機誘發基因突變的原理，就可以根據植株的表型特徵和生化特徵，鑑定和分離出各種不同的功能基因。在主要農作物如水稻、西紅柿、馬鈴薯以及模式植物擬南芥中都已建立相應的轉座子標籤突變基因庫，作為克隆這些作物的功能基因的重要突變體資源。
棉花是迄今為止國內外尚未採用轉座子標籤方法進行基因克隆的主要農作物之一。由於世界各國栽培的棉花品種均為異源四倍體品種，其許多性狀的發育都涉及兩對或兩對以上獨立遺傳的等位基因。因此，通過經典插入突變，很難分離到隱性純合體，從而給一些重要經濟性狀的遺傳規律研究、應用及功能研究帶來了很大的困難。
現有技術中關於應用轉座子標籤技術主要見於在水稻、西紅柿、小麥、菸草、馬鈴薯等作物，例如在水稻中，J.G.Jeon(Plant(2000)22561-750)和R.Greco等(Plant Mol.Bio(2000)46215-217)中所使用轉座子都是自主轉座子，可在基因組中獨立轉座，因此會造成一些不穩定的隱性插入突變，給基因克隆帶來不少的麻煩。
在小麥和西紅柿中，以色列耶達研究及發展有限公司提出的一份發明專利申請(中國發明專利申請號98811051.2)，所採用的轉座子標籤包括兩類四種，第一類為自主轉座子，即Ac轉座子；第二類為非自主轉座子。其中第一種為GUS-Kan轉座子；第二種為GUS-Hygr轉座子；第三種為LUC-Kan轉座子。其自主轉座子誘發基因突變的效果同前述水稻的相似。非自主轉座子必須使含有這種轉座子的轉基因植物同含有自主轉座子的植株雜交，獲得F1植株，建立自主-非自主轉座子系統，然後再自交，才能從F2代中選擇突變體。對於從所述各世代中突變體的選擇只能從上一代雜合體的後代中進行選擇，因此工序繁雜。第二類誘發突變體的方法為化學誘變和物理誘變，突變體中不可避免有染色體畸變，而且誘變劑很容易汙染環境。
本發明的第一個目的在於克服現有技術存在的缺陷，提出一種大規模誘發植物特別是用於棉花的基因突變的方法。所述的誘變方法不採用化學誘變和物理誘變，只是將增強子羅網和活化標籤這兩種轉座子標籤導入植物尤其是棉花基因組中，然後通過轉座子在基因組中隨機誘發插入突變和顯性突變並通過轉基因植株自交，根據群體中植株的表型及報告基因或標記基因的表達與否，鑑定出有關基因，利用轉座子作標籤或探針從基因組DNA中克隆到相關目標基因及其表達調控元件，為鑑定和克隆植物特別是棉花的重要功能基因及基因表達的調控元件提供豐富的突變體資源和創造新的豐產、優質、多抗優良種質資源。
本發明的第二個目的是建立轉座子標籤突變基因庫，簡化植物特別是棉花基因鑑定和克隆的複雜程序，並為克隆這一作物和其他作物的任何基因提供配套的探針或轉座子標籤，以節約大量的科研開發經費，同時由於本發明所導致的基因育種策略的改變，可以防止由於化學或物理誘變所帶來的育種選擇難度的增加和對環境的汙染。
發明內容
本發明通過以下技術方案實現，發明的技術方案儘管以棉花為例，但不限於棉花一種大規模誘發植物特別是用於棉花基因突變的方法，所述的誘變方法不採用化學誘變和物理誘變。將人工構建的轉座子標籤(增強子羅網和活化標籤)導入植物基因組，特別是棉花基因組中，然後通過轉座子在基因組中隨機誘發插入突變和顯性突變並通過轉基因植株自交，根據群體中植株的表型及報告基因或標記基因的表達與否，鑑定出有關基因，利用轉座子作標籤或探針從基因組DNA中克隆到相關目標基因及其表達的調控元件，為鑑定和克隆植物特別是棉花的重要功能基因及基因表達的調控元件提供豐富的突變體資源，由於本發明的突變基因庫中突變基因的數目是巨大的，隨著轉基因植株世代繁衍和轉座子的不斷轉座，新的突變體會不斷出現，因而將創造出大量的新的豐產、優質、多抗優良品種和豐富的種質資源。
