多肽、抗體可變域和拮抗劑的製作方法

2023-10-25 21:20:32

多肽、抗體可變域和拮抗劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及多肽、抗體可變域和拮抗劑。本發明涉及能抵抗蛋白酶降解的抗-TNFR多肽和抗體單可變域(dAb)，以及含有這些的拮抗劑。多肽、dAb和拮抗劑可作為可能在被給藥於患者時遇到蛋白酶的治療劑和/或預防劑，例如用於肺部給藥、口服給藥，遞送至患者的肺和遞送至患者的GI道，以及用於治療癌症和炎症，如關節炎或COPD。
【專利說明】多肽、抗體可變域和拮抗劑
[0001] 本申請是國際申請日為2008年6月4日的國際申請PCT/GB2008/050405進入中 國、申請號為200880102207. 2的題為"多肽、抗體可變域和拮抗劑"的發明專利申請的分案 申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白（抗體）單可變域和包含這些的抗腫瘤 壞死因子I (TNFR1，p55, CD120a，P60, TNF受體超家族成員1A，TNFRSF1A)拮抗劑。本發明 進一步涉及含有該抗-TNFRl配體的用途、製劑、組合物和裝置。

【背景技術】
[0003] 多肽和肽日益成為各種應用中的重要製劑，這些應用包括工業應用和用作醫學、 治療和診斷試劑。然而，在特定的生理學情況中，如炎症（例如，C0PD)狀況和癌症中，組織、 器官或動物（例如，在肺中，在腫瘤中或鄰近腫瘤）中存在的蛋白酶含量將增加。這種蛋白 酶的增加會導致內源蛋白質以及給藥來治療疾病的治療肽、多肽和蛋白質加速的降解和失 活。因此，對體內使用（例如，用於治療、診斷或預防疾病）具有潛能的一些藥劑僅僅具有 有限的功效，因為它們受到蛋白酶的快速降解和滅活。
[0004] 蛋白酶抗性多肽提供了若干優勢。例如，蛋白酶抗性多肽在體內能比蛋白酶敏感 性藥劑保持更長時間的活性，因此，能將功能保持足以產生生物效應的時間段。對於選擇能 抵抗蛋白酶降解並且還具有理想生物活性的多肽的改進方法還存在著需求。
[0005] TNFRl
[0006] TNFRl是一種跨膜受體，其含有結合配體的胞外區和缺少固有信號轉導活性但能 夠結合信號轉導分子的胞內結構域。TNFRl與所結合的TNF的複合物含有三條TNFRl鏈和 三條 TNF 鏈。（Banner 等人，Cell，73 (3) 431-445 (1993).) TNF 配體作為被三條 TNFRl 鏈結 合的三聚體而存在（同上）。在受體-配體複合物中，三條TNFRl鏈被緊密聚簇（cluster) 在一起，而這種聚簇是TNFRl介導的信號轉導的先決條件。事實上，結合TNFRl的多價試 劑例如抗-TNFRl抗體能夠在不存在TNF時誘導TNFRl聚簇和信號轉導，並且通常被用作 TNFRl 激動劑（參見例如，Belka 等人，ΕΜΒ0,14 (6) :1156-1165(1995) ;Mandik-Nayak 等人， J. Immunol，167 :1920-1928(2001).)。因此，結合TNFRl的多價試劑通常不是有效的TNFRl 拮抗劑，甚至即使它們阻斷TNFa與TNFR 1的結合時。
[0007] TNFRl的胞外區包含十三個胺基酸的氨基末端區段（SEQ ID NO :603(人）的氨基 酸1-13 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸1-13)、結構域1(SEQ ID NO :603(人）的胺基酸 14-53 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸14-53)、結構域2(SEQ ID NO :603(人）的胺基酸 54-97 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸 54-97)、結構域 3(8 SEQ ID NO :603(人）的氨基 酸 98-13 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸 98-138)、和結構域 4 (SEQ ID NO :603(人）的 胺基酸139-167 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸139-167)，後面是近膜區（SEQ ID NO: 603_(人）的胺基酸 168-182 ;SEQ ID NO :604(小鼠）的胺基酸 168-183) (SMBanner 等人，Cell73(3)431-445(1993)和 Loetscher 等人，Cell61 (2)351-359(1990)·)。結構域 2 和 3 與所結合的配體（TNFP，TNFa)接觸（Banner 等人，Cell，73(3)431-445(1993)·)。 TNFRl的胞外區還含有一個區域，其被稱為前-配體結合組裝結構域（pre-ligand binding assembly domain)或 PLAD 結構域（SEQ ID NO:6〇3_(人）的胺基酸 1_53;SEQ ID NO: 604(小鼠）的氛基酸 1-53)(美國政府，WO 01/58953 ;Deng 等人，Nature Medicine，doi : 10. 1038/nml304(2005))〇
[0008] 在體內通過一種處理將TNFRl從細胞的表面除去，該處理包括在結構域4或在近 膜區（SEQ ID NO :603 的胺基酸 168-182 ;SEQ ID NO :604 的胺基酸 168-183)中 TNFRl 的 蛋白質水解，以產生可溶形式的TNFR1。可溶的TNFRl保持了結合TNFa的能力，進而能夠 作為TNF a活性的內源性抑制劑。


【發明內容】

[0009] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）為至少93%同一性的胺基酸序列的多肽。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、 95、96、97、98或99%。在一個實施方案中，多肽是0011111-131-206。本發明進一步提供了 (基本上）純的DOM lh-131-206單體。在一個實施方案中，DOM lh-131-206為至少98、99、 99. 5 %純或100 %純的單體。
[0010] 在一個方面中，本發明提供了一種多肽是由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯 不於圖19中）為至少80%同一'丨生的核苷酸序列編碼的。在一個實施方案中，同一'I"生百分 比為至少 70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。
[0011] 在一個方面中，本發明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示於圖19 中）為至少57%同一性的核苷酸序列編碼的多肽，並且其中該多肽包含與DOM lh-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）為至少93%同一性的胺基酸序列。在一個實施方案中， 核苷酸序列的同一性百分比為至少 60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99%。在一個實施方案中，胺基酸序列的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或 99%或100%。例如，核苷酸序列可以是DOM lh-131-206核苷酸序列（顯示於圖19中） 的密碼子優化形式。序列的密碼子優化是本領域已知的。在一個實施方案中，對於在 細菌（例如，大腸桿菌（E. coli)或假單胞菌屬（Pseudomonas)，例如，螢光假單胞菌（P fluorescens))、哺乳動物（例如，CH0)或酵母宿主細胞（例如，畢赤酵母屬（Picchia)或酵 母屬（Saccharomyces)，例如，巴斯德畢赤酵母（P. pastoris)或釀酒酵母（S. cerevisiae)) 中的表達，將核苷酸序列優化。
[0012] 在一個方面中，本發明提供了含有本發明多肽的融合蛋白。
[0013] 在一個方面中，本發明提供了抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變 域，其包含與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3中）為至少93%同一性的胺基酸 序列。在一個實施方案中，同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%。
[0014] 在一個方面中，本發明提供了抵抗蛋白酶的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫 球蛋白單可變域，其包含與DOM lh-131-206的胺基酸序列為至少90 %同一性的胺基酸序 列。在這些方面的一個實施方案中，同一性百分比為至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、 97、98 或 99%。
[0015] 在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置53包含天冬氨酸，其中編號是根 據 Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest"（免疫學重要性蛋白的 序列），US Department of Health and Human Services (美國衛生和人類服務部），1991)。
[0016] 在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域在位置91包含組氨酸，其中編號是根據 Kabat0
[0017] 在一個方面中，本發明提供了抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變 域，其包含與DOM lh-131-206的胺基酸序列相同的胺基酸序列。
[0018] 在一個方面中，本發明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示於圖19 中）為至少80%同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白 單可變域。在一個實施方案中，同一性百分比為至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98 或 99%。
[0019] 在一個方面中，本發明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示於圖19 中）為至少57%同一性的核苷酸序列編碼的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白 單可變域，並且其中可變域包含與D0Mlh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3中）為至 少93%同一'丨生的胺基酸序列。在一個實施方案中，核苷酸序列的同一'I"生百分比為至少60、 65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。在一個實施方案中，胺基酸序列 的同一性百分比為至少94、95、96、97、98或99%或100%。例如，核苷酸序列可以是00皿 lh-131-206核苷酸序列（顯示於圖19中）的密碼子優化形式。序列的密碼子優化是本領 域已知的。在一個實施方案中，對於在細菌（例如，大腸桿菌或假單胞菌屬，例如，螢光假單 胞菌）、哺乳動物（例如，CH0)或酵母宿主細胞（例如，畢赤酵母屬或酵母屬，例如，巴斯德 畢赤酵母或釀酒酵母）中的表達，將核苷酸序列優化。
[0020] 在一個方面中，本發明提供了由與DOM lh-131-206的核苷酸序列（顯示於圖19 中）相同的序列編碼的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。
[0021] 在一個方面中，本發明提供了含有根據本發明的抗-TNFR免疫球蛋白單可變域的 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，拮抗劑包含第一和第二免疫 球蛋白單可變域，其中每個可變域是根據本發明的。例如，其中拮抗劑包含所述單可變域的 單體或所述單可變域的同型二聚體。在一個實施方案中，那個或每個單可變域的胺基酸序 列與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同。
[0022] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於DOM lh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的⑶Rl序列為至少50%同一性的⑶Rl序列的胺基酸序列的抗-TNFa I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個胺基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0023] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的⑶R2序列的胺基酸序列的抗-TNF a I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個胺基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0024] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯不於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的⑶R3序列的胺基酸序列的抗-TNFa I型受 體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、 19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個胺基酸位置。在一個實施方案 中，CDR 序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0025] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列的胺基酸序列的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0026] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR3序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的胺基酸序列的抗-TNF a I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0027] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的CDR2序列為至少50%同一性的CDR2序列和與DOM lh-131-206的CDR3序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的胺基酸序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球 蛋白單可變域。在一個實施方案中，差異不超過24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R序列 同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0028] 在一個方面中，本發明提供了含有與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3 中）相同或在不超過25個胺基酸位置不同於D0Mlh-131-206的胺基酸序列並具有與DOM lh-131-206的CDRl序列為至少50%同一性的CDRl序列和與DOM lh-131-206的CDR2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的胺基酸序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域。在一個 實施方案中，差異不超過 24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、 4、3、2或1個胺基酸位置。在一個實施方案中，一個或兩個或每個CDR序列同一性各自為至 少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。
[0029] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0030] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶R2序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0031] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施 方案中，CDR序列同一性為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0032] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的 ^1?2序列的抗1即〇1型受體〇'即1?1;?55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個^1? 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0033] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述一種或更多種的蛋白酶。
[0034] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶R2序 列為至少50%同一性的⑶R2序列和與DOM lh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的 ⑶R3序列的抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個⑶R 的 CDR 序列同一性各自為至少 55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98 或 99%。例如，在 本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0035] 在一個方面中，本發明提供了具有與DOM lh-131-206(顯示於圖3中）的⑶Rl序 列為至少50%同一性的⑶Rl序列和與DOM lh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的 CDR2序列和與DOM lh-131-206的CDR3序列為至少50%同一性的CDR3序列的抗-TNF a I 型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。在一個實施方案中，一個或兩個或每個⑶R的⑶R序列同一 性各自為至少55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組 條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。
[0036] 在一個方面中，本發明提供了含有免疫球蛋白單可變域的抗-TNFa I型受體 (TNFR1 ;p55)拮抗劑，該免疫球蛋白單可變域含有D0Mlh-131-206(顯示於圖3中）的CDR1、 〇0尺2和/或0?3的序列（例如，001?1，0)1?2,001?3,0)1?1和2,0)1?1和3,0)1?2和3，或0)1?1、 2和3)。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗蛋白酶，例如，本文所述的一種或 更多種蛋白酶。
[0037] 在一個方面中，本發明提供了與DOM lh-131-206競爭與TNFRl結合的TNFa I型 受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑。因此，拮抗劑可以結合與DOM lh-131-206相同的表位或重疊的 表位。在一個實施方案中，拮抗劑包含具有與DOM lh-131-206 (顯不於圖3中）的胺基酸 序列為至少93%同一性的胺基酸序列的免疫球蛋白單可變域。在一個實施方案中，同一性 百分比為至少94、95、96、97、98或99%。例如，在本文所述的一組條件下，拮抗劑可以抵抗 蛋白酶，例如，本文所述的一種或更多種蛋白酶。在一個實施方案中，拮抗劑是抗體或其抗 原結合片段，如具有TNFRl結合特異性的單價抗原結合片段（例如，scFv、Fab、Fab'、dAb)。 拮抗劑的其他實例是本文所述的結合TNFRl的配體。配體可以包含具有TNFRl結合特異性 的免疫球蛋白單可變域或結構域抗體（dAb)，或以合適形式的該dAb的互補性決定區。在一 些實施方案中，配體是基本上由具有TNFRl結合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成 或由具有TNFRl結合特異性的免疫球蛋白單可變域或dAb組成的dAb單體。在其他實施方 案中，配體是包含合適形式如抗體形式的dAb (或dAb的CDR)的多肽。
[0038] 本發明的某些TNFRl的拮抗劑不抑制TNF α與TNFRl的結合，而是抑制通過TNFRl 介導的信號轉導。例如，TNFRl的拮抗劑能夠抑制在通過TNFRl的信號轉導之前的TNFa -誘 導的TNFRl的聚簇。這些拮抗劑提供了某些優點。例如，在存在這類拮抗劑時，TNFa能夠 結合在細胞表面上所表達的以及從細胞環境移除的TNFR1，但是TNFRl介導的信號轉導不 能被激活。因此，TNFRl信號誘導的其他TNF a以及其他炎症介質的產生將被抑制。類似 地，結合TNFRl並抑制通過TNFRl所介導的信號轉導但不會抑制TNF a結合TNFRl的TNFRl 拮抗劑，將不會抑制內源產生的可溶TNFRl的TNF a-結合併抑制活性。因此，為有此需要 的哺乳動物給藥這類拮抗劑能夠補充抑制體內TNFa活性和TNFRl活性的內源調控途徑。 本發明還涉及配體，所述配體（i)結合TNFRl (例如，在結構域1中），（ii)拮抗TNFR 1介 導的信號轉導的激活，和（iii)不抑制TNF a與TNFRl的結合。這類配體結合可溶TNFRl 而不防止可溶受體結合TNF a，進而為有此需要的哺乳動物給藥這類拮抗劑，能夠通過提高 血清中可溶受體半衰期而補充體內抑制TNF a活性的內源調節通路。這些優點與一些配體 特別相關，這些配體已經通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少 轉鐵蛋白結合部分、抗體Fc區，或通過綴合抗體結構域，而被格式化，以具有較大的流體動 力學大小。例如，（i)結合TNFRl (如在結構域1中），（ii)拮抗TNFRl介導的信號轉導活 動和（iii)沒有抑制TNF a與TNFRl如dAb單體的結合的物質（例如，多肽、可變域或拮抗 齊U)可以格式化（formatted)成較大的抗體的抗原結合片段或格式化為抗體（例如，格式 化成Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab'）2、IgG、scFv)。還可以通過將TNFRl結合劑（拮抗劑、可變 域）綴合或連接結合提高體內半衰期的抗原或表位的結合域（例如，抗體或抗體片段）來 提高配體的流體動力學大小及其血清半衰期，如本文所述的（參見，W02006038027的附錄 1，在此將其整體引入作為參考）。例如，可以將TNFRl結合劑（例如，多肽，例如，dAb)綴合 或連接抗-血清白蛋白或抗-新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc 受體dAb、Fab、Fab'或scFv,或抗-SA親和體（affibody)或抗-新生兒Fc受體親和體。