本發明具體步驟是一種大規模篩選植物，特別是棉花基因突變體的方法，包括以下步驟(a)利用農桿菌介導轉化方法獲得轉基因植株；(b)在田間種植上述植物轉基因系，使其大規模地自發地誘發突變；(c)對上述突變體進行表型鑑定或生化鑑定；(d)篩選和固定突變體；和(e)利用轉座子標籤法克隆所需要的突變基因；
所述的方法包括將轉座子標籤導入栽培植物的基因組中，田間種植轉基因植株，通過轉座子隨機轉座和誘發突變，建立含有突變基因的突變基因庫。
所述的轉座子是在轉基因植物基因組中已被固定的或未被固定的。
所述的轉座子標籤為增強子羅網和活化標籤。
所述的增強子羅網中GUS編碼序列上遊有一最小啟動子，大小為60bp的CaMV35S的啟動子，利用GUS染色法觀察有無螢光發出，鑑定目標基因及其表達的調控元件。
所述轉座活化標籤是一段增強子四聯體合Bar基因組成的非自主轉座子。增強子四聯體在轉座後誘發基因顯性突變。
進一步的方法包括以下步驟(a)增強子羅網誘發的突變，可利用GUS染色法觀察有無螢光發出，鑑定目標基因及其表達的調控元件；(b)根據田間肉眼觀察轉基因植株是否發生顯性突變，鑑定由轉座活化標籤誘發的突變體；和(c)上述兩種轉座子標籤轉基因植株通過自交分離隱性插入純和突變體。
鑑定GUS基因表達與否的方法，是在黑暗條件下用螢光顯微鏡觀察經GUS染色法染色後的轉基因植株、組織有無螢光發出，篩選有螢光的突變體。
所述的方法還包括以下步驟(a)對利用除草劑Basta或Bialaphos進行正向選擇，篩選轉座子已被固定的突變體；(b)用除草劑R7402處理轉基因植株進行負向選擇，篩選轉座子標籤已被固定的突變體；和(c)鑑定無綠色螢光，抗Basta或Bialaphos的突變體為轉座子標籤固定的突變體。
觀察轉座子標籤是否發生初次轉座的步驟如下(a)利用螢光顯微鏡觀察所述的轉基因植株是否有綠色螢光發出，鑑定上述轉座子標籤是否發生初次轉座，或(b)在黑暗條件下利用綠色裝置照射轉基因植株是否發出綠色光激發螢光，鑑定上述轉座子標籤是否發生初次轉座。
觀察轉座子活化標籤是否發生再次轉座的步驟如下(a)採用螢光顯微鏡觀察突變體有無綠色螢光發出和是否抗除草劑Basta或Bialaphos，鑑定轉座子標籤是否發生再次轉座；或(b)鑑定無綠色螢光抗Basta或Bialaphos，原突變體性狀恢復為野生型並產生新的突變型，該突變體為轉座子標籤再次轉座所所產生的；(c)通過DNA分子雜交確定基因組中由多個拷貝的轉座子標籤；和
(d)鑑定為有綠色螢光不抗Basta或Bialaphos，確定該轉基因植株不含轉座子標籤。
所述的方法包括，將帶有活化標籤結構的突變體在具有逆境(例如在抗旱、高蟲口密度、病害強度大的條件下，或者在高鹽條件下，或者在寒冷條件下，或者在有除草劑條件下)下種植，培養抗各種抗逆境(如抗旱、抗寒、耐鹽、抗蟲、抗病、抗除草劑等)的新品種，或者培育豐產、優質新品種。
所述的方法還包括，上述兩種轉座子標籤已被固定的各種突變基因採用轉座子標籤法基因克隆。
下面對本發明作進一步的描述棉花轉座子標籤突變體基因庫採用農桿菌介導的轉基因方法將兩種人工構建的轉座子標籤轉移到栽培的陸地棉基因組中而產生的一個龐大的突變基因庫，而且該突變庫還可以通過轉座子隨機轉座和誘發基因突變的途徑，大規模地分離鑑定該作物的功能基因及其基因表達的調控元件。
棉花轉座子標籤突變基因庫是一組含有轉座子標籤即增強子羅網和轉座活化標籤的棉花品系或棉花轉基因系或棉花突變基因系，包括各種轉座子標籤已被固定的突變基因系和未被固定的轉座子標籤轉基因系。前者可直接用來克隆重要的功能基因如抗病基因、抗蟲基因、抗旱基因、與纖維品質有關的基因、與產量有關的基因等；後者可用來誘發和鑑定新的功能基因。只要通過田間種植一定規模的群體，就可根據群體中不同個體的表型特徵，鑑定和分離到所需要的突變體，然後通過固定突變體，該材料就可以用於基因克隆或用於創造新的優良品種如多抗、優質、豐產品種等。