[0039] 用於根據本發明的TNFRl-結合配體中的合適的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變 體的實例描述於W02005/077042A2和W02006038027中，在此將其整體引入作為參考。
[0040] 在整個說明書中描述的本發明的其他實施方案中，替代本發明的拮抗劑或配體中 "dAb"的使用，設想本領域技術人員可以使用含有結合TNFRl的dAb的CDR的結構域（例 如，嫁接於合適的蛋白質支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受 體A類結構域或EGF結構域）或可以是含有TNFRl結合位點的蛋白質結構域，例如，其中結 構域選自親和體、SpA結構域、LDL受體A類結構域或EGF結構域。因此認為本文公開內容 作為整體提供了使用這樣的結構域替代dAb的拮抗劑、配體和方法的公開內容。
[0041] 本發明的多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可以抵抗以下的一種或更多種：絲 氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶（例 如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、 leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例 如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（caspase) (例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白 酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋 白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性 蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物製劑來提供蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管肺泡灌 洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發現的蛋白酶。在一個實施方案中， 蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發現的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細菌蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施 方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發現的GI道蛋白酶或肺組 織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用於本文所述的涉及蛋白酶庫組（repertoire) 暴露於蛋白酶的方法中。
[0042] 在一個方面中，本發明提供了包含TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)結合位點的蛋白酶 抗性免疫球蛋白單可變域，其中與以下溫育時，可變域能抵抗蛋白酶例如胰蛋白酶：
[0043] ⑴在37°C下用濃度（c)為至少10微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時間 ⑴；或
[0044] (ii)在30°C下用濃度（c'）為至少40微克/ml的蛋白酶溫育至少一個小時的時 間⑴，
[0045] 其中所述可變域包含與D0Mlh-131-206的胺基酸序列（顯示於圖3中）為至少 90 %同一性的胺基酸序列。
[0046] 在一個實施方案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與可變域的比例（以摩爾/摩爾為基礎） 為8, 000至80, 000蛋白酶：可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為800至80, 000蛋白 酶：可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為8, 000至80, 000蛋白酶：可變域。在一 個實施方案中，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與可變域的比例（以重量/重量為基礎，例如微 克/微克）為16, 000至160, 000蛋白酶：可變域，例如，C為10微克/ml時，比例為1，600 至160, 000蛋白酶：可變域；或C或C'為100微克/ml時，比例為16, 000至160, 000蛋 白酶：可變域。在一個實施方案中，濃度（c或c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。 在一個實施方案中，濃度（c或c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。參照在此對使用 肽或多肽的組或文庫工作時適於蛋白酶使用的蛋白水解活性的條件的描述（例如，w/w參 數）。這些條件可以用於測定特定免疫球蛋白單可變域的蛋白酶抗性的條件。在一個實施方 案中，時間（t)為或約為一、三或24小時或過夜（例如，約12-16小時）。在一個實施方案 中，可變域在條件（i)下是有抗性的，並且濃度（c)為或約為10或100微克/ml蛋白酶，而 時間（t)為1小時。在一個實施方案中，可變域在條件（ii)下是有抗性的，並且濃度（c'） 為或約為40微克/ml蛋白酶，而時間（t)為或約為3小時。在一個實施方案中，蛋白酶選 自胰蛋白酶、彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰酶。在一個實施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是在痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管肺泡灌 洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液或眼淚中發現的蛋白酶。在一個實施方案中， 蛋白酶是在眼睛和/或眼淚中發現的。在一個實施方案中，蛋白酶是非細菌蛋白酶。在一 個實施方案中，蛋白酶是動物蛋白酶，例如，哺乳動物蛋白酶，例如，人蛋白酶。在一個實施 方案中，蛋白酶是GI道蛋白酶或肺組織蛋白酶，例如，在人體中發現的GI道蛋白酶或肺組 織蛋白酶。在此所列的這些蛋白酶也可以用於本文所述的涉及蛋白酶庫組暴露於蛋白酶的 方法中。
[0047] 在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白酶和/或選自彈性蛋白酶、Ieucozyme 和胰酶中的至少一種其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和 Ieucozyme ;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和Ieucozyme ;胰蛋白酶、彈性蛋白酶 和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和Ieucozyme ;或胰蛋白酶、胰酶和leucozyme。
[0048] 在一個實施方案中，在條件⑴或（ii)下溫育後，例如，在106至IO13的噬菌體文 庫大小，例如IO 8至IO12複製單位（傳染性病毒粒子），在噬菌體上展示可變域。
[0049] 在一個實施方案中，在條件（i)或（ii)下溫育後，可變域特異性地結合TNFR1，例 如，使用BiaCore?或ELISA來測定，例如，噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA。
[0050] 在一個實施方案中，本發明的可變域特異性地結合蛋白A或蛋白L。在一個實施方 案中，在條件（i)或（ii)下溫育後，存在與蛋白A或L的特異性結合。
[0051] 在一個實施方案中，例如，在條件（i)或（ii)下溫育後，本發明的可變域在ELISA 中，例如，在噬菌體ELISA或單克隆噬菌體ELISA中，具有至少0. 404的OD45tl讀數。
[0052] 在一個實施方案中，例如，在條件（i)或（ii)下溫育後，本發明的可變域在凝膠電 泳中（基本上）展示出單條條帶。
[0053] 在特定的實施方案中，本發明提供了為雙特異性配體的TNFRl拮抗劑，其含有 根據本發明的結合TNFRl的第一 dAb和具有與第一 dAb相同或不同結合特異性的第二 dAb。第二 dAb 可以結合選自 ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養素-1、CEA、CD40、CD40 配 體、⑶56、⑶38、⑶138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化 蛋白-2、Exodus-2、FAPa、FGF-酸性、FGF-鹼性、成纖維細胞生長因子-10、FLT3配體、 卩四(^&11^1^(〇父3〇、〇)嚦、6-〇5卩、6釐-〇5卩、6卩-0 1、人血清白蛋白、胰島素、正^^、16卩-1、 IGF-II、IL-I a、IL-I β、IL-I 受體、IL-II 型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8(72a.a·)、IL-8(77a.a·)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、 IL_18(IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF_2)、KGF、瘦蛋白 (Leptin)、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引 誘蛋白、M-CSF、MDC (67a. a.)、MDC (69a. a.)、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC (67a. a. )、MDC(69a. a. )、MIG、MIP-I a、MIP-I β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、脊髓源祖細胞抑制 劑因子-I (MPIF-I)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β -NGF、NT-3、NT-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFl a、SDFl β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF)、 TARC、TGF-a、TGF-P、TGF-P2、TGF-P3、腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-P、TNF 受體 I、 TNF 受體 II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、 VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- γ、HCCl、1-309、HERl、HER2、HER3、HER4、血清 白蛋白、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE、IL_13Ra l、IL_13Ra2、 IL-15、 IL-15R、 IL-16、 IL-17R、 IL-17、 IL-18、 IL-18R、 IL-23、 IL-23R、 IL-25、 CD2、 CD4、 CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Fur i n、內皮縮血管肽-1、嗜酸 粒細胞趨化蛋白（例如，嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白-2、嗜酸粒細胞趨化蛋 白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整聯蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、 MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-l、RANTES、SCF、SDF-l、siglec8、 TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4β 7、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 蛋白a)、MMP12、PDKl和IgE的目標物。
[0054] 在一個實例中，雙特異性配體包含結合TNFRl上第一表位的第一 dAb和結合不同 目標上表位的第二dAb。在另一個實例中，第二dAb結合血清白蛋白上的表位。
[0055] 在其他實施方案中，配體是包含具有TNFRl結合特異性的第一表位結合域和至 少一個具有不同於第一表位結合域的結合特異性的其他抗原結合域的多特異性配體。例 如，第一表位結合域可以是結合TNFRl的dAb或可以是包含結合TNFRl的dAb的⑶R (例如， 嫁接於合適的蛋白質支架或骨架上的CDR，支架或骨架例如為親和體、SpA支架、LDL受體A 類結構域或EGF結構域）的結構域或可以是結合TNFRl的結構域，其中結構域選自親和體、 SpA結構域、LDL受體A類結構域或EGF結構域。
[0056] 在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或抗-TNFRldAb單體的特徵在於以 下的一個或更多個：1)與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數（K d)和5ΧΚΓ1 至IXKT7iT1的Ktjff速度常數；如通過表面等離子共振所測定的；2)抑制腫瘤壞死因子 a (TNFa )與TNFRl的結合，具有500nM至50pM的IC50 ;3)在標準L929細胞測試中中和人 TNFR1，具有500nM至50pM的ND50 ;4)在標準細胞測試中對抗TNFRl的活性，具有彡IOOnM 的ND5tl，並且在該測試中濃度< 10 μ M的dAb激動TNFRl的活性< 5 % ;5)抑制在小鼠 LSP/ D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的致死力；6)抵抗聚集；7)當在大腸桿菌或畢赤酵 母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達時，以至少約〇. 5mg/L的量分泌；8)可逆地去摺疊 (unfold) ;9)在選自小鼠膠原誘導的關節炎模型、小鼠 AARE關節炎模型、小鼠 AARE炎性 腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導的炎性腸病模型、小鼠菸草煙霧慢性梗阻性肺病模型和 適當的靈長動物模型（例如靈長動物膠原誘導的關節炎模型）的慢性炎症疾病的模型中具 有功效；或10)在治療、抑制或預防慢性炎症疾病中具有功效。對於適用於條件（1)至（10) 的測定和測試以及參數的詳細內容，參考W02006038027,並且在此將其引入作為參考。
[0057] 在特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM 至20pM的解離常數（Kd)和5X KT1至IXKT7iT1的Ktjff速度常數，如通過表面等離子共振 所測定的；抑制腫瘤壞死因子a (TNF a )與TNFRl的結合，具有500nM至50pM的IC50 ;在 標準L929細胞測試中中和人TNFR1，具有500nM至50pM的ND50。在其他特定的實施方案 中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數（K d)和 5X KT1至IX KT7iT1的Ktjff速度常數；抑制腫瘤壞死因子a (TNFa)與TNFRl的結合，具 有500nM至50pM的IC50 ;並且在選自小鼠膠原誘導的關節炎模型、小鼠 AARE關節炎模 型、小鼠 AARE炎性腸病模型、小鼠葡聚糖硫酸鈉誘導的炎性腸病模型、小鼠菸草煙霧慢性 梗阻性肺病模型和適當的靈長動物模型（例如靈長動物膠原誘導的關節炎模型）的慢性炎 症疾病的模型中具有功效。在其他特定的實施方案中，多肽、拮抗劑、配體或dAb單體與人 TNFRl解離，具有50nM至20pM的解離常數（Kd)和5 X KT1至I X ΙΟ?的Ktjff速度常數，如 通過表面等離子共振所測定的；在標準L929細胞測試中中和人TNFR1，具有500nM至50pM 的ND50 ;並且在標準細胞測試中拮抗TNFRl的活性，具有彡IOOnM的ND5tl，並且濃度彡10 μ M 的dAb在測試中激動TNFRl的活性彡5%。
[0058] 本發明的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑在哺乳動物例如人的疾 病或病症的治療、預防和診斷中具有實用性。特別地，由於給藥於患者如人時藥物很可能遇 到蛋白酶，因此它們具有實用性。例如，給藥於GI道（例如，口服、舌下、直腸給藥）時，在 該情況中，多肽、免疫球蛋白單可變域和拮抗劑可能遇到上GI道、下GI道、口、胃、小腸和大 腸中的一個或更多個中的蛋白酶。因此，一個實施方案提供了口服、舌下或直腸給藥於患者 GI道的蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑，以治療和/或預防患者的疾病或 病症。例如，口服給藥於患者（例如，人患者），用於治療和/或預防TNFa-介導的病症或 疾病，如關節炎（例如類風溼性關節炎）、IBD、牛皮癬或克羅恩氏病（Crohn' s disease)。
[0059] 在另一個實例中，給藥於（例如，通過吸入或鼻內）肺部組織（例如，肺或氣道） 時，多肽、可變域或拮抗劑很可能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了通過吸入或鼻內 將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗劑給藥於患者（例如，人）的肺部組織，以 治療和/或預防患者的疾病或病症。這樣的病症可以是哮喘（例如，過敏性哮喘）、C0PD、 流感或W02006038027中公開的任何其他肺部疾病或病症，在此引入作為參考。在另一個實 例中，給藥於（例如，通過眼內注射或作為滴眼劑）患者眼睛時，多肽、可變域或拮抗劑很可 能遇到蛋白酶。因此，一個實施方案提供了將蛋白酶抗性多肽、免疫球蛋白單可變域或拮抗 劑通過眼睛給藥於患者（例如，人），以治療和/或預防患者的疾病或病症（例如，眼睛的疾 病或病症）。給藥可以是局部給藥於眼睛，以滴眼劑的形式，或通過注入眼睛中，例如進入 玻璃體中。
[0060] 根據本發明的拮抗劑、多肽和免疫球蛋白單可變域可以呈現出提高的或相對高的 解鏈溫度（Tm),提供提高的穩定性。高親和性目標結合也是或者是可替換地是拮抗劑、多肽 和可變域的特徵。這些特徵中的一個或更多個，結合蛋白酶抗性，使得拮抗劑、可變域和多 肽可以用作哺乳動物如人的藥物，其中，例如對於GI道或肺部組織給藥，很可能遇到蛋白 酶。
[0061] 因此，在一個方面中，本發明提供了用於口服遞送的TNFRl拮抗劑。在一個方面 中，本發明提供了用於遞送至患者GI道的TNFRl拮抗劑。在一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑在製造用於口服遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供了 TNFRl 在製造用於遞送至患者GI道的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗胰蛋白 酶和/或至少一種選自彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰酶的其他蛋白酶。例如，能抵抗胰蛋 白酶和彈性蛋白酶；胰蛋白酶和Ieucozyme ;胰蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶和 Ieucozyme ;胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胰酶；胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胰酶和Ieucozyme ;或胰 蛋白酶、胰酶和Ieucozyme。
[0062] 在一個方面中，本發明提供了用於肺部遞送的TNFRl拮抗劑。在一個方面中，本發 明提供了 TNFRl拮抗劑用於遞送到患者的肺。在一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑 在製造用於肺部遞送的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑在製造 用於遞送至患者肺部的藥物中的用途。在一個實施方案中，可變域能抵抗leucozyme。
[0063] 在一個方面中，本發明提供了口服遞送或遞送藥物至患者的GI道或至患者的肺 或肺部組織的方法，其中該方法包括將藥物學上有效量的本發明的TNFRl拮抗劑給藥於患 者。
[0064] 在一個方面中，本發明提供了本發明的TNFRl拮抗劑用於治療和/或預防炎症。在 一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑在製造用於治療和/或預防炎症的藥物中的用途。 在一個實施方案中，病症選自關節炎、多發性硬化、炎性腸病和慢性梗阻性肺病。例如，所述 關節炎是類風溼性關節炎或幼年型類風溼性關節炎。例如所述炎性腸病選自克羅恩氏病和 潰瘍性結腸炎。例如，所述慢性梗阻性肺病選自慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎和肺 氣腫。例如所述肺炎是細菌性肺炎。例如所述細菌性肺炎是葡萄球菌性肺炎。