棉花轉座子標籤突變基因庫所含轉座子標籤的結構如圖1和圖2所示。其中，增強子羅網結構在報告基因GUS上遊有一最小啟動子結構即約60bp的CaMV35S啟動子，該融合基因通常不能表達，只有插入到基因組中增強子附近時無論基因的方向如何，增強子可使該報告基因表達。根據GUS基因表達與否，就可鑑定出器官、組織特異表達的基因、致病因子誘導表達的基因以及增強子和啟動子等基因表達的調控元件。
確定GUS基因表達與否，採用Jefferson的方法進行GUS染色處理，(R.A.Jefferson，1987，Plant Mol.Bid.5387-405)，在黑暗條件下用螢光體視顯微鏡觀察有無螢光，有螢光則證明GUS基因表達，從而鑑定基因及基因表達的調控元件。轉座子標籤中的Bar基因為對除草劑Basta或Bialaphos有抗性的基因，用於含有固定的轉座子標籤的突變體。在增強子羅網結構之外還有一負向選擇標記基因SU1基因，該基因可使轉基因植株對除草劑R7402敏感，因此可通過除草劑消除含不穩定轉座子植株，便於基因的分離和鑑定。
突變體庫中轉座活化標籤除具有Bar基因之外，還具有一強增強子，即CaMV35S增強子的四聯體。該增強子位於轉座子末端附近，轉座後增強子作用於植物基因組中相鄰基因，提高鄰近基因的表達水平，造成顯性突變，從而鑑定出有關基因。
兩種轉座子標籤都是人工重組的Ds因子，兩端接有自然轉座子Ds的末端顛倒重複，中間為Bar-GUS基因(增強子羅網)或增強子-Bar基因(轉座活化標籤)，在Ac因子編碼的轉座酶的作用下才能轉座。Ac因子為除掉了與本身轉座有關結構的轉座酶基因，只為人工Ds的轉座提供轉座功能。
兩種轉座子標籤還具有另一監測轉座過程的報告基因GFP基因，即源於水母的綠色螢光蛋白基因。二者均位於35S啟動子和GFP編碼序列之間，只有轉座子轉座之後，GFP基因才能表達。因此，根據GFP基因表達與否，可直接通過螢光顯微鏡觀察轉座子是否發生初次轉座。
當轉座子標籤發生再次轉座後，根據其誘發突變體的表型特徵即通過肉眼觀察植株表型特徵的變異，以及標記基因Basta或Bialaphos的抗性特徵和綠色螢光的有無進行確定。
如果突變體抗Basta或Bialaphos，不發出綠色螢光，原有突變性狀恢復到野生型，並產生新的突變型，證明該突變性狀或突變基因是轉座子標籤發生再次轉座所產生的結果。
轉座子再次轉座和初次轉座及其插入位點的確定，還可根據DNA分子雜交的結果和PCR分析進行確定。
對轉座子標籤突變基因庫中突變基因和基因突變體的固定可採用Basta或Bialaphos浸泡棉種，殺死具活性轉座子植株。對上述除草劑有抗性、並不發出綠色螢光的植株即含有已被固定的轉座子。或者對由增強子羅網結構誘發的突變體而言，還可採用另一類除草劑即R7402浸泡棉種，殺死具活性轉座子的植株，保留轉座子標籤已被固定的突變體。因為含有SU1基因的植株可被除草劑R7402殺死，不含SU1基因的植株即轉座子被固定的植株對該除草劑具有抗性。
本發明的突變體庫中具活性轉座子標籤植株所產生的種子可以繼續在田間種植，使轉座子標籤誘發新的基因突變。對由其誘發的突變體的固定仍採用上述方法進行。
轉座子標籤已被固定的突變體及其後代可直接用於基因克隆。
針對轉座子標籤突變基因庫中目標突變基因的基因克隆程序如圖3流程所示。
由增強子羅網和轉座子活化標籤轉化的轉基因植株也可通過自交分離隱性插入純和突變體，進行基因的功能鑑定和基因克隆。
含有轉座活化標籤結構的植株可通過自交，使轉座子植株隨機轉座，誘發特殊的顯性突變。若一個活化標籤插入到抗病基因附近，可提高該基因的表達水平，從而培育出抗病的新種質或新品種。若活化標籤插入到抗蟲基因附近，可提高抗蟲基因的表達水平，從而培育出抗蟲新品種。若活化標籤插入到與產量有關或與品質有關的基因附近，可培育出豐產優質的新品種。