[0065] 在一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑用於治療和/或預防呼吸道疾病。在 一個方面中，本發明提供了 TNFRl拮抗劑在製造用於治療和/或預防呼吸道疾病的藥物中 的用途。例如，所述呼吸道疾病選自肺炎、慢性梗阻性肺病、哮喘、肺炎、超敏性肺炎、肺嗜酸 性粒細胞浸潤症、環境性肺病、肺炎、支氣管擴張、囊性纖維化、間質性肺病、原發性肺動脈 高壓、肺血栓栓塞症、胸膜病症、縱隔病症、橫膈膜病症、肺換氣不足、換氣過度、睡眠窒息、 急性呼吸窘迫綜合症、間皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植對抗宿主疾病、肺癌、過敏性鼻炎、過敏 症、石綿沉著病、麴黴腫、麴黴病、支氣管擴張、慢性支氣管炎、肺氣腫、.嗜酸細胞性肺炎、特 發性肺纖維化、入侵性肺炎球菌病、流感、非結核性分枝桿菌病、胸腔積液、肺塵症、肺孢子 蟲病、肺炎、肺放線菌病、肺泡蛋白沉著症、肺炭疽、肺水腫、肺栓子、肺炎、肺組織細胞增生 症X、肺動脈高壓、肺諾卡菌病、肺結核、肺靜脈閉塞症、類風溼性肺病、結節病和韋格內氏肉 芽腫症。例如，疾病是慢性梗阻性肺病（COPD)。例如，疾病是哮喘。
[0066] 可以使用任何合適的方法將本發明含有抑制TNFRl的藥劑（例如，其中藥劑選自 抗體片段（例如，Fab片段、Fab'片段、Fv片段（例如，scFv、二硫化物鍵合的Fv)、F(ab'）2 片段、dAb)、配體以及dAb單體和多聚體（例如，同型-或雜二聚體））的拮抗劑局部給藥 於對象肺組織（例如，肺）。例如，可以通過吸入或鼻內給藥將藥劑局部給藥於肺部組織。 對於吸入或鼻內給藥，可以使用噴霧器、吸入器、霧化器、煙霧器、彌霧器、乾粉吸入器、計量 吸入器、計量噴霧器、計量彌霧器、計量霧化器或其他合適的吸入器或鼻內遞送裝置來給藥 TNFRl的拮抗劑。因此，在一個實施方案中，本發明提供了含有TNFRl拮抗劑的肺遞送裝置。 在一個實施方案中，裝置是吸入器或鼻內遞送裝置。
[0067] 在一個方面中，本發明提供了含有TNFRl拮抗劑的口服製劑。該製劑可以是片劑、 丸劑、膠囊、液體或糖楽。
[0068] 在一個方面中，本發明提供了用於遞送至肺的肺製劑，其中製劑含有本發明的 拮抗劑、多肽或可變域，粒徑範圍小於5微米，例如，小於4. 5、4、3. 5或3微米（例如，在 Britton-Robinson緩衝液中時，例如，在6. 5至8. 0的pH,例如在7至7. 5的pH,例如在 pH7 或 ρΗ7· 5)。
[0069] 在一個實施方案中，在6. 5至8. 0的pH下提供本發明的製劑和組合物，例如7至 7. 5,例如7,例如7. 5。
[0070] 根據本發明任一方面的可變域可以具有至少50°C的Tm,或至少55°C，或至少 60°C，或至少65°C，或至少70°C。本發明的拮抗劑、用途、方法、裝置或製劑可以含有這樣的 可變域。
[0071] 在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或製劑在 Britton-Robinson緩衝液中在37至50°C下溫育14天後（在lmg/ml的多肽或可變域濃 度下）基本上是穩定的。在一個實施方案中，在37°C下這樣的溫育後，至少65、70、75、80、 85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在 一個實施方案中，在37°C下這樣的溫育後，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在501：下這樣的溫 育後，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99%的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在501： 下這樣的溫育後，至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在 任一個這樣的溫育後，未看到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。在一個實施方案中，在37°C下在 Britton-Robinson緩衝液中以lmg/ml的多肽或可變域濃度溫育後，多肽或可變域的pi保 持未改變或基本上未改變。
[0072] 在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或製劑在 Britton-Robinson緩衝液在7至7. 5的pH(例如，在pH7或ρΗ7· 5)在4°C下溫育7天後 (在100mg/ml的多肽或可變域濃度下）基本上是穩定的。在一個實施方案中，在這樣的溫 育後，至少95、95. 5、96、96. 5、97、97. 5、98、98. 5、99或99. 5%的多肽、拮抗劑或可變域保持 未聚集。在一個實施方案中，在這樣的溫育後，至少95、95. 5、96、96. 5、97、97. 5、98、98. 5、 99或99. 5%的多肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的溫育後，未看 到多肽、可變域、拮抗劑的聚集。
[0073] 在本發明的一個方面中，本發明的多肽、可變域、拮抗劑、組合物或製劑在例如噴 射噴霧器，例如在Pari LC+杯中，例如，在室溫、20°C或37°C下噴霧1小時後（在40mg/ml的 多肽或可變域濃度下）基本上是穩定的。在一個實施方案中，在這樣的噴霧後，至少65、70、 75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95· 5、96、96· 5、97、97· 5、98、98·5、99 或 99. 5 % 的多肽、拮抗劑或可變域保持未聚集。在一個實施方案中，在這樣的噴霧後，至少65、70、75、 80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95· 5、96、96· 5、97、97· 5、98、98· 5、99 或 99. 5% 的多 肽或可變域保持單體。在一個實施方案中，在任一個這樣的噴霧後，未看到多肽、可變域、拮 抗劑的聚集。
[0074] 根據本發明任何方面的可變域可以在MRC-5細胞測試中中和TNFa刺激的IL-8 釋放，其具有2nM?50pM的ND50。本發明的拮抗劑、用途、方法、裝置或製劑可以包含這類 可變域。
[0075] 在一個方面中，本發明提供了編碼含有根據本發明任一方面的免疫球蛋白單可變 域的多肽或編碼根據本發明任一方面的多肽、拮抗劑或可變域的分離的或重組的核酸。在 一個方面中，本發明提供了含有核酸的載體。在一個方面中，本發明提供了含有核酸或載體 的宿主細胞。在一個方面中，本發明提供了生產含有免疫球蛋白單可變域的多肽的方法，該 方法包括在適於所述核酸或載體表達的條件下維持宿主細胞，由此產生含有免疫球蛋白單 可變域的多肽。該方法進一步包括分離多肽、可變域或拮抗劑，並任選產生比分離的多肽可 變域或拮抗劑具有提高的親和性和/或ND50的變體，例如，突變體。用於提高免疫球蛋白 單可變域的結合親和性的技術是本領域已知的，例如，用於親和性突變的技術。
[0076] 在一個方面中，本發明提供了含有本發明任一方面的免疫球蛋白單可變域、多肽 或拮抗劑和藥物學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥物組合物。
[0077] 在一個實施方案中，本發明任一方面的免疫球蛋白單可變域或拮抗劑含有抗體恆 定域，例如，抗體Fe,任選其中Fc的N-端連接（任選直接連接）可變域的C-端。
[0078] 本發明的多肽或可變域可以是分離的和/或重組的。
[0079] 本文描述了用於選擇蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多 肽，在適於蛋白酶活性的條件下混合組和蛋白酶，並回收具有理想生物活性（例如特異性 結合TNFR1)的肽或多肽，由此選擇蛋白酶抗性肽或多肽。
[0080] 通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需 的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基 蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃 蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶 (例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋 白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物製劑 來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育後將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白 酶的混合物中。
[0081] 在一些實施方案中，基於結合活性回收具有所需生物活性的肽或多肽。例如，可 以基於結合通用配體（如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收肽或多肽。結合活性還可以是對 目標配體的特異性結合。示例性目標配體包括ApoE、Apo-SAA、BDNF、心肌營養素-1、CEA、 CD40、CD40配體、CD56、CD38、CD138、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒 細胞趨化蛋白-2、Exodus-2、FAP a、FGF-酸性、FGF-鹼性、成纖維細胞生長因子-10、FLT3 配體、Fractalkine(CX3C)、⑶NF、G-CSF、GM-CSF、GF-β 1、人血清白蛋白、胰島素、IFN-γ、 IGF-I、IGF-II、IL-I a、IL-I β、IL-I 受體、IL-II 型受體、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8(72a.a·)、IL-8(77a.a·)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、IP-10、角化細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦 蛋白、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒管抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘 蛋白、M-CSF、MDC(67a. a. )、MDC(69a. a. )、MCP-I (MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a. a. )、MDC(69a. a. )、MIG、MIP-I a、MIP-I β、MIP-3 α、MIP-3 β、MIP-4、脊髓源祖細胞抑制 劑因子-I (MPIF-I)、NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素 Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFl a、SDFl β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF)、 TARC、TGF-a、TGF-P、TGF-P 2、TGF-P 3、腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-P、TNF 受體 I、 TNF 受體 II、TNIL-1、TP0、VEGF、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGF受體1、VEGF受體2、 VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- γ、HCCl、1-309、HERl、HER2、HER3、HER4、血清 白蛋白、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣蛋白a)、MMP12、PDKl、IgE、IL_13Ra l、IL_13Ra2、 IL-15、 IL-15R、 IL-16、 IL-17R、 IL-17、 IL-18、 IL-18R、 IL-23、 IL-23R、 IL-25、 CD2、 CD4、 CDl la、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD56、CD138、ALK5、EGFR、FcERl、TGFb、 CCL2、CCL18、CEA、CR8、CTGF、CXCL12 (SDF-1)、糜蛋白酶、FGF、Fur in、內皮縮血管肽-1、嗜酸 粒細胞趨化蛋白（例如，嗜酸粒細胞趨化蛋白、嗜酸粒細胞趨化蛋白-2、嗜酸粒細胞趨化蛋 白-3)、GM-CSF、ICAM-1、ICOS、IgE、IFNa、1-309、整聯蛋白、L-選擇蛋白、MIF、MIP4、MDC、 MCP-1、MMP、嗜中性彈性蛋白酶、骨橋蛋白、0X-40、PARC、PD-1、RANTES、SCF、SDF-1、s i g I e c8、 TARC、TGFb、凝血酶、Tim-1、TNF、TRANCE、類胰蛋白酶、VEGF、VLA-4、VCAM、α 4β 7、CCR2、 CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8、ανβ6、ανβ8、cMET、CD8、vWF、澱粉樣蛋白（例如，澱粉樣 蛋白 a)、MMP12、PDKl 和 IgE。
[0082] 在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。
[0083] 在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤黴素展示、細 菌展示、在質粒上展示或共價展示。示例性展示系統與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽 或多肽的功能性特徵相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可複製的遺傳包。
[0084] 在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0085] 在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的 核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核酸。 [0086] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0087] 在另一個方面中，提供了從一組肽或多肽中選擇以高親和性結合目標配體例如 TNFRl的肽或多肽的方法。該方法包括提供一組肽或多肽，在適於蛋白酶活性的條件下混合 組和蛋白酶並回收結合目標配體的肽或多肽。
[0088] 通常將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。在該方法中可以使用任何所需 的蛋白酶，如以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基 蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃 蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶 (例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方案中，蛋 白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或leucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生物製劑 來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育後將蛋白酶抑制劑加入組和蛋白 酶的混合物中。
[0089] 可以基於結合任何所需的目標配體如在此公開的目標配體（例如TNFR1)來回收 肽或多肽。在特定的實施方案中，通過淘洗來回收肽或多肽。
[0090] 在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤黴素展示、細 菌展示、在質粒上展示或共價展示。示例性展示系統與核酸的編碼功能和由核酸編碼的肽 或多肽的功能性特徵相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可複製的遺傳包。
[0091] 在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0092] 在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼具有所需生物活性的肽或多肽的 核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核酸。 [0093] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0094] 在另一個方面中，本文描述了生產一組蛋白酶抗性肽或多肽的方法。該方法包括 提供一組肽或多肽，在適於蛋白酶活性的條件下混合一組肽或多肽和蛋白酶，並回收多個 具有所需生物活性的肽或多肽，由此產生一組蛋白酶抗體肽或多肽。
[0095] 在一些實施方案中，將組和蛋白酶溫育至少約30分鐘的時間段。例如，在該方法 中所用的蛋白酶可以是以下的一種或更多種，絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋 白酶、巰基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組 織蛋白酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白 酶、凝乳酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋 白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、鈣激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶 (ficain)、梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。在特定的實施方 案中，蛋白酶是胰蛋白酶、彈性蛋白酶或Ieucozyme。還可以通過生物提取物、生物勻楽或生 物製劑來提供蛋白酶。如果需要，該方法進一步包括在完成溫育後將蛋白酶抑制劑加入組 和蛋白酶的混合物中。
[0096] 在一些實施方案中，基於結合活性回收多個具有所需生物活性的肽或多肽。例如， 可以基於結合通用配體（如蛋白A、蛋白G或蛋白L)來回收多個肽或多肽。結合活性還可 以是對目標配體的特異性結合，如本文所述的目標配體。在特定的實施方案中，通過淘洗回 收多個具有所需生物活性的肽或多肽。
[0097] 在一些實施方案中，組包括展示系統。例如，展示系統可以是噬菌體展示、核糖體 展示、乳液區室化（emulsion compartmentalization)和展示、酵母展示、噪呤黴素展示、細 菌展示、在質粒上展示或共價展示。在特定的實施方案中，展示系統與核酸的編碼功能和由 核酸編碼的肽或多肽的功能性特徵相關。在特定的實施方案中，展示系統含有可複製的遺 傳包。
[0098] 在一些實施方案中，展示系統包括噬菌體展示。例如，噬菌體可以是fd、M13、λ、 MS2或Τ7。在特定的實施方案中，噬菌體展示系統是多價的。在一些實施方案中，作為pill 融合蛋白來展示肽或多肽。
[0099] 在其他實施方案中，該方法進一步包括擴增編碼多個具有所需生物活性的肽或多 肽的核酸。在特定的實施方案中，通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應來擴增核 酸。
[0100] 在一些實施方案中，組是一組免疫球蛋白單可變域。在特定的實施方案中，免疫球 蛋白單可變域是重鏈可變域。在更特別的實施方案中，重鏈可變域是人重鏈可變域。在其 他實施方案中，免疫球蛋白單可變域是輕鏈可變域。在特定的實施方案中，輕鏈可變域是人 輕鏈可變域。
[0101] 在另一個方面中，本文描述了從組中選擇蛋白酶抗性多肽的方法，該多肽包括結 合目標配體例如TNFRl的免疫球蛋白單可變域（dAb)。在一個實施方案中，該方法包括提供 含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多肽含有免疫球蛋白單可變域，在適於蛋白酶活性的 條件下，將噬菌體展示系統和選自彈性蛋白酶、Ieucozyme和胰蛋白酶的蛋白酶混合，並回 收展示了含有結合目標配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。
[0102] 在一些實施方案中，以100 μ g/ml來使用蛋白酶，並將混合的噬菌體展示系統和 蛋白酶在約37 °C下溫育過夜。
[0103] 在一些實施方案中，通過結合所述目標來回收展示了含有結合目標配體的免疫球 蛋白單可變域的多肽的噬菌體。在其他實施方案中，通過淘洗來回收展示了含有結合目標 配體的免疫球蛋白單可變域的多肽的噬菌體。
[0104] 本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的蛋白酶抗性肽或 多肽。在特定的實施方案中，本文提供了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的分離的 蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、Ieucozyme)抗性免疫球蛋白單可變域（例如，人抗 體重鏈可變域，人抗體輕鏈可變域）。
[0105] 本文還描述了編碼通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多 肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）的分離的或 重組的核酸，以及含有該核酸的載體（例如，表達載體）和宿主細胞。
[0106] 本文還描述了製備通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多 肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）的方法，包 括在適於表達的條件下維持含有編碼蛋白酶抗性肽或多肽的重組核酸的宿主細胞，由此產 生蛋白酶抗性肽或多肽。
[0107] 本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽 (例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）用於藥物中 (例如，用於治療或診斷）。本文還描述了通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白 酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變 域）用於製造治療疾病的藥物的用途。本文還描述了治療疾病的方法，包括將有效量的通 過本文所述的方法可選擇的或已選擇的蛋白酶抗性肽或多肽（例如，胰蛋白酶_、彈性蛋白 酶-或Ieucozyme-抗性免疫球蛋白單可變域）給藥於需要的患者。
[0108] 本文還描述了用於測定樣品中是否存在TNFRl或樣品中存在多少TNFRl的診斷試 劑盒，其含有本發明的多肽、免疫球蛋白可變域（dAb)或拮抗劑和使用說明書（例如，用於 測定樣品中TNFRl的存在和/或含量）。在一些實施方案中，試劑盒進一步包括一種或更多 種助劑，如合適的緩衝劑或合適的檢測劑（例如，結合本發明的多肽或dAb的可檢測標記的 抗體或其抗原結合片段或與其連接或綴合的部分）。
[0109] 本發明還涉及包括固體表面的裝置，在該表面上固定了本發明的多肽拮抗劑或 dAb，使得固定的多肽或dAb結合TNFR1。可以使用在其上可以固定抗體或其抗原結合片段 的任何合適的固體表面，例如，玻璃、塑料、碳水化合物（例如，瓊脂糖珠子）。如果需要，支 持物可以含有或將其修飾來含有所需的功能基團，以促進固定。裝置和或支持物可以具有 任何合適的形狀，例如，片狀、棒狀、條狀、平板、載玻片、珠子、丸狀、圓板、凝膠、管狀、球狀、 晶片、平板或圓盤等。在一些實施方案中，裝置是量杆。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0110] 圖1是PDOM 13(aka PD0M33)的多克隆位點的說明，其用來製備噬菌體展示組。
[0111] 圖2顯示了用來自用40ug/ml胰蛋白酶在30°C下溫育不同時間點的dAb的樣品 進行的幾個Novex 10-20% Tricene凝膠電泳。就在加入胰蛋白酶之前，然後在加入胰蛋 白酶之後一小時、三小時和24小時時立即取樣。用IxSureBlue將蛋白質染色。凝膠說明 DOM 15-10和D0M15-26-501在用胰蛋白酶溫育的頭三個小時的過程中都得到了明顯消化。 DOM 15-26、DOM 4-130-54和DOM lh-131-511的消化只在用胰蛋白酶溫育24小時後才變 得明顯。
[0112] 圖3是DOM lh-131-511和24個選擇的變體的胺基酸序列的說明。選定克隆中不 同於親本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。用框顯示對應於CDR1、 CDR2和CDR3的環。
[0113] 圖4是DOM 4-130-54和27個選擇的變體的胺基酸序列的說明。選定克隆中不同 於親本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。用框顯示對應於CDRl、CDR2 和CDR3的環。
[0114] 圖5是DOM 15-26-555和21個選擇的變體的胺基酸序列的說明。選定克隆中不 同於親本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。用框顯示對應於CDR1、 CDR2和CDR3的環。
[0115] 圖6是DOM 15-10和16個選擇的變體的胺基酸序列的說明。選定克隆中不同於 親本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。用框顯示對應於CDR1、CDR2 和CDR3的環。
[0116] 圖7A-7D是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶（從0至lOOyg/ml)在37°C溫育過 夜後親本 dAb，DOM lh-131-511(圖 7A)和三個變體 dAb，DOM lh-131-203(圖 7B)、DOM lh-131-204(圖 7C)和 DOM lh-131-206(圖 7D)與固定的 TNFRl 結合的 BIAcore 痕跡。結 果表明所有三個變體對高濃度胰蛋白酶（lOOug/ml)的蛋白水解的抗性比親本高。
[0117] 圖8A-8C是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyme溫育過夜後dAbDOM lh-131-511 (圖 8A)、DOM lh-131-202 (圖 8B)和 DOM lh-131-206 (圖 8C)與固定的 TNFRl 結合的 BIAcore 痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗彈性蛋白酶和Ieucozyme的蛋白水解提高的抗性。
[0118] 圖 9 顯示 了用胰蛋白酶溫育前 dAb DOM lh-131-511、D0Mlh-131-203、DOM lh-131-204、DOM lh-131-206、DOM lh-131-54、D0Mlh-131-201 和 DOM lh-131-202 的樣品 和用100 μ g/ml胰蛋白酶溫育I小時、3小時和24小時後的樣品進行的兩個4-12% Novex Bis-Tris凝膠電泳。
[0119] 圖10A-10C是顯示了用不同濃度的胰蛋白酶（從0至100yg/ml)在37°C溫育過 夜後 DOM 4-130-54(圖 10A)、DOM 4-130-201(圖 10B)和 DOM 4-130-202(圖 10C)與固定 的IL-IRl融合蛋白結合的BIAcore痕跡。結果顯示兩種變體對高濃度胰蛋白酶（100 μ g/ ml)的蛋白水解的抗性都比它們的親本高。
[0120] 圖11A-11C是顯示了用彈性蛋白酶和Ieucozyme溫育過夜後D0M4-130_54(圖 11A)、D0M 4-130-201(圖 11B)和 DOM 4-130-202(圖 11C)與固定的 IL-IRl 融合蛋白結合 的BIAcore痕跡。與親本相比，dAb顯示出對抗所測試的兩種蛋白酶的蛋白水解提高的抗 性。
[0121] 圖12是DOM 15-26-555和6個變體的胺基酸序列的說明。選定克隆中不同於親 本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。
[0122] 圖13A和13B是顯示了親本dAb，DOM 15-26-555(圖13A)和蛋白酶抗性最大的變 體，DOM lh-131-206(圖13B)與固定的VEGF結合的BIAcore痕跡。在用濃度為200yg/ml 的胰蛋白酶溫育後，在IOOnM的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結合。將 反應在37°C下進行三小時或24小時。結果表明在胰蛋白酶處理24小時後，變體對蛋白水 解的抗性比親本高。
[0123] 圖14是顯示了胰蛋白酶處理對DOM 15-26-555變體的hVEGF結合的影響的圖。 結果清楚地顯示出在胰蛋白酶處理2 4小時後，所有變體對蛋白水解的抗性比親本（D OM 15-26-555)高。
[0124] 圖15顯示了裝載了 15 μ g處理過的和未處理過的DOM 15-26-555或DOM lh-131-206樣品的兩個Novex 10-20% Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然後在加 入胰蛋白酶之後一小時、三小時和24小時時立即取樣。用IxSureBlue將蛋白質染色。凝 膠說明DOM lh-131-206的胰蛋白酶抗性特徵不同於BIAcore實驗顯示的特徵。
[0125] 圖16是DOM 15-10和變體，DOM 15-10-11的胺基酸序列的說明。變體中不同於 親本序列的胺基酸是高亮顯示的（相同的那些用圓點標記）。
[0126] 圖 17A 和 17B 是顯示了親本，DOM 15-10(圖 17A)和變體，D0M15-10-11(圖 17B) 與固定的VEGF結合的BIAcore痕跡。在用濃度為200 μ g/ml的胰蛋白酶溫育後，在IOOnM 的dAb濃度下，比較BIAcore上親本和變體的hVEGF結合。將反應在37°C下進行一小時、三 小時或24小時。結果表明在胰蛋白酶處理24小時後，變體對蛋白水解的抗性比親本高。
[0127] 圖 18 顯示了 裝載了 15 μ g DOM 15-10 或 DOM 15-10-11 樣品的兩個 Novex 10-20% Tricine凝膠。就在加入胰蛋白酶之前，然後在加入胰蛋白酶之後一小時、三小時 和24小時時立即取樣。用SureBlue (Ix)將蛋白質染色。結果表明BIAcore研究中看到的 結合活性直接反映出蛋白質的完整性。
[0128] 圖19A-19L說明了編碼是DOM lh-131-511或DOM 4-130-54變體的dAb的幾個核 酸的核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖3和圖4中所示的胺基酸序列。
[0129] 圖20A-20E說明了編碼是DOM 15-26-555或DOM 15-10變體的dAb的幾個核酸的 核苷酸序列。核苷酸序列各自編碼圖5和圖6中所示的胺基酸序列。
[0130] 圖21顯示了 pDOM 38的載體圖譜。
[0131] 圖22 :顯示了 Labchip上在30°C下在25 : IdAb :胰蛋白酶比例下用胰蛋白酶處 理DOM 10-53-474和DOM lh-131-206蛋白質不同時間點的凝膠電泳。箭頭顯示全長蛋白
[0132] 圖23 :顯示了通過MMC色譜接著陰離子交換的純化後從每個樣品獲得的高水平純 度的大小排阻色譜痕跡。在225nm下監控UV，並將柱子在含有10%乙醇（v/v)的IxPBS中 運行。通過整合使用基線校準的峰面積來計算單體百分比。
[0133] 圖 24 :顯示了 DOM lh-131-511、D0M lh-131-202 和 D0Mlh-131-206 的蛋白酶穩定 性數據。
[0134] 圖 25 :是 SEC，其說明了 DOM lh-131-202、D0M lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在 37和50°C下在Britton-Robinson中的14天穩定性數據。對於所有dAb，蛋白質濃度為 lmg/ml。SEC用來測定蛋白質在熱應力過程中是否發生了任何變化和相對於時間=O(TO) 樣品溶液中殘餘的單體含量。
[0135] 圖26A至I :顯示了 SEC痕跡，其顯示了熱應力（37和50°C )對DOM lh-131-511 (A 至C)，-202 (D至F)和-206 (G至I)的影響。還顯示了在給定時間點時相對於T = 0溶液 中殘餘的單體含量。
[0136] 圖 27 :顯示了 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 24hr、48hr 以及7和14天熱應力的IEF分析。樣品已經在Britton-Robinson緩衝液中在37或50°C 下進行了溫育。
[0137] 圖 28 :TNFR-1BRA，顯示了 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 在50°C下溫育14天的影響。假定蛋白質濃度為lmg/ml。還顯示了沒有結合抗原的陰性對 照 dAb (VH 模型（dummy))。
[0138] 圖 29 :說明 了將?100mg/ml 的 A :D0M lh-131-202、B :D0M lh-131-206 和 C :D0M lh-131-511在Britton-Robinson緩衝液中在+4°C下存儲7天的影響。在280nm下監控 UV0
[0139] 圖 30 :顯示了來自 DOM lh-131-202、DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 在 Pari E-fiow和LC+中的噴霧器測試的數據。在任一 Britton-Robinson緩衝液中，蛋白質濃度為 5mg/ml〇
[0140] 圖 31 :說明了 Britton-Robinson 緩衝液中 5mg/ml 的 DOMlh-131-202、DOM lh-131-206和DOM lh-131-511在噴霧過程中單體濃度的相對百分比變化。
[0141] 圖 32 :顯示了 fcittor-Robinson 緩衝液中 DOM lh-131-206 和 DOMlh-131-511 從 Pari LC+噴霧後的SEC痕跡。
[0142] 圖33 :顯示了 PBS中40mg/ml的DOM lh-131-206在1小時的噴霧過程中的SEC痕 跡。噴霧器杯和氣霧劑中的蛋白質對於噴霧過程中dAb經受到的剪切力和熱應力的影響都 是高度抗性的。
[0143] 圖 34 :顯示了三種主要蛋白質（DOM lh-131-206 和 DOM lh-131-511 和 DOM lh-131-202)中每一種的沉澱速度曲線。對於DOM lh-131-206較低濃度的樣品觀察到的雙 峰是由於該情況中樣品從室中洩漏出來造成的假象。
[0144] 圖35 :顯示了緩衝液和裝置對GSK 1995056A(D0M lh-131-511)噴霧液滴大小的 影響。
[0145] 圖36 :顯示了 GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在各種裝置中噴霧後的穩定性， 通過二聚體形成來測定，如通過SEC來測量。
[0146] 圖 37 :顯示了 GSK 1922567A(202)、GSK 1995057A(206)和 GSK 1995056A(511)在 Pari E-flow和LC+中的噴霧器測試。A)在Britton-Robinson緩衝液中測試，B)在PEG 1000/蔗糖緩衝液中測試。
[0147] 圖38:描繪了人TNFRl受體結合測試中的TNF-α劑量曲線。每個樣品重複四次 進行測試。
[0148] 圖 39 :顯示了 GSK 1922567A(D0M lh-131-202)、GSK 1995057A(D0M lh-131-206) 和GSK 1995056A(D0M lh-131-511)在人TNFRl受體結合測試中的抑制作用。每個樣品重 復四次進行測試。
[0149] 圖 40 :說明了 DOM 15-26 和 DOM 15-26-593dAb 在 VEGF RBA 中的功效。
[0150] 圖 41 :顯示了將 5mg/mg DMS 1529 (D0M 15-26-593)和 DMS 1545 (D0M 15-26-501) 以單次濃注（bolus)劑量i.v.給藥於大鼠後的藥物動力學。
[0151] 圖 42a :顯示了 DMS 1529Fc 融合體（DOM 15-26-593FC 融合體）的 SEC-MALL (大 小排阻色譜-多角度雷射散射）分析，證實了單體的特徵。顯示了兩個不同的批次，對於折 射率（即，濃度；虛線）和光散射（實線），證明了相似的特徵。用箭頭標記的線條表示分 子量計算。
[0152] 圖42b :顯示了 DMS 1529Fc融合體（DOM 15-26-593FC融合體）的AUC (分析超速 離心）分析，證實了單體的特徵。在三個不同的濃度下（PBS緩衝液中接近0. 2、0. 5&1. Omg/ ml)測試一批材料。沉澱速率的分析證實了大約SOkDa的分子量。
[0153] 圖 43 :顯示了 DMS 1529 (D0M 15-26-593)和 DOM 15-26-501 的 DSC 痕跡。
[0154] 圖44 :是對兩個不同批次的材料進行10次凍-融循環之前和之後，DMS 1529 (D0M lh-131-206)的 VEGF 結合 ELISA。
[0155] 圖45 :顯示了 10次凍-融循環之前和之後，DOM 15-26-593SEC特徵的一致性。
[0156] 圖46 :說明了 DMS 1529融合體（DOM 15-26-593FC融合體）的加速穩定性研究的 結果；結合ELISA證明了在所示溫度下溫育7天後的活性。
[0157] 圖 47A :顯示了在 37°C溫育 14&15 天后，人獼猴中的 DMS 1529 (D0M 15-26-593) 的穩定性。
[0158] 圖47B :顯示了在37°C溫育14&15天後，人血清中的DMS 1529Φ0Μ 15-26-593)的 穩定性。
[0159] 圖 48 :顯示了 DOM 15-26&D0M 15-26-593dAb 作為 Fc 融合體（各自為 DOM 1564&D0M 1529)在 VEGF RBA 中的功效。
[0160] 圖49 :說明了 DMS 1529融合體（DOM 15-26-593FC融合體）對HUVEC細胞增殖的 抑制作用。
[0161] 圖 50 :pDom33 載體圖譜。
[0162] 圖51 :描繪了結合血清白蛋白的dAb的序列（胺基酸和核苷酸序列）。

【具體實施方式】
[0163] 在本說明書中，已經參照實施方案，以使得說明書既清楚又簡明的撰寫方式來描 述了本發明。但是打算並且應當理解，可以對這些實施方案進行各種組合和分開，而沒有脫 離本發明。
[0164] 除非另外限定，在此所用的所有技術和科學術語都具有本領域（例如，細胞培養、 分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學）普通技術人員公知的相同含義。將標準技術 用於分子、遺傳和生化方法（通常參見，Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆，實驗室手冊），第 2版（1989) ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (簡 明分子生物學實驗方法）（1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.，在此將其引入作為參考） 和化學方法。
[0165] 如在此所用的，術語"腫瘤壞死因子受體I (TNFRl)的拮抗劑"或"抗-TNFRl拮抗 齊U"等指的是結合TNFRl並可以抑制（S卩，一種或更多種）TNFRl功能的物質（例如，分子， 化合物）。例如TNFRl的拮抗劑能夠抑制TNF α結合TNFRl和/或抑制通過TNFRl介導的 信號轉導。因此，利用TNFRl的拮抗劑能夠抑制TNFRl介導的過程和細胞應答（例如在標 準的L929細胞毒性測試中的TNF α誘導的細胞死亡）。
[0166] 如在此所用的，"肽"指的是通過肽鍵連接在一起的兩個至約50個胺基酸。
[0167] 如在此所用的，"多肽"指的是通過肽鍵連接在一起的至少約50個胺基酸。多肽 通常包括三級結構並摺疊成功能域。
[0168] 如在此所用的，"對蛋白酶降解抗性的"肽或多肽（例如，域抗體（dAb))是在適 於蛋白酶活性的條件下用蛋白酶溫育時，基本上不受蛋白酶的降解。在適於蛋白酶活性的 溫度下用蛋白酶溫育一小時後，不超過約25%、不超過約20%、不超過約15%、不超過約 14%、不超過約13%、不超過約12%、不超過約11 %、不超過約10%、不超過約9%、不超過 約8%、不超過約7%、不超過約6%、不超過約5%、不超過約4%、不超過約3%、不超過約 2%、不超過約1%或基本上沒有蛋白質受蛋白酶降解時，多肽（例如，dAb)基本上是沒有降 解的。例如37或50°C。可以使用任何合適的方法來測定蛋白質降解，例如，如本文所述的。 通過SDS-PAGE或通過功能測試（例如，配體結合）。
[0169] 如在此所用的，"展示系統"指的是其中基於所需特徵（如，物理、化學或功能特 徵）易於選擇的多肽或肽的集合的系統。展示系統可以是合適的多肽或肽的組（例如，在 溶液中，固定在合適的支持物上）。展示系統還可以是使用細胞表達系統（例如，在轉化的、 感染的、轉染的或轉導的細胞中核酸文庫的表達和細胞表面上所編碼多肽的展示）或非細 胞表達系統（例如，乳液區室化和展示）的系統。示例性展示系統與核酸的編碼功能以及 由核酸編碼的多肽或肽的物理、化學和/或功能特徵相關。使用這樣的展示系統時，可以選 擇具有所需物理、化學和/或功能特徵的多肽或肽，並可以容易地分離或回收編碼選定多 肽或肽的核酸。與核酸的編碼功能以及多肽或肽的物理、化學和/或功能特徵相關的各種 展示系統是本領域已知的，例如，細菌噬菌體（bacteriophage)展示（噬菌體展示，例如噬 粒展示）、核糖體展示、乳液區室化和展示、酵母展示、嘌呤黴素展示、細菌展示、在質粒上展 示、共價展示等。（參見，例如，EP 0436597 (Dyax)、U. S.專利 No. 6, 172, 197 (McCafferty 等）、U. S.專利 No. 6, 489, 103 (Griffiths 等））。
[0170] 如在此所用的，"組（repertoire) "指的是特徵在於胺基酸序列多樣性的多肽或肽 的集合。組的單個成員可以具有共同的特徵，如共同的結構特徵（例如，共同的核心結構） 和/或共同的功能特徵（例如，結合共同配體（例如，通用配體或目標配體，TNFR1)的能 力）。
[0171] 如在此所用的，"功能性"描述了具有生物活性的多肽或肽，如特定的結合活性。例 如，術語"功能性多肽"包括通過其抗原-結合位點結合目標抗原的抗體或其抗原-結合 片段。
[0172] 如在此所用的，"通用配體〃指的是結合給定組的絕大部分（例如，基本上全部） 功能性成員的配體。通用配體（例如，共同的通用配體）可以結合給定組的許多成員，即使 成員對於共同的目標配體不具有結合特異性。通常，多肽上功能性通用配體結合位點的存 在（如通過結合通用配體的能力來表明）表明多肽是正確摺疊的和功能性的。通用配體的 合適實例包括超抗原、結合在組的絕大部分功能性成員上表達的表位的抗體等。
[0173] "超抗原"是指在與這些蛋白的目標配體結合位點不同的位點與免疫球蛋白超 家族的成員相互作用的通用配體的術語。葡萄球菌腸毒素是與T-細胞受體相互作用的 超抗原的實例。結合抗體的超抗原包括蛋白G，其結合IgG恆定域（Bjorck和Kronvall, J. Immunol.，133 :969 (1984));蛋白 A，其結合 IgG 恆定域和 Vh 結構域（Forsgren 和 Sjoquist, J. Immunol.，97 :822 (1966));和蛋白 L，其結合 Vl 結構域（Bjorck，J. Immunol.， 140 :1194(1988))。
[0174] 如在此所用的，"目標配體"指的是由多肽或肽特異性或選擇性結合的配體。例如， 多肽是抗體或其抗原-結合片段時，目標配體可以是任何所需的抗原或表位。與目標抗原 的結合取決於功能性的多肽或肽。
[0175] 如在此所用的，抗體指的是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段（如Fab、F(ab'） 2、 Fv、二硫化物連接的scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫化物連接的scFv、diabody)，不管 是源自天然產生抗體的物種，或是通過重組DNA技術形成的；不管是分離自血清、B-細胞、 雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌。
[0176] 如在此所用的，"抗體形式"指的是其中可以引入一個或更多個抗體可變域使得給 予結構上抗原結合特異性的任何合適的多肽結構。各種合適的抗體形式是本領域已知的， 如，嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重 鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結合片段（例如，Fv片段（例 如，單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F (ab'）2片段）、單抗體可變 域（例如，dAb、VH、VHH、')和之前任一項的修飾形式（例如，通過聚乙二醇或其他合適聚合 物或人源化V hh的共價連接修飾的）。