這些突變性狀的固定，仍然採用前述方法進行。
轉座子標籤突變基因庫中由轉座活化標籤轉化的轉基因植株對分離、鑑定和克隆象棉花一類的異源多倍體植物具有特殊作用。因為活化標籤誘發顯性突變，無須分離隱性純合體。棉花為異源四倍體植物，一對相對性狀的發育往往涉及兩對以上的基因控制，通過自交很難分離到隱性純合體，而本發明的方法所誘發的顯性突變可省掉分離隱性純和體的麻煩。
本發明的兩種轉座子標籤系統適合在各種植物中大規模誘發基因突變，例如應用於水稻、棉花、油菜、小麥、玉米、大豆、西紅柿、馬鈴薯和其他糧食、纖維植物，糖料植物，花卉以及其他經濟植物中，可廣泛用於建立突變基因庫和利用轉座子標籤進行特定性狀基因的克隆。
圖1為增強子羅網結構。DsRj和DsLj之間的序列為轉座子標籤，位於ubi-35s啟動子和GFP編碼序列之間。
圖2為轉座子活化標籤結構。DsRj和DsLj之間的序列為轉座子標籤，也位於ubi-35s啟動子和GFP編碼序列之間。
圖3為利用於本發明功能中的轉座子標籤進行基因克隆的流程。
圖4為棉花轉基因植株葉片的氣孔保衛細胞中GFP基因表達的螢光顯微照片。
圖5、圖6為棉花轉基因植株葉片的柵欄組織中GFP基因表達的螢光顯微照片。
具體實施例方式實施例1從1500多株轉基因棉花試管苗中選擇了37珠由轉座活化標籤轉化的生長較快的試管棉植株，將每一植株再分割成6-7段繼續選擇，從42個亞克隆植株中分離到一株由吉南糖膠配製的MSB5培養基上生長特別迅速的植株，該植株在10天內即可將培養基中的瓊脂和吉蘭糖膠全部水解。而其他突變體和對照都不能水解固體培養基中的瓊脂和吉蘭糖膠。
實施例22001年種植了上一年獲得的由轉座活化標籤結構轉化的3株轉基因植株(棉花F1)的後代共562株，通過肉眼觀察形態特徵變異情況，獲得一株花葯乾癟、雄性不育的植株。該植株上部花朵授以正常植株的花粉，可以獲得種子，表明該植株為雌性可育，雄性不育。通過螢光顯微鏡觀察，該植株所有器官均無綠色螢光，表明該突變體中轉座子標籤已被固定。
實施例3採用Rueb等利用農桿菌介導的轉化水稻的方法(S.Rueb等1994，Plant celltissue organ cult.36259-264)，將含有增強子羅網和轉座活化標籤結構的農桿菌與水稻胚愈傷組織共培養3天，然後再將愈傷組織轉移到含潮黴素培養基進行選擇培養，後在螢光體視顯微鏡下觀察GFP基因表達情況，即觀察有無綠色螢光發生，確定轉化體。然後再將轉化的愈傷組織轉移到分化培養基誘導出轉基因苗，三周後再移到盤中栽培。根據葉片中GFP基因和GUS基因表達情況，證明本發明的方法可高效地誘發水稻基因突變。對轉基因植株的自交子代進行GUS檢測，分離鑑定有關特異基因及其表達的調控元件。肉眼觀察檢出由轉座活化標籤誘發的顯性突變，以及由兩種轉座子標籤誘發的隱性突變。
實施例4通過直接生成苗的方法，本發明人已經利用含有增強子羅網和轉座活化標籤結構的農桿菌於油菜無菌苗下胚軸切段共培3天，然後再轉移到含有潮黴素的MSB5培養基上進行選擇培養並直接誘導成芽。在螢光體視顯微鏡下觀察轉基因苗有無綠色螢光發生，確定轉化體和轉座子是否發生初次轉座。選擇6-8周後，去掉潮黴素，繼續培養2周後直接移栽到花房土中栽培。使轉基因植株自交，對自交子代進行田間觀察，檢出由轉座活化標籤誘發的顯性突變和由兩種轉座子標籤誘發的隱性插入突變體。對由增強子羅網誘發的突變進行GUS檢測，鑑定、分離有關特異表達的基因及其表達的調控元件。
權利要求
1.一種大規模篩選植物的，特別是棉花基因突變體的方法，其特徵在於採取以下驟(a)利用農桿菌介導轉化方法獲得轉基因植株；(b)在田間種植上述植物轉基因系，使其大規模地自發地誘發突變。(c)對上述突變體進行表型鑑定或生化鑑定；(d)篩選和固定突變體；和(e)利用轉座子標籤法克隆所需要的突變基因；