[0177] 短語"免疫球蛋白單可變域"指的是與其他V區或域無關的特異性結合抗原或表 位的抗體可變域（V H、Vffin VJ。免疫球蛋白單可變域可以以帶有其他可變區或可變域的形 式（例如，同型-或雜-多聚體）存在，其中其他區或域對於單免疫球蛋白可變域的抗原結 合不是所需的（即，其中免疫球蛋白單可變域結合抗原與其他可變域無關）。"域抗體"或 "dAb"與在此所用的術語"免疫球蛋白單可變域"相同。"單抗體可變域"或"抗體單可變域" 與在此所用的術語"免疫球蛋白單可變域"相同。在一個實施方案中，免疫球蛋白單可變域 是人抗體可變域，但還包括來自其他物種的單抗體可變域，如齧齒動物（例如，W000/29004 中公開的，在此將其內容作為整體引入作為參考）、護士鯊和Camelid Vhh dAb。Camelid Vhh 是源自包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和原駝的物種的免疫球蛋白單可變域多肽，其產 生天然缺少輕鏈的重鏈抗體。可以將V hh人源化。
[0178] "結構域〃是經過摺疊的蛋白質結構，其具有與蛋白質其餘部分無關的蛋白質三級 結構。通常，結構域負責蛋白質的分離的功能特徵，並且在許多情況下可以添加、去除或轉 移給其他蛋白質，而不喪失該蛋白質和/或該結構域的其餘部分的功能。"單抗體可變域" 是指經過摺疊的多肽域，包含抗體可變域的特徵性序列。因此，其包括完整的抗體可變區和 修飾的可變域，例如，其中一個或更多個環已經由不是抗體可變區特徵性的序列替代，或已 被截斷或包含N-端或C-端延伸的抗體可變域，以及保留全長結構域的至少結合活性和特 異性的可變域的摺疊片段。
[0179] 術語"文庫〃指的是異源多肽或核酸的混合物。文庫由成員組成，每個成員具有 單個多肽或核酸序列。就這點而言，"文庫"和"組〃同義。文庫成員之間的序列差異造成 文庫中存在的多樣性。文庫可以採用多肽或核酸的簡單混合物的形式，或者用核酸文庫轉 化的生物體或細胞的形式，例如細菌、病毒、動物或植物細胞等。在一個實施方案中，各個生 物體或細胞僅含有一個或數目有限的文庫成員。在一個實施方案中，將核酸摻入到表達載 體中，以表達該核酸所編碼的多肽。因此，在一個方面中，文庫可以採用宿主生物體群的形 式，每個生物體含有一個或更多個拷貝的表達載體，所述載體含有核酸形式的文庫的單個 成員，所述核酸可以表達而產生其相應的多肽成員。因此，宿主生物體群具有編碼一大組不 同多肽的潛力。
[0180] "通用框架"是單抗體框架序列，對應於序列中的保守抗體區，如Kabat限定的 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest"（免疫學重要性蛋白的序列）， US Department of Health and Human Services(美國衛生和人類服務部）），或對應於人 種系免疫球蛋白組或結構，如Chothia和Lesk限定的，（1987) J. Mol. Biol. 196 :910-917。 文庫和組可以使用單個框架，或一組這樣的框架，已經發現其允許實質上任何結合特異性 的產生，儘管變化僅在超變區內。
[0181] 如在此所用的，術語"劑量"指的是在一次給藥（單位劑量），或在限定時間間隔 內兩次或更多次給藥時給藥於患者的全部配體量。例如，劑量可以指的是在一天（24小時） (日劑量）、兩天、一周、兩周、三周或一個或更多個月（例如，通過單次給藥，或通過兩次或 更多次給藥）的過程中給藥於患者的配體量（例如，含有結合目標抗原的免疫球蛋白單可 變域的配體）。給藥之間的間隔可以是任何所需的時間量。
[0182] 短語"半衰期"是指配體的血清濃度在體內降至50%所需的時間，例如因為通過 天然機制所致的配體降解和/或清除或螯合。本發明的配體在體內可以是穩定的，其半衰 期因結合抗降解和/或清除或螯合的分子而延長。通常，這類分子是天然存在的蛋白質， 它們本身在體內具有較長的半衰期。如果配體的功能活性在體內的持續時間比對延長半 衰期的分子不具有特異性的類似配體更長的話，則配體半衰期延長。例如，將對人血清白蛋 白（HAS)和靶分子具有特異性的配體，與對HSA無特異性且不結合HSA，而結合別的分子的 相同配體進行比較。例如，它能結合細胞上的第三目標物。通常，半衰期延長lO^JO%、 30 (%、40(%、50(%或更多。半衰期延長範圍在21、31、41、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^或以上是 可能的。或者，或另外，半衰期延長範圍高達30χ、40χ、50χ、60χ、70χ、80χ、90χ、ΙΟΟχ、150x也 是可能的。
[0183] 如在此所用的，"流體動力學大小"指的是基於分子通過水溶液擴散的分子（例如， 蛋白質分子，配體）的表觀大小。將蛋白質通過溶液的擴散或移動進行處理，以得到蛋白質 的表觀大小，其中通過蛋白質顆粒的"Stokes半徑"或"流體動力學半徑"來給出大小。蛋 白質的"流體動力學大小"取決於質量和形狀（構象），使得具有相同分子量的兩個蛋白質 基於蛋白質的整體構象可以具有不同的流體動力學大小。
[0184] 如在此所用的，術語"競爭"意思是第一目標與其同源目標結合域的結合在所述 同源目標特異性的第二結合域的存在下受到抑制。例如，結合可以受到空間抑制，例如，通 過結合域的物理阻斷或通過改變結合域的結構或環境，使其對目標的親和性或親和力降 低。對於怎樣進行競爭ELISA和競爭BiaCore實驗來測定第一和第二結合域之間的競爭的 詳細內容參見W02006038027。
[0185] 如下進行兩個序列之間的"同源性"或"同一性〃或"相似性"（在此可將這些術語 互換使用）的計算。為了優化比較目的，將序列比對（例如，為了比較目的，對於最佳比對， 可以在第一個和第二個胺基酸或核酸序列中引入缺口，並且非同源序列可以忽略不計）。在 一個實施方案中，為了比較目的，所比對的參考序列的長度佔參考序列長度的至少30%，或 至少40 %，或至少50 %，或至少60 %，或至少70 %，80 %，90 %，100 %。然後，將相應胺基酸 位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一序列中的某個位置由與第二序 列相應位置的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，那麼分子在該位置上是相同的（在此所用 的胺基酸或核酸"同源性"等同於胺基酸或核酸"同一性"）。兩個序列之間的同一性百分比 是考慮了缺口數和每個缺口的長度後序列共有的相同位置數的函數，需要引入這些缺口以 進行兩個序列的最佳比對。可以使用BLAST2S eqUenCes算法，使用預設參數，來準備和測定 如在此所限定的胺基酸和核苷酸序列比對和同源性、相似性或同一性（Tatusova，T.A.等， FEMS Microbiol Lett,174 ： 187-188 (1999))〇
[0186] 選擇方法
[0187] 在一個實施方案中，本發明涉及通過選擇蛋白酶抗性肽和多肽的方法選擇的具有 所需生物活性的多肽和dAb。在方法中使用了兩種選擇程序來產生有效的方法，用於選擇對 蛋白酶降解高度穩定和抗性的並具有所需生物活性的多肽。如本文所述的，蛋白酶抗性肽 和多肽通常保持生物活性。相反，在本文所述的方法中，蛋白酶敏感性肽和多肽受到蛋白酶 的分裂或降解，並因此，失去其生物活性。因此，通常基於其生物活性如結合活性來選擇蛋 白酶抗性肽或多肽。
[0188] 本文所述的方法提供了幾個優點。例如，如在此公開的和例舉的，對能抵抗一種蛋 白酶（例如，胰蛋白酶）的蛋白水解降解而選擇的可變域、拮抗劑、肽或多肽也能抵抗其他 蛋白酶（例如，彈性蛋白酶、Ieucozyme)的降解。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與肽或 多肽的較高解鏈溫度（Tm)相關。較高的解鏈溫度表示更穩定的可變域、拮抗劑、肽和多肽。 在一個實施方案中，對蛋白酶降解的抗性還與對目標配體的高親和性結合相關。因此，本文 所述的方法提供了選擇、分離和/或回收具有所需生物活性並且非常適於體內治療和/或 診斷用途（因為這些是蛋白酶抗性和穩定的）的可變域、拮抗劑、肽、多肽的有效途徑。在 一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的PK相關，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、 詰抗劑、膚或多膚。提商的PK可以是提商的AUC(曲線下面積）和/或提商的半哀期。在 一個實施方案中，蛋白酶抗性與可變域、拮抗劑、肽或多肽對剪切力和/或熱應力的提高的 穩定性和/或噴霧過程中降低的聚集傾向相關，例如，提高的超過非蛋白酶抗性的可變域、 拮抗劑、肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶抗性與提高的存儲穩定性相關，例如，提高的 超過非蛋白酶抗性的可變域、拮抗劑、肽或多肽。在一個方面中，提供了一個、兩個、三個、四 個或全部優點，優點是對蛋白酶降解的抗性、較高的Tm和對目標配體的高親和性結合。
[0189] 在一個方面中，提供了從肽和多肽的文庫或組（例如，展示系統）中選擇、分離和 /或回收對蛋白酶（例如，一種或更多種蛋白酶）降解抗性的肽或多肽的方法。在一個實 施方案中，該方法是從肽和多肽的文庫或組（例如，展示系統）中選擇、分離和/或回收對 蛋白酶（例如，一種或更多種蛋白酶）降解抗性的多肽的方法。通常，該方法包括提供肽或 多肽的文庫或組，在適於蛋白酶活性的條件下將文庫或組與蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性 蛋白酶、leucozyme、胰酶、痰液）混合，並選擇、分離和/或回收對蛋白酶降解抗性的並具 有所需生物活性的肽或多肽。由於蛋白酶的活性，蛋白酶降解的肽或多肽通常具有降低的 生物活性或失去其生物活性。因此，可以使用基於生物活性的方法來選擇、分離和/或回收 對蛋白酶降解抗性的肽或多肽，生物活性如結合活性（例如，結合通用配體，結合特異性配 體，結合底物）、催化活性或其他生物活性。
[0190] 在適於蛋白酶的蛋白水解活性的條件下，將肽或多肽的文庫或組與蛋白酶（例 如，一種或更多種蛋白酶）混合。適於蛋白酶的蛋白水解活性的條件以及含有蛋白水解活 性的生物製劑或混合物是本領域公知的，並可以通過本領域普通技術人員容易地測定。如 果需要，例如，可以通過測定一定範圍的PH條件、蛋白酶濃度、溫度下的蛋白酶活性和/或 通過改變文庫或組與蛋白酶反應的時間量來鑑定或優化合適的條件。例如，在一些實施方 案中，蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的比例（以摩爾/摩爾為基礎）為 800至80,00(例如，8, 000至80, 000)蛋白酶：肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時， 比例為800至80, 000蛋白酶：肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為8, 000至 80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例 如，可變域）的比例（以重量/重量為基礎，例如微克/微克）為1，600至160, 000 (例如， 16, 000至160,000)蛋白酶：肽或多肽，例如，使用10微克/ml蛋白酶時，比例為1，600至 160, 000蛋白酶：肽或多肽；或使用100微克/ml蛋白酶時，比例為16, 000至160, 000蛋 白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少100或1000微克/ml濃度的蛋白酶，並且 蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的蛋白酶：肽比例（以摩爾/摩爾為基 礎）為8, 000至80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，使用至少10微克/ml濃 度的蛋白酶，並且蛋白酶例如胰蛋白酶與肽或多肽（例如，可變域）的蛋白酶：肽比例（以 摩爾/摩爾為基礎）為800至80, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，例如，C為 10微克/ml時，蛋白酶（例如，胰蛋白酶）與肽或多肽（例如，可變域）的比例（以重量/ 重量為基礎，例如微克/微克）為1600至160, 000蛋白酶：肽或多肽；或C或C'為100微 克/ml時，比例為16, 000至160, 000蛋白酶：肽或多肽。在一個實施方案中，濃度（c或 c'）為至少100或1000微克/ml蛋白酶。對於測試單個或分離的肽或多肽（例如，免疫球 蛋白可變域），例如，已經從組或文庫中分離出來的，可以將蛋白酶加入合適緩衝液（例如， PBS)中的肽或多肽溶液中，以產生肽或多肽/蛋白酶溶液，如至少約0.01% (w/w)蛋白酶/ 肽或多肽的溶液，約〇. 01 %至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，約0. 05%至約5% (w/w)蛋 白酶/肽或多肽，約〇.1%至約5%(￥/\￥)蛋白酶/肽或多肽，約0.5%至約5%(￥/\￥)蛋白 酶/肽或多肽，約1%至約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.01% (w/w)蛋白酶/肽 或多肽，至少約0.02% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.03% (w/w)蛋白酶/肽或多肽， 至少約0.04% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.05% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約 0. 06% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 07% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 08% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 09% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 1% (w/w)蛋 白酶/肽或多肽，至少約0.2% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.3% (w/w)蛋白酶/肽 或多肽，至少約0.4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至 少約0. 6% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 7% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0. 8% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約0.9% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約1% (w/w)蛋白酶 /肽或多肽，至少約2% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至少約3% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，至 少約4% (w/w)蛋白酶/肽或多肽，或約5% (w/w)蛋白酶/肽或多肽。可以在蛋白酶活性 合適的溫度下（例如，室溫，約37°C)溫育混合物，並以（例如，1小時，2小時，3小時等） 時間間隔取樣。使用任何合適的方法，如SDS-PAGE分析或配體結合，分析樣品的蛋白質降 解，並且結果可以用來建立降解的時間過程。
[0191] 在本文所述的方法中，可以使用任何所需的一種或更多種蛋白酶。例如，可以使用 單種蛋白酶，不同蛋白酶的任何所需組合或含有蛋白水解活性的任何生物製劑、生物提取 物或生物勻漿。所用一種或更多種蛋白酶的特性不必定是已知的。可以單獨或以任何所需 組合來使用的蛋白酶的合適實例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰 基蛋白酶、基質金屬蛋白酶、羧肽酶（例如，羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶、leukozyme、胰酶、凝血酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白 酶（例如，組織蛋白酶G)、蛋白酶（例如，蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜熱菌蛋白酶、凝乳 酶、腸肽酶、胱天蛋白酶（例如，胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、 胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、|丐激活中性蛋白酶、無花果蛋白酶（ficain)、 梭菌蛋白酶、奇異果蛋白酶（actinidain)、菠蘿蛋白酶和分離酶。合適的含有蛋白水解活 性的生物提取物、勻漿和製劑包括痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、支氣管粘液）、支氣管 肺泡灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等。以適於發生蛋白水解降解 的含量使用蛋白酶。例如，如本文所述的，可以使用約〇.〇1 %至約5% (w/w，蛋白酶/肽或 多肽）的蛋白酶。將蛋白酶與包括肽或多肽組的展示系統（例如，噬菌體展示系統）混合 時，例如，可以使用約10 μ g/ml至約3mg/ml濃度的蛋白酶，約10 μ g/ml，約20 μ g/ml，約 30 μ g/ml，約 40 μ g/ml，約 50 μ g/ml，約 60 μ g/ml，約 70 μ g/ml，約 80 μ g/ml，約 90 μ g/ml， 約 100 μ g/ml，約 200 μ g/ml，約 300 μ g/ml，約 400 μ g/ml，約 500 μ g/ml，約 600 μ g/ml，約 700 μ g/ml，約 800 μ g/ml，約 900 μ g/ml，約 1000 μ g/ml，約 I. 5mg/ml，約 2mg/ml，約 2. 5mg/ ml 或約 3mg/ml。
[0192] 在適於蛋白酶活性的溫度下將蛋白酶與肽或多肽的集合（文庫或組）一起溫 育。例如，可以在約20°C至約40°C的溫度下溫育蛋白酶和肽或多肽的集合（例如，在室溫， 約 20°C，約 21°C，約 22°C，約 23°C，約 24°C，約 25°C，約 26°C，約 27°C，約 28°C，約 29°C， 約 30°C，約 31°C，約 32°C，約 33°C，約 34°C，約 35°C，約 36°C，約 37°C，約 38°C，約 39°C，約 40°C)。將蛋白酶和肽或多肽的集合一起溫育一段足以發生蛋白水解降解的時間。例如， 可以將肽或多肽的集合與蛋白酶溫育約30分鐘至約24或約48小時。在一些實施例中，將 肽或多肽的集合與蛋白酶一起溫育過夜，或至少約30分鐘，約1小時，約1. 5小時，約2小 時，約3小時，約4小時，約5小時，約6小時，約7小時，約8小時，約9小時，約10小時，約 11小時，約12小時，約13小時，約14小時，約15小時，約16小時，約17小時，約18小時， 約19小時，約20小時，約21小時，約22小時，約23小時，約24小時，約48小時，或更長時 間。
[0193] 通常理想的是，至少在較早的選擇輪次中（例如，使用展示系統時），與沒有包括 蛋白酶溫育的選擇相比，蛋白酶導致選擇的具有所需生物活性的克隆數量減少至少一個數 量級。在特定的實施例中，方法中所用的蛋白酶含量和條件足以將回收的克隆數量減少至 少一個對數（10倍），至少約2個對數（100倍），至少約3個對數（1000倍）或至少約4個 對數（10, 000倍）。使用常規方法和/或在此提供的指導，可以容易地測定導致所需回收克 隆減少的合適的蛋白酶含量和溫育條件。
[0194] 可以使用任何合適的方法（例如，體外、體內或離體（ex vivo))來混合併溫育蛋 白酶和肽或多肽的集合。例如，可以在合適的容器中將蛋白酶和肽或多肽的集合混合併在 適於蛋白酶活性的溫度下保持靜止、搖晃、振蕩、渦旋等。如果需要，可以在體內或離體（ex vivo)系統中混合蛋白酶和肽或多肽的集合，如通過將多肽的集合（例如，噬菌體展示文庫 或組）引入合適的動物中（例如，小鼠），經過對於蛋白酶活性而言足夠的時間後，回收肽或 多肽的集合。在另一個實施例中，用多肽的集合（例如，噬菌體展示文庫或組）灌注器官 或組織，經過對於蛋白酶活性而言足夠的時間後，回收多肽的集合。
[0195] 溫育後，可以基於所需生物活性如結合活性來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。如果需 要，可以在選擇前加入蛋白酶抑制劑。可以使用基本上不幹擾選擇方法的任何合適的蛋白 酶抑制劑（或兩種或更多種蛋白酶抑制劑的組合物）。合適的蛋白酶抑制劑的實例包括， α 1-抗-胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白、阿嗎他定、抗凝血酶III、抑肽酶、4-(2-氨乙基）苯磺 醯基氟化物氫氯化物（AEBSF)、（4-脒基-苯基）-甲烷-磺醯氟化物（APMSF)、貝他定、苄 脒、抑凝乳蛋白酶素、3,4_二氯異香豆素、二異丙基氟磷酸鹽（DIFP)、E-64、乙二胺四乙酸 (EDTA)、彈性蛋白酶抑制劑（elastatinal)、亮肽素、N-乙基馬來醯亞胺、苯甲基磺醯氟化 物（PMSF)、抑胃肽、1，10-鄰二氮雜菲、膦醯二肽（phosphoramidon)、絲氨酸蛋白酶抑制劑、 N-甲苯磺醯基-L-賴氨酸-氯甲基酮（TLCK)、Na-甲苯磺醯基-Phe-氯甲基酮（TPCK)等。 此外，許多含有幾類蛋白酶抑制劑的製劑是可購得的（例如，Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets?(RocheDiagnostics Corporation ；Indianapolis, IN, USA)，其抑制胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、胰腺提取物和胰蛋白 酶）。
[0196] 可以使用所需的生物活性選擇方法來選擇蛋白酶抗性肽或多肽，這種選擇方法可 以使具有所需生物活性的肽和多肽與不具有所需生物活性的肽和多肽區分開來並進行選 擇。通常，已經受到蛋白酶消化或分裂的肽或多肽失去了它們的生物活性，而蛋白酶抗性肽 或多肽仍然保留功能。因此，對於生物活性合適的測試可以用來選擇蛋白酶抗性肽或多肽。 例如，可以使用合適的結合測試（例如，ELISA、淘選）來測定共同的結合功能（例如，結合 通用配體，結合特異性配體或結合底物）。例如，可以通過淘選或使用合適的親和性基質來 選擇、分離和/或回收結合目標配體或通用配體（如蛋白A、蛋白L或抗體）的多肽。可以 通過將配體（例如,通用配體、目標配體）溶液加入合適的容器（例如,試管、培養皿）中並 使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉並將多肽（例如，噬菌體展 示文庫）加入容器中，並將容器維持在適於多肽結合固定化配體的條件下。將未結合的多 肽洗掉，使用任何合適的方法（如刮下（scraping)或降低pH)來回收結合的多肽。
[0197] 使用噬菌體展示系統時，可以在噬菌體ELISA中測試結合。可以根據任何合適的 程序來進行噬菌體ELISA。在一個實施例中，通過ELISA篩選每一輪選擇產生的噬菌體群 與選定的目標配體或通用配體的結合，以鑑定呈現出蛋白酶抗性肽或多肽的噬菌體。如果 需要，可以測試可溶性肽和多肽與目標配體或通用配體的結合，例如，通過ELISA，例如，使 用對抗C-或N-端標記物的試劑（參見，例如Winter等（1994)，Ann. Rev. Immunology 12， 433-55以及其中引用的參考文獻）。還可以通過PCR產物的凝膠電泳（Marks等，1991，上 文；Nission 等，1994,上文）、探針檢測（Tomlinson 等，1992, J. Mol. Biol. 227, 776)或通過 載體DNA的測序來測定選定噬菌體的多樣性。
[0198] 除了對TNFRl的特異性，含有抗-TNFRl蛋白酶抗性多肽（例如，單抗體可變域） 的拮抗劑或多肽（例如，雙特異性配體）可以具有通用配體或任何所需目標配體的結合特 異性，目標配體如人或動物蛋白，包括細胞因子、生長因子、細胞因子受體、生長因子受體、 酶（例如，蛋白酶）、酶的輔因子、DNA結合蛋白、脂質和碳水化合物。
[0199] 在一些實施方案中，蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)或拮抗劑結合肺組織中的 TNFRl。在一個實施方案中，拮抗劑或多肽還結合肺組織中的其他目標物。
[0200] 在本文所述的方法中使用展示系統時（例如，與核酸的編碼功能和該核酸編碼的 肽或多肽的功能性特徵相關的展示系統），常常能有利地擴增或提高編碼選定肽或多肽的 核酸的拷貝數。這提供了一條獲得足量核酸和/或肽或多肽的有效途徑，以用於更多輪次 的選擇，使用本文所述的方法或其他合適的方法，或用於製備其他的組（例如，親和性突變 組）。因此，在一些實施方案中，該方法包括使用展示系統（例如，與核酸的編碼功能和該核 酸編碼的肽或多肽的功能性特徵相關的展示系統，如噬菌體展示）並進一步包括擴增或提 高編碼選定肽或多肽的核酸的拷貝數。可以使用任何合適的方法來擴增核酸，如通過噬菌 體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應。
[0201] 本文所述的方法可以用作計劃的一部分來分離蛋白酶抗性肽或多肽，例如，dAb， 如果需要，可以包括其他合適的選擇方法。在這些情況中，可以在計劃的任何所需點使用本 文所述的方法，如在使用其他選擇方法之前或之後。本文所述的方法還可以用來提供兩輪 或更多輪的選擇，如本文所述和舉例說明的。
[0202] 在一個實施例中，方法用於選擇能抵抗彈性蛋白酶降解的肽或多肽，例如dAb，包 括提供肽或多肽的文庫或組，在適於彈性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下將文庫或組與彈 性蛋白酶（或含有彈性蛋白酶的生物製劑、提取物或勻漿）混合，並選擇、分離和/或回收 能抵抗彈性蛋白酶降解並具有TNFRl結合活性的肽或多肽。
[0203] 在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解並結合TNFRl的免疫球 蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，並在適於彈 性蛋白酶的蛋白水解消化的條件下與彈性蛋白酶（或含有彈性蛋白酶的生物製劑、提取物 或勻漿）混合。選擇特異性結合TNFRl的彈性蛋白酶抗性dAb。例如，彈性蛋白酶抗性dAb 在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液中在37°C下持續至少約2小時時基本上沒有降解。在一 個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04% (w/w)彈性蛋白酶溶液中在37°C下持續至少 約12小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，彈性蛋白酶抗性dAb在0.04% (w/w)彈 性蛋白酶溶液中在37°C下持續至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒 有降解。
[0204] 在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗彈性蛋白酶降解並結合TNFRl的免疫球蛋 白單可變域（dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多肽含有 免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統與彈性蛋白酶（約1〇〇μ g/ml)混合併將混合物在 約37°C下溫育，例如過夜（例如，約12-16小時），然後選擇呈現出特異性結合TNFRl的dAb 的噬菌體。
[0205] 在一個實施例中，提供了選擇能抵抗Ieucozyme降解的肽或多肽（例如，dAb)的 方法，包括提供肽或多肽的文庫或組，在適於Ieucozyme的蛋白水解消化的條件下將文庫 或組與Ieucozyme (或含有Ieucozyme的生物製劑、提取物或勻楽）混合，並選擇、分離和/ 或回收能抵抗leucozyme降解並具有特異性TNFRl結合活性的肽或多肽。
[0206] 在特定的實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解並結合TNFRl的免疫球 蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了含有dAb的文庫或組，並在適於 leucozyme的蛋白水解消化的條件下與leucozyme (或含有leucozyme的生物製劑、提取物 或勻楽）混合。選擇特異性結合TNFRl的leucozyme抗性dAb。例如，leucozyme抗性dAb 在0. 04% (w/w) leucozyme溶液中在37°C下持續至少約2小時時基本上沒有降解。在一個 實施方案中，leucozyme抗性dAb在0· 04% (w/w) leucozyme溶液中在37°C下持續至少約12 小時時基本上沒有降解。在一個實施方案中，leucozyme抗性dAb在0. 04% (w/w) leucozyme 溶液中在37°C下持續至少約24小時、至少約36小時或至少約48小時時基本上沒有降解。
[0207] 在一個實施方案中，提供了選擇能抵抗leucozyme降解並特異性結合TNFRl的免 疫球蛋白單可變域（dAb)的方法，該方法包括提供含有一組多肽的噬菌體展示系統，該多 肽含有免疫球蛋白單可變域，將噬菌體展示系統與leucozyme(約100μ g/ml)混合併將混 合物在約37°C下溫育，例如過夜（例如，約12-16小時），然後選擇呈現出特異性結合TNFRl 的dAb的噬菌體。
[0208] 在另一個實施例中，提供了用於選擇對胰蛋白酶降解有抗性的肽或多肽（例如 dAb)的方法，其包括提供肽或多肽的文庫或組，在適於胰蛋白酶蛋白水解消化的條件下將 所述文庫或組與胰蛋白酶組合，以及選擇、分離和/或回收對胰蛋白酶降解有抗性且特異 性結合TNFRl的肽或多肽。
[0209] 在特定的實施方案中，提供了選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結合TNFRl的 免疫球蛋白單可變域（dAb)的方法。在這些實施方案中，提供了包含dAb的文庫或組，並將 其與胰蛋白酶（或包含胰蛋白酶的生物製劑、提取物或勻漿液）在適於胰蛋白酶蛋白水解 消化的條件下組合。選擇結合TNFRl的胰蛋白酶抗性dAb。例如，在37°C下在0.04% (w/ w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約2小時的時間段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。 在一個實施方案中，在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶液中溫育至少大約3小時的時間 段時，胰蛋白酶抗性dAb基本上不被降解。在37°C下在0.04% (w/w)胰蛋白酶溶液中溫育 至少大約4小時、至少大約5小時、至少大約6小時、至少大約7小時、至少大約8小時、至 少大約9小時、至少大約10小時、至少大約11小時、或至少大約12小時的時間段時，胰蛋 白酶抗性dAb基本上不被降解。
[0210] 在示範性的實施方案中，提供了用於選擇對胰蛋白酶降解有抗性且特異性結合 TNFRl的免疫球蛋白單可變域（dAb)的方法。該方法包括提供噬菌體展示系統（其包含一 組含有免疫球蛋白單可變域的多肽），將所述噬菌體展示系統與胰蛋白酶（100 μ g/ml)組 合，並在大約37°C下溫育混合物例如過夜（例如大約12-16小時），接著選擇展示特異性結 合TNFRl的dAb的噬菌體。
[0211] 在另一個方面中，提供了一組產生蛋白酶抗性肽或多肽（例如，dAb)的方法。該 方法包括提供一組肽或多肽；在適於蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與蛋白酶混合；並 回收多個特異性結合TNFRl的肽或多肽，由此產生一組蛋白酶抗性肽或多肽。在此對於其 他方法描述了適用於該方法中的蛋白酶、展示系統、用於蛋白酶活性的條件和選擇肽或多 肽的方法。
[0212] 在一些實施方案中，使用了含有一組肽或多肽的展示系統（例如，與核酸的編碼 功能和該核酸編碼的肽或多肽的功能性特徵相關的展示系統），並且該方法進一步包括擴 增或提高編碼多個選定肽或多肽的核酸的拷貝數。可以使用任何合適的方法來擴增核酸， 如通過噬菌體擴增、細胞生長或聚合酶鏈式反應。
[0213] 在特定的實施方案中，提供了產生一組包含抗-TNFR IdAb的蛋白酶抗性多肽的 方法。該方法包括提供一組包含dAb的多肽；在適於蛋白酶活性的條件下將肽或多肽組與 蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme)混合；並回收多個包含具有TNFRl結合 特異性的dAb的多肽。該方法可以用於產生天然組，或偏向所需結合活性的組，如基於具有 TNFRl結合特異性的親本dAb的親和性突變組。
[0214] 多肽展示系統
[0215] 在一個實施方案中，提供用於本文所述方法中的肽或多肽的組或文庫包含合適的 展示系統。該展示系統可以抵抗蛋白酶的降解（例如，單種蛋白酶或蛋白酶的組合，以及含 有蛋白水解活性的任何生物提取物、勻漿或製劑（例如，痰液、粘液（例如，胃粘液、鼻粘液、 支氣管粘液）、支氣管灌洗、肺勻漿、肺提取物、胰腺提取物、胃液、唾液、眼淚等））。在一個 實施方案中，展示系統以及展示系統與所展示肽之間的聯繫至少抵抗蛋白酶能與組中最穩 定的肽或多肽那樣。這使得可以容易地分離和/或擴增編碼選定的展示多肽的核酸。
[0216] 在一個實施例中，可以從溶液中或共價或非共價連接合適表面（如塑料或玻璃 (例如，微滴定平板、多肽陣列，如微陣列））的一組肽或多肽中選擇、分離和/或回收蛋白 酶抗性肽或多肽，例如dAb。例如，可以使用在表面上的肽陣列，其排列方式使每個不同的 文庫成員（例如，獨特的肽序列）處於陣列中分開的、預定的位置。可以通過陣列中的空間 位置來決定該陣列中每個文庫成員的身份。可以測定在目標配體與例如反應性文庫成員之 間發生結合作用的陣列中的位置，因此基於空間位置來鑑定反應性成員的序列。（參見，例 如，U. S.專利 No. 5, 143, 854, W090/15070 和 W092/10092)。
[0217] 在一個實施方案中，該方法使用連接核酸的編碼功能和該核酸編碼的多肽的物 理、化學和/或功能性特徵的展示系統。這樣的展示系統可以包括多個可複製的遺傳包，如 噬菌體或細胞（細菌）。在一個實施方案中，展示系統包括文庫，如細菌噬菌體展示文庫。
[0218] 已經描述了各種合適的細菌噬菌體展示系統（例如，多價展示和多價展示系統）。 (參見，例如，Griffiths等，U.S.專利No. 6, 555, 313B1 (在此引入作為參考）Johnson等， 。5.專利此.5,733,743(在此引入作為參考）以(^3€€6竹7等，。5.專利此.5,969，108(在 此引入作為參考）以1111丨 8&11-1^11〇6，。5.專利此.5,702,892(在此引入作為參考）； Winter, G.等，Annu. Rev. Immunol. 12 :433-455(1994) ； Soumi 11 ion P.等，Appl. Biochem. Biotechnol. 47(2-3) :175-189(1994) ;Castagonoli，L.等，Comb. Chem. High Throughput Screen，4 (2) :121-133(2001))。細菌噬菌體展示系統中展示的肽或多肽可以在任何合適的 細菌噬菌體上展示，如絲狀噬菌體（例如，fd，M 13, F 1)、溶菌噬菌體（例如，T4、T7、λ ) 或RNA噬菌體（例如，MS2)。
[0219] 通常，產生或提供展示一組肽或噬菌體多肽的噬菌體文庫，作為與合適的噬菌體 外殼蛋白（例如，fd pill蛋白）的融合蛋白。融合蛋白可以展不在喔囷體外殼蛋白尖端的 肽或多肽，或如果需要，在內部位置。例如，展示的肽或多肽可以存在於pin結構域1的氨 基端的位置。（pin的結構域1也稱為NI)。展示的肽可以直接與pin融合（例如，pin 結構域1的N-端）或使用連接物與pill融合。如果需要，融合體可以進一步包括標記物 (例如，myc表位、His標記物）。可以使用任何合適的方法來產生包括作為與噬菌體外殼蛋 白的融合蛋白展示的一組肽或多肽的文庫，如通過將編碼展示的肽或多肽的噬菌體載體或 噬粒載體的文庫引入合適的宿主細胞中，並培養所得到的細菌來產生噬菌體（例如，如果 需要，使用合適的輔助噬菌體或補充質粒）。可以使用任何合適的方法從培養物中回收噬菌 體文庫，如沉澱和離心。
[0220] 展示系統可以包含一組含有任何所需量多樣性的肽或多肽。例如，組可以含有具 有對應於由生物體、一組生物體（例如，一組分離自Camelid的V hh dAb的序列）、所需組織 或所需細胞類型表達的天然產生多肽的胺基酸序列的肽或多肽，或可以含有具有隨機或隨 機化胺基酸序列的肽或多肽。如果需要，多肽可以共有共同的核心或支架。該組或文庫中 的多肽可以包含隨機或隨機化胺基酸序列的限定片段或共同的胺基酸序列的片段。在特定 的實施方案中，組中所有或基本上所有的多肽是所需類型的，如所需的酶（例如，聚合酶） 或所需的抗體的抗原結合片段（例如，人V h或人')。在實施方案中，多肽展示系統包含一 組多肽，其中每個多肽包含抗體可變域。例如，組中的每個多肽可以含有V H、'或Fv (例如， 單鏈Fv)。
[0221] 可以使用任何合適的方法將胺基酸序列多樣性引入任何所需的肽或多肽或支架 的片段中。例如，可以通過使用任何合適的誘變方法（例如，低保真度PCR、寡核苷酸-介導 的或定向突變、使用NNK密碼子的多樣化）或任何其他合適的方法製備編碼多樣化多肽的 核酸，將胺基酸序列多樣性引入目標片段中，如抗體可變域的互補性決定區或疏水性結構 域。如果需要，可以將待多樣化的多肽片段隨機化。
[0222] 構成組的多肽的大小很大程度上是選擇的問題，並且不需要統一的多肽大小。在 一個實施方案中，組中的多肽至少具有三級結構（形成至少一個結構域）。
[0223] 選擇/分離/回收
[0224] 可以使用任何合適的方法從組或文庫（例如，在展示系統中）中選擇、分離和/或 回收蛋白酶抗性肽或多肽（例如，一群蛋白酶抗性多肽）。在一個實施方案中，基於可選擇 的特徵（例如，物理特徵、化學特徵、功能性特徵）來選擇或分離蛋白酶抗性多肽。合適的可 選擇的功能性特徵包括組中肽或多肽的生物活性，例如，結合通用配體（例如，超抗原）、結 合目標配體（例如，抗原、表位、底物）、結合抗體（例如，通過肽或多肽上表達的表位）或催 化活性。（參見，例如，Tomlinson 等，W099/20749 ;W001/57065 ;W099/58655)。在一個實施 方案中，選擇是基於與TNFRl的特異性選擇。在另一個實施方案中，選擇是基於能產生其 中成員是蛋白酶抗性的第二組的選定功能性特徵，接著從第二組中選擇特異性結合TNFRl 的成員。
[0225] 在一些實施方案中，從其中基本上所有蛋白酶抗性肽或多肽共有共同的可選擇特 徵的文庫或組中選擇和/或分離蛋白酶抗性肽或多肽。例如，可以從其中基本上所有蛋白 酶抗性肽或多肽結合共同的通用配體、結合共同的目標配體、結合共同的抗體（或由其結 合）或具有共同的催化活性的文庫或組中選擇蛋白酶抗性肽或多肽。這種類型的選擇對於 基於具有所需生物活性的親本肽或多肽來製備一組蛋白酶抗性肽或多肽特別有用，例如， 進行免疫球蛋白單可變域的親和性突變時。
[0226] 基於結合共同的通用配體的選擇可以產生含有為原始庫或組成分的全部或基本 上全部蛋白酶抗性肽或多肽的肽或多肽的集合或群體。例如，可以通過淘選或使用合適的 親和性基質來選擇、分離和/或回收結合目標配體或通用配體（如，蛋白A、蛋白L或抗體） 的肽或多肽。可以通過將配體（例如，通用配體、目標配體）溶液加入合適的容器中（例如， 試管、培養皿）並使配體沉積或覆蓋在容器壁上來完成淘選。將過量的配體洗掉並將肽或 多肽（例如，已經用蛋白酶溫育過的組）加入容器中，並將容器維持在適於肽或多肽結合固 定化配體的條件下。將未結合的肽或多肽洗掉，使用任何合適的方法（如刮下（scraping) 或降低pH)來回收結合的肽或多肽。
[0227] 合適的配體親和性基質通常含有固體支持物或珠子（例如，瓊脂糖），配體與其共 價或非共價連接。可以使用分批方法、柱方法或任何其他合適的方法，在適於肽或多肽與基 質上的配體結合的條件下，將親和性基質與肽或多肽（例如，已經用蛋白酶溫育過的組）混 合。可以將沒有結合親和性基質的肽或多肽洗掉，並使用任何合適的方法將結合的肽或多 肽洗脫並回收，例如用較低PH的緩衝液、用溫和的去汙劑（例如，脲）或競爭與配體結合的 肽來洗脫。在一個實施例中，在適於組中的肽或多肽結合目標配體（TNFRl)的條件下，將生 物素化的目標配體與組混合。使用固定化的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素（例如， 在珠子上）來回收結合的肽或多肽，
[0228] 在一些實施方案中，通用配體是抗體或其表位。結合文庫或組的肽或多肽中基本 上保守的肽或多肽的結構特徵的抗體或抗原結合片段作為通用配體是特別有用的。對於 分離、選擇和/或回收蛋白酶抗性肽或多肽而適宜用作配體的抗體和抗原結合片段可以是 單克隆或多克隆的，並可以使用任何合適的方法來製備。
[0229] 文庫/組
[0230] 在其他方面中，提供了蛋白酶抗性肽和多肽的組、編碼蛋白酶抗性肽和多肽的文 庫以及產生該文庫和組的方法。
[0231] 可以使用任何合適的方法製備或獲得編碼和/或含有蛋白酶抗性肽和多肽的文 庫。可以基於目標肽或多肽（例如，選自文庫的抗-TNFRl肽或多肽）將文庫設計來編碼蛋 白酶抗性肽或多肽，或可以使用本文所述的方法選自另一個文庫。例如，可以使用合適的多 肽展示系統來製備富含蛋白酶抗性多肽的文庫。
[0232] 在一個實施例中，如本文所述的，在適於蛋白酶活性的條件下，將含有一組展示多 肽的噬菌體展示文庫與蛋白酶混合，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域（例如，VH、Vk、 νλ)。基於所需的生物活性，如結合活性（例如，結合通用配體，結合目標配體），來回收蛋 白酶抗性多肽，由此產生富含蛋白酶抗性多肽的噬菌體展示文庫。在一個實施方案中，回 收是基於結合通用配體，以產生富集文庫，接著基於與TNFRl的特異性結合來選擇文庫的 抗-TNFRl成員。
[0233] 在另一個實施例中，首先篩選包含一組展示肽的噬菌體文庫來鑑定對所需目標抗 原（例如，TNFR1)具有結合特異性的組成員，該展示多肽含有免疫球蛋白單可變域（例如， VH、Vk、V λ)。回收具有所需結合特異性的多肽集合，並如本文所述的，在適於蛋白水解活性 的條件下，將集合與蛋白酶混合。回收具有所需目標結合特異性的蛋白酶抗性多肽的集合， 產生富含蛋白酶抗性和高親和性多肽的文庫。如本文所述的，在一個實施方案中，該選擇方 法中的蛋白酶抗性與高親和性結合相關。
[0234] 可以使用任何合適的方法容易地產生編碼所需類型多肽組的文庫。例如，可以獲 得編碼所需類型多肽（例如，聚合酶、免疫球蛋白可變域）的核酸序列，並可以製備每個含 有一個或更多個突變的核酸的集合，例如通過使用易出錯聚合酶鏈式反應（PCR)系統來擴 增核酸，通過化學誘變（Deng等，J. Biol. Chem. 269:9533(1994))或使用細菌突變體菌株 (Low 等，J. Mol. Biol.，260 :359 (1996))。
[0235] 在其他實施方案中，為了多樣化，可以靶向核酸的特定片段。突變選定位置的方 法也是本領域公知的，並包括，例如，使用錯配的寡核苷酸或簡併的寡核苷酸，使用或不使 用PCR。例如，已經通過將突變靶向抗原結合環形成了合成的抗體文庫。已經將隨機或半 隨機抗體H3和L3片段添加至種系免疫球蛋白V基因片段，以產生具有未突變框架片段的 大文庫（Hoogenboom 和 Winter (1992)上文；Nissim 等（1994)上文；Griffiths 等（1994) 上文；DeKruif等（1995)上文）。將這樣的多樣化延伸來包括一些或全部其他抗原結合環 (Crameri 等（1996)Nature Med. 2 : 100 ;Riechmann 等（1995)Bio/Technology，13:475; Morphosys，W097/08320,上文）。在其他實施方案中，對於多樣化，可以靶向核酸的特定片 段，例如，通過兩步PCR策略，使用第一 PCR的產物作為"mega-引物"。（參見，例如，Landt， 0.等，Gene 96:125-128(1990))。例如，還可以通過SOE PCR來完成靶向多樣化。（參見， 例如，Horton，R.M.等，Gene 77:61-68(1989))。
[0236] 可以通過改變編碼序列來獲得選定位置的序列多樣性，編碼序列限定了多肽的序 列，使得可以在該位置引入各種可能的胺基酸（例如，全部的20個或其子集）。使用IUPAC 命名，最通用的密碼子是NNK，其編碼所有胺基酸以及TAG終止密碼子。可以使用NNK密碼 子，以引入所需的多樣性。實現相同目的的其他密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，其導 致其他終止密碼子TGA和TAA的產生。這樣的靶向方法使得可以在目標區域中開發所有的 序列空間。
[0237] 文庫可以包含具有已知主鏈構象的蛋白酶抗性抗體多肽。（參見，例如，Tomlinson 等，TO99/20749)。
[0238] 可以在合適的質粒或載體中製備文庫。如在此所用的，載體指的是用於將異源DNA 引入用於表達和/或其複製的細胞中的離散序列。可以使用任何合適的載體，包括質粒（例 如，細菌質粒）、病毒或細菌噬菌體載體、人造染色體和游離基因載體。這樣的載體可以用於 簡單克隆和誘變，或表達載體可以用於驅動文庫的表達。載體和質粒通常含有一個或更多 個克隆位點（例如，多連接物）、複製起點和至少一個可選擇的標記基因。表達載體可以進 一步含有用於驅動多肽轉錄和翻譯的元件，如增強子元件、啟動子、轉錄終止細胞、信號序 列等。可以以可操作地連接克隆的編碼多肽的插入片段的方式來安置這些元件，使得在適 於表達的條件下（例如，在合適的宿主細胞中）維持該表達載體時，表達和產生多肽。
[0239] 克隆和表達載體通常含有能夠使載體在一個或更多個選定的宿主細胞中複製的 核酸序列。通常，在克隆載體中，該序列能夠使載體獨立於宿主染色體DNA而複製，並包括 複製起點或自主複製序列。對於各種細菌、酵母和病毒，這樣的序列是公知的。來自質粒 PBR322的複製起點適用於大部分革蘭氏陰性細菌，2微米質粒來源適用於酵母，而各種病 毒來源（例如，SV40,腺病毒）適用於在哺乳動物細胞中克隆載體。通常，對於哺乳動物表達 載體是不需要複製起點的，除非將這些用於能夠複製高水平DNA的哺乳動物細胞中，如COS 細胞。