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將轉座子標籤導入栽培植物的基因組中，田間種植轉基因植株，通過轉座子隨機轉座和誘發突變，建立含有突變基因的突變基因庫。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的轉座子是在轉基因植物基因組中已被固定的或未被固定的。
4.據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的轉座子標籤為增強子羅網和活化標籤。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，按照以下步驟(a)增強子羅網誘發的突變，可利用GUS染色法觀察有無螢光發出，鑑定目標基因及其表達的調控元件；(b)根據田間肉眼觀察轉基因植株是否發生顯性突變，鑑定由轉座活化標籤誘發的突變體；和(c)上述兩種轉座子標籤轉基因植株通過自交分離隱性插入純和突變體。
6.根據權利要求1或5所述的方法，其特徵在於，鑑定GUS基因表達與否的方法，是在黑暗條件下用螢光顯微鏡觀察經GUS染色法染色後的轉基因植株、組織有無螢光發出，篩選有螢光的突變體。
7.據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，採用以下步驟(a)對利用除草劑Basta或Bialaphos進行正向選擇，篩選轉座子已被固定的突變體；(b)用除草劑R7402處理轉基因植株進行負向選擇，篩選轉座子標籤已被固定的突變體；和(c)鑑定無綠色螢光，抗Basta或Bialaphos的突變體為轉座子標籤固定的突變體。
8.根據權利要求1或5所述的方法，其特徵在於，觀察轉座子標籤是否發生初次轉座的步驟如下(a)利用螢光顯微鏡觀察所述的轉基因植株是否有綠色螢光發出，鑑定上述轉座子標籤是否發生初次轉座，或(b)在黑暗條件下利用綠色裝置照射轉基因植株是否發出綠色光激發螢光，鑑定上述轉座子標籤是否發生初次轉座。
9.根據權利要求1或2所述的方法，觀察轉座子活化標籤是否發生再次轉座的步驟如下(a)採用螢光顯微鏡觀察突變體有無綠色螢光發出和是否抗除草劑Basta或Bialaphos，鑑定轉座子標籤是否發生再次轉座；或(b)鑑定無綠色螢光抗Basta或Bialaphos，原突變體性狀恢復為野生型並產生新的突變型，該突變體為轉座子標籤再次轉座所所產生的；(c)通過DNA分子雜交確定基因組中由多個拷貝的轉座子標籤；和(d)鑑定為有綠色螢光不抗Basta或Bialophos，確定該轉基因植株不含轉座子標籤。
10.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於將帶有活化標籤結構的突變體在具有逆境的條件下種植，培養抗各種逆境的新品種，或者豐產、優質品種，或者抗除草劑品種。
11.根據權利要求1或2所述的方法，起特徵在於，上述兩種轉座子標籤已被固定的各種突變基因採用轉座子標籤法基因克隆。
全文摘要
本發明屬於植物基因工程技術領域。通過農桿菌介導的轉化方法，將人工構建的轉座子標籤即增強子羅網和轉座活化標籤導入植物特別是栽培的陸地棉基因組中，並通過轉座子的隨機轉座和隨機誘發基因突變機制，大規模地發現功能基因，建立一種含有大量突變基因，包括轉座子已被固定和未被固定的植物轉座子標籤突變基因庫。該突變庫的材料通過繼續種植還可進一步發現該作物新的功能基因，突變庫任何突變基因都可採用轉座子標籤法進行克隆。本發明可用於各種植物的基因發現和遺傳改良。
文檔編號C12Q1/68GK1433675SQ02115460
公開日2003年8月6日 申請日期2002年1月24日 優先權日2002年1月24日
發明者楊業華, 王學奎, 吳徵彬 申請人:華中農業大學