[0240] 克隆或表達載體可以含有也稱為選擇標記的選擇基因。這樣的標記基因編碼在選 擇性培養基中生長的轉化宿主細胞的存活或生長需要的蛋白質。因此，沒有用含有選擇基 因的載體轉化的宿主細胞在培養基中將不會存活。通常的選擇基因編碼給予抗生素和其他 毒素（例如，氨苄青黴素、新黴素、氨甲喋呤或四環素）抗性、補充營養缺陷不足或提供生長 培養基中不可獲得的關鍵營養素的蛋白質。
[0241] 合適的表達載體可以含有各種成分，例如，複製起點、可選擇標記基因、一種或更 多種表達控制元件，如轉錄控制元件（例如，啟動子、增強子、終止子）和/或一種或更多種 翻譯信號、信號序列或前導序列等。表達控制元件和信號或前導序列如果存在，可以通過載 體或其他來源來提供。例如，克隆的編碼抗體鏈的核酸的轉錄和/或翻譯控制序列可以用 來指導表達。
[0242] 可以提供啟動子用於所需宿主細胞中的表達。啟動子可以是組成型或誘導型的。 例如，啟動子可以可操作地連接編碼抗體、抗體鏈或其一部分的核酸，使得其指導核酸的轉 錄。用於原核宿主（例如，用於大腸桿菌的內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色 氨酸（trp)啟動子系統、lac、tac、T3、T7啟動子）和真核宿主（例如，猿病毒40早期或晚 期啟動子、勞斯肉瘤病毒長終止重複啟動子、巨細胞病毒啟動子、腺病毒晚期啟動子、EG-Ia 啟動子）的各種合適的啟動子是可獲得的。
[0243] 此外，表達載體通常含有用於選擇攜帶載體的宿主細胞的選擇標記，並且在可復 制表達載體的情況中，還含有複製起點。編碼給予抗生素或藥物抗性的產物的基因是常用 的選擇標記，並可以用於原核細胞（例如，β_內醯胺酶基因（氨苄青黴素抗性）、用於四 環素抗性的Tet基因）和真核細胞（例如，新黴素（G418或geneticin)、gpt (黴酚酸）、氨 苄青黴素或潮黴素抗性基因）。二氫葉酸還原酶標記基因使得可以用氨甲喋呤在各種細胞 中選擇。編碼宿主營養缺陷標記的基因產物的基因（例如，LEU2、URA3、HIS3)通常用作酵 母中的選擇標記。還考慮了使用病毒（例如，杆狀病毒）或噬菌體載體和能夠整合至宿主 細胞基因組的載體，如逆轉錄病毒載體。
[0244] 用於在原核細胞（例如，細菌細胞，如大腸桿菌）或哺乳動物細胞中表達的合適表 達載體包括，例如，PET 載體（例如，pET-12a、pET-36、pET-37、pET-39、pET-40，Novagen 等）、 噬菌體載體（例如，pCANTAB5E，Pharmacia)、pRIT2T(蛋白 A 融合載體，Pharmacia)、pCDM8、 pCDNAl. 1/amp、pcDNA3. 1、pRc/RSV、pEF-1 (Invitrogen，Carlsbad，CA)、pCMV-SCRIPT、 pFB、pSG5、pXTl (Stratagene, La Jolla, CA)、pCDEF3 (Goldman, L. A.等，Biotechniques, 21 :1013-1015 (1996))、pSVSP0RT(GibcoBRL，Rockville，MD)、pEF-Bos (Mizushima，S.等， Nucleic Acids Res.，18 :5322(1990))等。適用於各種表達宿主如原核細胞（大腸桿菌）、 昆蟲細胞（果蠅Schnideer S2細胞，Sf9)、酵母（P. methanolica、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵 母（S. cerevisiae))和哺乳動物細胞（例如，COS細胞）中的表達載體是可獲得的。
[0245] 載體的實例是能夠表達對應於多肽文庫成員的核苷酸序列的表達載體。因此，可 以通過分開的繁殖和表達多肽文庫成員的單克隆的表達來進行使用通用配體和/或目標 配體的選擇。如以上所述的，選擇展示系統可以是細菌噬菌體展示。因此，可以使用噬菌體 或噬粒載體。實例載體是具有大腸桿菌複製起點（用於雙鏈複製）以及噬菌體複製起點 (用於生產單鏈DNA)的噬粒載體。這些載體的操縱和表達是本領域公知的（Hoogenboom 和Winter (1992)上文；Nissim等（1994)上文）。簡而言之，載體可以含有給予噬粒上選擇 性的β-內醯胺酶基因和表達盒的Iac啟動子上遊，該表達盒含有合適前導序列、多克隆位 點、一個或更多個肽標記物、一個或更多個TAG終止密碼子和噬菌體蛋白pill。因此，使用 各種抑制劑和大腸桿菌的非抑制劑菌株並添加葡萄糖、異丙基硫-β -D-半乳糖苷（IPTG) 或輔助噬菌體如VCS Μ13,載體能夠作為沒有表達的質粒複製，只產生大量多肽文庫成員或 產物噬菌體，其中一些在其表面上含有多肽-PlII融合體的至少一個拷貝。
[0246] 本文所述的文庫和組可以含有抗體形式。例如，文庫和組內包含的多肽可以是完 整的分開的V h或 '結構域，其中任一個是修飾的或未修飾的。可以使用任何合適的方法， 容易地產生scFv片段，以及其他抗體多肽。各種合適的抗體工程化方法是本領域公知的。 例如，可以通過將編碼兩個可變域的核酸連接合適的編碼合適的連接肽的寡核苷酸來形 成scFv,連接肽如（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3或其他合適的連接肽。連接物橋接第一 V區 的C-端和第二V區的N-端。可以使用相似的技術，用於構建其他抗體形式，如Fv、Fab和 F (ab) 2片段。為了使Fab和F (ab) 2格式化，可以將Vh和\多肽與恆定域片段混合，恆定域 片段分離自重排基因、種系C基因或從抗體序列庫合成的。本文所述的文庫或組可以使V h 或'，文庫或組。
[0247] 包含蛋白酶抗性可變域的多肽可以含有目標配體（例如，TNFR1)結合位點和通用 配體結合位點。在特定的實施方案中，通用配體結合位點是用於超抗原（如蛋白A、蛋白L 或蛋白G)的結合位點。可變域可以基於任何所需的可變域，例如，人VH(例如，VHla、VHlb、 ￥ 112、￥113、￥114、￥115、￥116)、人￥入（例如，￥入1、￥入11、￥入111、￥入1￥、￥入￥、￥入￥1或￥1〇)或 人 Vk (例如，Vk 2, Vk 3, Vk 4, Vk 5, Vk 6, Vk 7, Vk 8, Vk 9 或 Vk 10)或 Camelid VHH，任 選已經人源化。
[0248] 核酸、宿主細胞和生產蛋白酶抗性多肽的方法
[0249] 本發明涉及分離的和/或重組的編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸，例如，通過本 文所述的方法可選擇或已選擇的肽或多肽。
[0250] 在此稱為"分離的"核酸是已經與原始環境（例如，在細胞或在核酸混合物如文庫 中）中的其他物質（例如，其他核酸，如基因組DNA、cDNA和/或RNA)分開的核酸。分離的 核酸可以作為載體（例如，質粒）的一部分來分離。
[0251] 在此稱為"重組的"核酸是通過重組DNA方法產生的核酸，重組DNA方法包括依賴 於人工重組的方法，如克隆至載體或染色體中，例如，使用限制酶、同源重組、病毒等，以及 使用聚合酶鏈式反應（PCR)製備的核酸。
[0252] 本發明還涉及重組宿主細胞，其包括（一個或更多個）重組核酸或含有編碼蛋白 酶抗性肽或多肽的核酸的表達構建體，例如，通過本文所述的方法可選擇的或已選擇的肽 或多肽。還提供了製備蛋白酶抗性肽或多肽的方法，其包括在適於蛋白酶抗性肽或多肽表 達的條件下，維持本發明的宿主細胞。如果需要，該方法可以進一步包括分離或回收蛋白酶 抗性肽或多肽的步驟。
[0253] 例如，可以使用任何適於選定宿主細胞的方法（例如，轉化、轉染、電穿孔、感染）， 將編碼蛋白酶抗性肽或多肽的核酸分子（例如，一個或更多個核酸分子），或含有該核酸分 子的表達構建體（一個或更多個構建體）引入合適的宿主細胞中，以形成重組宿主細胞，使 得核酸分子可操作地連接一個或更多個表達控制元件（例如，在載體中、在通過細胞中的 加工形成的構建體中、整合至宿主細胞基因組）。在適於表達的條件下（例如，在誘導劑的 存在下、在合適的動物中、在補充了適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充劑的合適培養基中 等），維持所得到的重組宿主細胞，由此產生編碼的肽或多肽。如果需要，可以分離或回收編 碼的肽或多肽（例如，從動物、宿主細胞、培養基、乳）。該方法包括在轉基因動物的宿主細 胞中的表達（參見，例如，W092/03918, GenPharm International)。
[0254] 還可以在合適的體外表達系統中，通過化學合成或通過任何其他合適的方法，來 產生通過本文所述的方法選擇的蛋白酶抗性肽或多肽。因此，本發明提供了蛋白酶抗性肽 和多肽。
[0255] 多肽、dAb&拮抗劑
[0256] 如本文所述和舉例說明的，本發明的蛋白酶抗性dAb通常以高親和性結合它們的 目標配體。因此，在另一個方面中，提供了選擇、分離和/或回收本發明的以高親和性結合 TNFRl的多肽或dAb。通常，該方法包括提供肽或多肽（例如，dAb)的文庫或組，在適於蛋 白酶活性的條件下，將文庫或組與蛋白酶（例如，胰蛋白酶、彈性蛋白酶、leucozyme、胰酶、 痰液）混合，並選擇、分離和/或回收結合配體（例如，目標配體）的肽或多肽。因為已經 在蛋白酶敏感性肽或多肽將得到消化的條件下將文庫或組暴露於蛋白酶，因此蛋白酶的活 性可以消除具有低結合親和性的不太穩定的多肽，並因此產生高親和性結合肽或多肽的集 合。
[0257] 例如，本發明的多肽或dAb可以以1 μ m或更強，或大約500nM?0. 5pM的親和性 (KD ;KD = Ukd)/Km(ka)，如通過表面等離子共振所測定的）來結合TNFR1。例如，本發明 的多肽或dAb能夠以大約500nM、大約ΙΟΟηΜ、大約10nM、大約InM、大約500pM、大約ΙΟΟρΜ、 大約10pM、大約IpM或大約0· 5pM的親和力結合TNFR1。
[0258] 儘管我們沒有受到任何特定理論的束縛，認為能抵抗蛋白酶的肽或多肽具有較低 的熵和/或較高的穩定能量。因此，蛋白酶抗性與高親和性結合之間的關聯可能與通過本 文所述的方法選擇的肽和多肽和dAb表面的緊密性和穩定性相關。
[0259] 在一個實施方案中，本發明的多肽、dAb或拮抗劑抑制TNFa與TNFa受體I (P55 受體）的結合，其具有為大約500nM?50pM，或IOOnM?50pM，或IOnM?100pM，或InM? IOOpM ;例如50nM或更小，或5nM或更小，或500pM或更小，或200pM或更小，或IOOpM或更 小的抑制濃度50(IC50)。
[0260] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，並 與人TNFRl分離，具有300nM至IpM的解離常數（K d)，或300nM至5pM，或50nM至ΙρΜ，或 50nM至5pM，或50nM至20pM，或約IOpM,或約15pM，或約20pM，如通過表面等離子共振所 測定的。在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1，並 與人 TNFRl 分離，具有 5χ1〇? ?IxKT7S-1 或 lxKT3s+lxl(T7s-1 或 IxKT4S-1 ?ΙχΚΓΥ1 或 ΙχΙΟ--IxKT7S4或ΙχΙΟΛΓ1或ΙχΚΓΥ1的1(。"速度常數，如通過表面等離子共振所測定 的。
[0261] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFR1，例如人TNFR1， 具有 1χ1(Γ3Μ? 至 1χ1(Γ7Μ? 的 Km，或 1χ1(Γ3Μ? 至 1χ1(Γ6Μ?，或約 1χ1(Γ4Μ? 或約 IxKr5M4s'在一個實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFRl，例如人TNFRl，並 與人TNFRl分離，具有在該段落中限定的解離常數（K d)和Ktjff。在一個實施方案中，多肽、 dAb或拮抗劑特異性地結合TNFRl，例如人TNFRl，並與人TNFRl分離，具有該段落中限定的 解離常數（Kd)和K m。在一些實施方案中，多肽或dAb特異性地結合TNFRl (例如人TNFR1)， 具有該段落中引用的Kd和/或1(。"和/或Km，並包括與DOM lh-131-206的胺基酸序列（顯 示於圖 3 中）為至少或至少約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98 %或99 %同一性的胺基酸序列。
[0262] 可以在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達多肽、dAb或拮 抗劑。在一個實施方案中，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如，巴斯德畢赤酵母）中表達時， 以至少約0. 5mg/L的量來分泌配體或dAb單體。儘管，在大腸桿菌或畢赤酵母屬種（例如， 巴斯德畢赤酵母）中表達時，本文所述的配體和dAb單體是可分泌的，可以使用任何合適的 方法來生產，如合成的化學方法或沒有使用大腸桿菌或畢赤酵母屬種的生物生產方法。
[0263] 在一些實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑不含有Camelid免疫球蛋白可變域，或一 個或更多個框架胺基酸，這些胺基酸對於由Camelid種系抗體基因片段編碼的免疫球蛋白 可變域是獨特的，例如，在位置108、37、44、45和/或47。
[0264] 根據本發明的TNFRl的拮抗劑可以是單價的或多價的。在一些實施方案中，拮抗 劑是單價的並含有一個與TNFRl相互作用的結合位點，該結合位點是由本發明的多肽或 dAb提供的。單價拮抗劑結合一個TNFRl並可以不誘導導致受體和信號轉導激活的細胞表 面上的TNFRl的交聯或聚集。
[0265] 在其他實施方案中，TNFRl的拮抗劑是多價的。TNFRl的多價拮抗劑可以含有兩個 或更多個用於TNFRl的特定結合位點的拷貝或含有兩個或更多個結合TNFRl的不同結合位 點，至少一個結合位點是由本發明的多肽或dAb提供的。例如，如本文所述的，TNFRl的拮 抗劑可以是二聚體、三聚體或多聚體，其含有兩個或更多個本發明的結合TNFRl的特定多 肽或dAb的拷貝，或兩個或更多個本發明的結合TNFRl的不同多肽或dAb。在一個實施方案 中，TNFRl的多價拮抗劑在標準的細胞測試中基本上不激動TNFRl (作為TNFRl的激動劑） (艮P，當以 ΙηΜ，ΙΟηΜ，ΙΟΟηΜ，1 μ M，10 μ M，100 μ M，1000 μ M 或 5, 000 μ M 的濃度存在時，在測 試中達到了不超過大約5%的TNFa (l〇〇Pg/ml)誘導的TNFRl-介導的活性）。
[0266] 在特定的實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑含有兩個或更多個用於TNFRl所需的 表位或結構域的結合位點。例如，TNFRl的多價拮抗劑能夠包含兩個或者更多個結合位點， 其結合TNFRl的結構域1中的相同的表位。
[0267] 在其他一些實施方案中，TNFRl的多價拮抗劑含有由本發明的多肽或dAb提供的 兩個或更多個結合位點，其結合TNFRl的不同表位或結構域。在一個實施方案中，這些多價 拮抗劑在如W02006038027所描述的標準L929細胞毒性測試或標準HeLa IL-8測試中以大 約Inm或大約IOnM或大約IOOnM或大約1 μ M或大約10 μ M的濃度存在時不會激動TNFRl。
[0268] TNFRl的其他拮抗劑不會抑制TNF α與TNFRl的結合。這些配體（和拮抗劑）可以 具有作為診斷劑的實用性，因為它們可以用於結合併檢測、定量或測量樣品中的TNFR1，並 且不會與樣品中的TNF競爭與TNFRl的結合。因此，可以準確地測定樣品中是否存在TNFRl 或存在多少TNFRl。
[0269] 在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑特異性地結合TNFRl，具有本文所述的KD， 並抑制了標準小鼠 LPS/D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的致死率（例如，與合適對 照相比，防止致死性或降低了至少約10 %的致死率）。在一個實施方案中，以約5mg/kg或 更多，例如，約lmg/kg給藥時，與標準小鼠 LPS/D-半乳糖胺誘導的敗血病性休克模型中的 合適對照相比，多肽、dAb或拮抗劑抑制至少約10%或至少約25%或至少約50%的致死率。
[0270] 在其他實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑結合TNFRl並在標準細胞測試中拮抗 TNFRl介導的活性，具有彡IOOnM的ND5tl，並且以< 10 μ M的濃度，dAb在測試中激動< 5% 的TNFRl的活性。
[0271] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標準細胞測試中基本上不激動 TNFRl (作為 TNFRl 的激動劑）（（SP，當以 1ηΜ，10ηΜ，100ηΜ，1μΜ，10μΜ，100μΜ，1000μΜ 或5,000μΜ的濃度存在時，在測試中達到了不超過大約5%的TNFa (l〇〇Pg/ml)誘導的 TNFRl-介導的活性）。
[0272] 在特定的實施方案中，給予有效量時，本發明的多肽、dAb或拮抗劑在慢性炎症疾 病模型中是有效的。通常，有效量為約lmg/kg至約10mg/kg(例如，約lmg/kg,約2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg，約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約 10mg/kg)。 本領域技術人員認為慢性炎症的模型（參見W02006038027中所描述的）預示著在人體中 的治療功效。
[0273] 在特定的實施方案中，多肽、dAb或拮抗劑在標準小鼠膠原誘導的關節炎模型中是 有效的（關於該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑 能夠降低在標準小鼠膠原誘導關節炎模型中四肢總和的平均關節炎評分，例如與適當的對 照相比，降低大約1?大約16,大約3?大約16,大約6?大約16,大約9?大約16,或大 約12?大約16。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標準小鼠膠原 誘導的關節炎模型中延遲關節炎症狀的開始，例如與適當的對照相比，延遲大約1天，大約 2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天 或大約28天。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在標準小鼠膠原誘 導的關節炎模型中得到〇?大約3,大約3?大約5,大約5?大約7,大約7?大約15,大 約9?大約15,大約10?大約15,大約12?大約15,或大約14?大約15的四肢總和的關 節炎評分。
[0274] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠關節炎Λ ARE模型中是有效的（關 於該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小 鼠關節炎AARE模型中降低平均關節炎評分，例如與適當的對照相比降低大約0. 1?大約 2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大約2?大約2. 5。在 另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關節炎△ ARE模型中延遲關節 炎症狀的開始，例如與與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大 約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一個例 子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠關節炎AARE模型中得到0?大約0. 5， 大約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平均關節 炎評分。
[0275] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠炎性腸病（IBD) AARE模型中是有 效的（關於該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能 夠在小鼠 IBD Λ ARE模型中降低急性和/或慢性炎症評分，例如與適當的對照相比降低大約 0. 1?大約2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大約2? 大約2. 5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD AARE模型中 延遲IBD症狀的開始，例如，與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大約4 天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在另一 個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑在小鼠 IBD AARE模型中得到0?大約0. 5,大 約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平均急性和 /或慢性炎症評分。
[0276] 在其他實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠葡聚糖硫酸鈉（DSS)誘導的炎性腸 病模型中是有效的（關於該模型的細節參見W02006038027)。例如，給藥有效量的多肽、dAb 或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS模型中降低平均嚴重程度評分，例如與適當的對照相比降 低大約0. 1?大約2. 5,大約0. 5?大約2. 5,大約1?大約2. 5,大約1. 5?大約2. 5,或大 約2?大約2. 5。在另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS 模型中延遲IBD症狀的開始，例如與適當的對照相比延遲大約1天，大約2天，大約3天，大 約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約10天，大約14天，大約21天或大約28天。在 另一個例子中，給藥有效量的多肽、dAb或拮抗劑能夠在小鼠 IBD的DSS模型中得到0?大 約0. 5,大約0. 5?大約1，大約1?大約1. 5,大約1. 5?大約2,或大約2?大約2. 5的平 均嚴重程度評分。
[0277] 在特定的實施方案中，多肽，dAb或拮抗劑在小鼠菸草煙霧慢性梗阻性肺病模型 (COPD)中是有效的（關於該模型的細節，參見W02006038027和W02007049017)。例如，與 適當的對照相比，給藥有效量的配體能夠降低COPD症狀或延遲COPD症狀的開始。
[0278] 可以獲得一些動物模型系統，其能夠用於篩選TNFRl的拮抗劑（例如其配體、抗體 或結合蛋白）在保護抵抗或治療疾病中的效率。用於在易感性小鼠中測試系統性紅斑狼瘡 (SLE)的方法是本領域中已知的（Knight et al. (1978) J. Exp. Med.，147 :1653 ;Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299:515)。在 SJL/J 雌性小鼠中測試重症肌無力（MG), 其通過利用來自另一物種的可溶性AchR蛋白誘導該疾病（Lindstrom et al.(1988)Adv. Immunol.，42 :233)。關節炎是在小鼠的易感株中通過注射II型膠原而誘導的（Stuart et al. (1984)Ann. Rev. Immunol.，42 :233)。在易感大鼠中通過注射分枝桿菌熱休克蛋白而誘 導佐劑關節炎的模型已經被描述（Van Eden et al.(1988)Nature，331:171)。甲狀腺炎 是在小鼠中根據所描述的通過給藥甲狀腺球蛋白而誘導的（Maron et al. (1980)J.Exp. Med. ,152:1115)。胰島素依賴性糖尿病（IDDM)是自然出現的，或者可以在某些小鼠株中 根據Kanasawa et al. (1984)Diabetologia，27 :113.所描述的那些進行誘導。在小鼠和大 鼠中EAE作為人中MS的模型。在該模型中，去髓鞘疾病是通過給藥髓鞘鹼性蛋白而誘導的 (參見Paterson (1986) Textbook of Immunopathology,Mischer et al. , eds. , Grune and Stratton, New York, ρρ· 179-213 ;McFarlin et al. (1973) Science, 179 :478 :and Satoh et al. (1987)J. Tmmunol.，138 :179)。
[0279] 通常，本發明的配體（例如，拮抗劑）將以純化的形式與藥物學上合適的載體一起 使用。通常，這些載體包括水或醇/水溶液、乳液或懸浮液、任何包括鹽和/或緩衝的基質。 非腸道載體包括氯化鈉溶液、Ringer's葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉和乳酸化Ringer's。如果 需要在懸浮液中保持多肽複合物，合適的生理學上可接受的佐劑可以選自增稠劑，如羧甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和海藻酸鹽。
[0280] 靜脈內載體包括流體和營養補充劑和電解質補充劑，如基於Ringer' s葡萄糖 的那些。防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體，也可以存在 (Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16版）。可以使用各種合適的制 齊U，包括緩釋製劑。
[0281] 本發明的配體（例如，拮抗劑）可以用作分開給藥的組合物或結合其他藥劑。這些 包括各種免疫治療藥物，如環孢黴素、氨甲喋呤、阿黴素或順鉬和免疫毒素。藥物組合物可 以包括各種細胞毒性或其他藥劑與本發明配體結合的"組合藥劑（cocktails) "，或甚至是 根據本發明的具有不同特異性的配體的組合物，如使用不同目標抗原或表位選擇的配體， 不管是否是在給藥之前混合。
[0282] 根據本發明的藥物組合物的給藥途徑可以是本領域技術人員公知的那些。對於治 療，包括但不限於免疫治療，根據標準技術將本發明選定的配體給藥於任何患者。
[0283] 給藥可以是任何合適的模式，包括非腸道、靜脈內、肌內、腹膜內、經皮、通過肺的 途徑，或者其他，合適地，通過用導管直接灌輸。給藥的劑量和頻率將取決於患者的年齡、性 別和狀況、其他藥物的同時給藥、禁忌和醫師將要考慮的其他參數。如所示的，給藥可以是 局部（例如，通過肺部給藥局部遞送至肺，例如，鼻內給藥）或全身的。
[0284] 可以將本發明的配體凍幹，用於存儲以及在使用前在合適的載體中重建。已經表 明該技術對常規的免疫球蛋白是有效的，並可以使用本領域已知的凍幹和重建技術。本領 域技術人員將認識到凍幹和重建可能導致抗體活性不同程度的損耗（例如，使用常規的免 疫球蛋白，IgM抗體的活性損耗易於比IgG抗體高），可以調節使用水平來補償。
[0285] 可以將含有本發明配體（例如，拮抗劑）或其混合物的組合物給藥來用於預防和/ 或治療處理。在特定的治療應用中，將實現選定細胞群的至少部分抑制、遏制、調節、殺滅或 一些其他可測量參數的適當含量定義為"治療有效量"。實現該劑量需要的含量將取決於疾 病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀況，但通常為0. 005至5. Omg配體/kg體重,配 體例如為dAb或拮抗劑，更常使用0. 05至2. Omg/kg/劑的劑量。對於預防性應用，可以給 藥相似或略低劑量的含有本發明配體或其混合物的組合物，以預防、抑制或延遲疾病的發 作（例如，維持緩解或靜止，或防止急性期）。本領域技術人員能夠測定治療、抑制或預防疾 病的合適給藥間隔。將TNFRl的配體（例如，拮抗劑）給藥來治療、抑制或預防慢性炎症疾 病時，可以給藥高達四次/天，每周兩次，每周一次，每兩周一次，一月一次或每兩月一次， 例如，劑量為約 10 μ g/kg 至約 80mg/kg，約 100 μ g/kg 至約 80mg/kg，約 lmg/kg 至約 80mg/ kg,約 lmg/kg 至約 70mg/kg，約 lmg/kg 至約 60mg/kg，約 lmg/kg 至約 50mg/kg，約 lmg/kg 至約 40mg/kg，約 lmg/kg 至約 30mg/kg，約 lmg/kg 至約 20mg/kg，約 lmg/kg 至約 10mg/kg， 約 10 μ g/kg 至約 10mg/kg，約 10 μ g/kg 至約 5mg/kg，約 10 μ g/kg 至約 2. 5mg/kg，約 lmg/ kg,約 2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg，約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約10mg/kg。在特定的實施方案中，將TNFRl的配體（例如，拮抗劑）給藥來治療、抑制 或防止慢性炎症疾病，每兩周一次或一月一次，劑量為約1〇μ g/kg至約10mg/kg(例如，約 10 μ g/kg，約 100 μ g/kg，約 lmg/kg,約 2mg/kg，約 3mg/kg，約 4mg/kg，約 5mg/kg，約 6mg/kg, 約 7mg/kg，約 8mg/kg，約 9mg/kg 或約 lOmg/kg)。
[0286] 如果相對於治療前存在的症狀，或相對於沒有用該組合物治療的個體（人或模型 動物）或其他合適對照中的症狀，一種或更多種症狀得到減輕（例如，至少10 %或臨床評價 等級的至少一個點），認為使用本文所述的組合物進行的處理或治療是"有效的"。症狀將根 據靶向的疾病或病症而明顯不同，但可以通過普通醫師或技術人員來測量。例如，可以通 過監控疾病或病症的一個或更多個生化指示劑的水平（例如，酶或與疾病相關的代謝產物 的水平、受影響細胞的數目等）、通過監控身體呈現（例如，炎症、腫瘤大小等），或通過公認 臨床評價等級來測量該症狀-例如擴展運動障礙狀態量度（對於多發性硬化）、歐文炎症性 腸病調查表（32點評定評價關於腸功能、系統性症狀、社會功能和情緒狀態的生活質量-評 分在32到224的範圍內，評分越高說明生活質量越好）、類風溼性關節炎生活質量標準、或 本領域中已知的其他認可的臨床評估標準。在給定的臨床標準上疾病或紊亂症狀持續（例 如一天或更多，或更長）降低至少10%或一個或更多個點是有效治療的指標。
[0287] 相似地，如果相對於未用組合物治療的相似個體（人或動物模型）中的症狀，一種 或更多種症狀的發作或嚴重程度得到了延遲、減輕或消除，使用本文所述的組合物進行的 預防是"有效的"。
[0288] 可以在預防或治療情況中使用含有根據本發明的配體（例如，拮抗劑）或其混合 物的組合物，以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標細胞群。此外，本文所述 的選定的多肽組可以離體地或在體外選擇性地從異源細胞集合中殺滅、耗盡或另外有效地 除去目標細胞群。可以根據標準技術，將來自哺乳動物的血液在體外與配體混合，由此殺滅 或另外從用於返回至哺乳動物的血液中除去不利的細胞。
[0289] 可以在預防或治療情況中使用含有根據本發明的配體（例如，拮抗劑）的組合物， 以幫助改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中選定的目標細胞群。
[0290] 可以將配體（例如，抗-TNFRl拮抗劑、dAb單體）給藥，和或與一種或更多種其他 的治療劑或活性劑一起配製。配體（dAb)與其他的治療劑一起給藥時，可以在給藥其他藥 劑之前、同時或之後，給藥配體。通常，以提供重疊治療效果的方法來給藥配體和其他藥劑。
[0291] 在一個實施方案中，本發明是用於治療、抑制或預防慢性炎症疾病的方法，該方法 包括將治療有效劑量或含量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑給藥於需要的哺 乳動物。
[0292] 在一個實施方案中，本發明是用於治療、抑制或預防關節炎（例如類風溼性關節 炎、幼年型類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、牛皮癬關節炎）的方法，其包括為有此需要的 哺乳動物給藥治療有效劑量或量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0293] 在另一個實施方式中，本發明是用於治療、抑制或者預防牛皮癬的方法，其包括為 有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗 劑。
[0294] 在另一個實施方式中，本發明是用於治療、抑制或者預防炎性腸病（例如克羅恩 氏病、潰瘍性結腸炎）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的 根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0295] 在另一個實施方式中，本發明是用於治療、抑制或者預防慢性阻塞性肺病（例如 慢性支氣管炎、慢性梗阻性支氣管炎、肺氣腫）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥 治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0296] 在另一個實施方式中，本發明是用於治療、抑制或者預防肺炎（例如細菌性肺炎 例如葡萄球菌肺炎）的方法，其包括為有此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根 據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。
[0297] 本發明提供了用於治療、抑制或預防除了慢性梗阻性肺病和肺炎之外的其他肺病 的方法。根據本發明可以治療、抑制或預防的其他肺病包括例如囊性纖維變性和哮喘（例 如類固醇抗性哮喘）因此，在另一個實施方案中，本發明是用於治療、抑制或預防肺病（例 如，囊性纖維變性和哮喘）的方法，其包括將治療有效劑量或含量的根據本發明的多肽、 dAb或TNFRl的拮抗劑給藥於需要的哺乳動物。
[0298] 在特定的實施方案中，通過肺部遞送，如通過吸入（例如，支氣管內、鼻內或口腔 吸入、鼻內滴劑）或通過全身性遞送（例如，非腸道、靜脈內、黏膜內、腹膜內、皮下）來給藥 TNFRl的拮抗劑。
[0299] 在另一個實施方案中，本發明是治療、抑制或預防敗血性休克的方法，其包括為有 此需要的哺乳動物給藥治療有效劑量或者量的根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑。 [0300] 在本發明進一步的方面中，提供了組合物，其包含根據本發明的多肽、dAb或 TNFRl的拮抗劑和藥物學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0301] 此外，本發明提供了使用根據本發明的多肽、dAb或TNFRl的拮抗劑或組合物來治 療疾病的方法。在一個實施方案中，疾病是癌症或炎症，例如，類風溼性關節炎、哮喘或克羅 恩氏病。
[0302] 形式
[0303] 提高的半衰期在免疫球蛋白，特別是抗體，最特別是小尺寸的抗體片段的體內應 用中是有用的。這樣的片段（Fv、二硫化物鍵合的Fv、Fab、scFv、dAb)能從體內快速清除； 因此，儘管它們能夠快速地到達身體的大部分部位，並且能快速產生和更容易操作，但它們 在體內的應用受到僅在體內短暫持續的限制。本發明的一個實施方案通過提供體內半衰期 延長的配體並且隨後配體的功能活性在體內持續更長時間來解決了該問題。
[0304] 藥物動力學分析的方法和配體半衰期的測定是本領域技術人員熟知的。可 以在 Kenneth, A 等：Chemical Stability of Pharmaceuticals ：A Handbook for Pharmacists (藥物動力學的化學穩定性：藥劑師手冊）和Peters等，Pharmacokinetc analysis :A Phactical Approach(藥物動力學分析：實踐方法）（1996)中找到詳細內容。 還可以參考"Pharmacokinetics"（藥物動力學），M Gibaldi&D Perron，Marcel Dekker 出版，第2次再版（1982)，其描述了藥物動力學參數，如ta和半衰期和曲線下面積 (AUC)。
[0305] 可以從配體隨時間的血清濃度曲線確定半衰期（t1/2 α和t1/2 β )和AUC。例如，可 以使用 WinNonlin 分析包（從 Pharsight Corp. ,Mountain View，CA94040,USA 獲得）來模 擬曲線。在第一期中（α期），配體主要經歷在患者中的分布，並有一些清除。第二期（β 期）是配體已經得到分布的末期，血清濃度隨著配體從患者體內清除出去而降低。ta半衰 期是第一期的半衰期，而半衰期是第二期的半衰期。因此，在一個實施方案中，本發明 提供了具有15分鐘或更長ta半衰期的配體或含有根據本發明的配體的組合物。在一個 實施方案中，範圍的下限是30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、 7小時、10小時、11小時或12小時。此外，或可替換地，根據本發明的配體或組合物將具有 高達並包括12小時的ta半衰期。在一個實施方案中，範圍的上限是11、1〇、9、8、7、6或5 小時。合適範圍的實例是1至6小時，2至5小時或3至4小時。
[0306] 在一個實施方案中，本發明提供具有2. 5小時或更長半衰期的配體（多肽、 dAb或拮抗劑）或含有根據本發明的配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限是3 小時，4小時，5小時，6小時，7小時，10小時，11小時或12小時。此外，或可替換地，根據本 發明的配體或組合物將具有高達並包括21天的半衰期。在一個實施方案中，範圍的上 限是12小時，24小時，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在一個實施方案中，根據本發 明的配體或組合物將具有12至60小時的?β半衰期。在進一步的實施方案中，將是12至 48小時。在仍然進一步的實施方案中，將是12至26小時。
[0307] 對於以上標準，另外或可替換地，本發明提供了具有lmg.min/ml或更高AUC值 (曲線下面積）的配體或含有根據本發明的配體的組合物。在一個實施方案中，範圍的下限 是5、10、15、20、30、100、200或300mg. min/ml。此外，或可替換地，根據本發明的配體或組 合物具有高達600mg.min/ml的AUC。在一個實施方案中，範圍的上限是500、400、300、200、 150、100、75或50mg. min/ml。在一個實施方案中，根據本發明的配體具有選自以下範圍的 AUC :15 至 150mg. min/ml, 15 至 IOOmg. min/ml, 15 至 75mg. min/ml 和 15 至 50mg. mon/ml〇
[0308] 例如，通過連接PEG基團、血清白蛋白、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體或至少轉鐵蛋白 結合部分、抗體Fc區，或通過綴合抗體結構域，將本發明的多肽和dAb以及含有這些的拮抗 劑格式化，以具有較大的流體動力學大小。例如，將多肽dAb和拮抗劑格式化成較大的抗體 的抗原結合片段或抗體（例如，格式化成Fab、Fab '、F (ab) 2、F (ab '）2、I gG、scFv)。
[0309] 可以使用本領域公知的方法來測定本發明配體（例如，dAb單體或多聚體）的流 體動力學大小。例如，凝膠過濾色譜可以用來測定配體的流體動力學大小。用於測定配體 的流體動力學大小的合適的凝膠過濾基質，如交聯的瓊脂糖基質，是公知的並容易獲得。
[0310] 配體形式的大小（例如,連接dAb單體的PEG部分的大小）可以根據所需的應用 而改變。例如，在打算將配體離開循環並進入外周組織的情況中，希望保持低的配體流體動 力學大小，以促進從血流中外滲。或者，在期望配體在全身循環中保持更長時間的情況中， 可以提高配體的大小，例如，通過格式化成Ig樣蛋白。
[0311] 通討靶向提高體內半衰期的抗原或表位來延長半衰期
[0312] 如本文所述的，還可以通過將本發明的TNFRl結合多肽、dAb或拮抗劑綴合或連 接結合提高體內半衰期的抗原或表位的結合域（例如，抗體或抗體片段）來提高配體的流 體動力學大小及其血清半衰期。例如，可以將TNFRl結合劑（例如，多肽）綴合或連接抗-血 清白蛋白或抗-新生兒Fc受體抗體或抗體片段，例如，抗-SA或抗新生兒Fc受體dAb、Fab、 Fab'或scFv,或抗-SA親和體或抗-新生兒Fe受體親和體或抗-SA avimer，或抗-SA結合 域，其包含選自但優選不限於CTLA-4、lipocallin、SpA、親和體、avimer、GroEl和纖連蛋白 的支架（對於這些結合域的公開內容，參見，PCT/GB2008/000453,2008年2月8日申請，在 此將結合域及其序列引入作為參考，並形成本發明文本公開內容的一部分）。綴合指的是將 含有本發明的多肽、dAb或拮抗劑的組合物結合（共價或非共價）結合血清白蛋白的結合 域。
[0313] 提高體內血清半衰期的合適多肽包括，例如，轉鐵蛋白受體特異性配體-神經藥 劑融合蛋白（參見，U.S.專利No. 5, 977, 307,在此將其教導引入作為參考）、腦毛細管內皮 細胞受體、轉鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（例如，可溶性轉鐵蛋白受體）、胰島素、胰島素樣生長 因子（IGFl)受體、胰島素樣生長因子2 (IGF2)受體、胰島素受體、凝血因子X、α 1-抗胰蛋 白酶和HNFla。合適的提高血清半衰期的多肽還包括α 1-糖蛋白（血清類粘蛋白；AAG)、 a 1-抗凝乳蛋白酶（ACT)、a 1-微球蛋白（蛋白HC ;ΑΜ)、抗凝血酶III (AT III)、阿樸脂 蛋白A-UApo A-1)、阿樸脂蛋白B(Apo B)、血漿銅藍蛋白（Cp)、補體成分C3(C3)、補體成分 C4(C4)、Cl彈性蛋白酶抑制劑（ClIHN)、C-反應性蛋白（CRP)、鐵蛋白（FER)、血液結合素 (HPX)、脂蛋白（a) (Lp(a))、甘露糖-結合蛋白（MBP)、肌紅蛋白（Myo)、前清蛋白（甲狀腺素 運載蛋白（transthyretin) ;PAL)、視黃醇-結合蛋白（RBP)和類風溼因子（RF)。
[0314] 來自胞外基質的合適蛋白包括，例如，膠原蛋白、昆布氨酸、整聯蛋白和纖連蛋白。 膠原蛋白是胞外基質主要的蛋白。目前已知約15種類型的膠原蛋白，在身體的不同部分 發現，例如，在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內臟中發現的I型膠原蛋白（佔身體膠原蛋白的 90% )，或在軟骨、椎間盤、脊索和眼睛的玻璃體中發現的II型膠原蛋白。
[0315] 來自血液的合適蛋白包括，例如，血漿蛋白（例如，纖維蛋白、α-2巨球蛋白、血清 白蛋白、纖維蛋白原（例如，纖維蛋白原Α、纖維蛋白原Β)、血清澱粉狀蛋白Α、結合珠蛋白、 抑制蛋白、泛素、子宮球蛋白和β-2-微球蛋白）、酶和酶抑制劑（例如，血纖維蛋白溶酶原、 溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin)C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制劑）、 免疫系統的蛋白，如免疫球蛋白（例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白輕鏈（κ/λ))、 轉運蛋白（例如，視黃醇結合蛋白、α-l微球蛋白）、防禦素（例如，β-防禦素1、嗜中性防 御素1、嗜中性防禦素2和嗜中性防禦素3)等。
[0316] 在血腦屏障或神經組織中發現的合適蛋白包括，例如，黑皮素受體、髓磷脂、抗壞 血酸轉運子等。
[0317] 提高體內血清半衰期的合適多肽還包括位於腎臟中的蛋白（例如，polycystin、 IV型膠原蛋白、有機陰離子轉運子KU Heymann' s抗原）、位於肝臟中的蛋白（例如，醇脫 氫酶、G250)、位於肺中的蛋白（例如，分泌成分，其結合IgA)、位於心臟中的蛋白（例如， HSP27,其與擴張型心肌病相關）、位於皮膚中的蛋白（例如，角蛋白）、骨特異性蛋白，如 骨形態發生蛋白（BMP)，其是證明了骨形成活性的蛋白的轉化生長因子β超家族的子集 (例如，BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、ΒΜΡ-8)、腫瘤特異性蛋白（例如，滋養層抗原、 here印tin受體、雌激素受體、組織蛋白酶（例如，組織蛋白酶Β，其可以在肝臟和脾臟中找 到）。
[0318] 合適的疾病特異性蛋白包括，例如，只在激活的T-細胞上表達的抗原，包括 LAG-3(淋巴細胞激活基因）、骨保護素配體（0PGL ;參見Nature 402,304-309(1999))， 0X40(TNF受體家族的成員，在激活的T細胞上表達並在人I-型T細胞白血病病毒 (HTLV-I)-產生細胞中特異性地上調；參見Immunol. 165(1) :263-70(2000))。合適的疾病 特異性蛋白還包括，例如，金屬蛋白酶（與關節炎/癌症相關），包括CG6512果蠅、人截癱蛋 白（paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠 ftsH ;和血管生成生長因子，包括酸性成纖維細胞 生長因子（FGF-I)、鹼性成纖維細胞生長因子（VEGF/VPF)、轉化生長因子-a (TGF α )、腫瘤 壞死因子-a (TNF- α )、血管生成素、白細胞間介素-3 (IL-3)、白細胞間介素-8 (IL-8)、血 小板衍生內皮生長因子（PD-ECGF)、胎盤生長因子（PlGF)、中期因子（midkine)血小板-衍 生生長因子-BB(H)GF)和 fractalkine。
[0319] 提高體內血清半衰期的合適多肽還包括應激蛋白，如熱休克蛋白（HSP)。HSP通常 在細胞內發現。在胞外發現時，它是細胞已經死亡並溢出其內含物的指示劑。作為創傷、疾 病或損傷的結果時，發生這種非程序化細胞死亡（壞死），胞外HSP引發了來自免疫系統的 應答。結合胞外HSP可以導致將本發明的組合物定位於患病部位。
[0320] 涉及Fc轉運的合適蛋白包括，例如，Brambell受體（也稱為FcRB)。這種Fc受 體具有兩個功能，對於遞送都是潛在有用的。功能是（1)通過胎盤將IgG從母體轉運至子 女，（2)保護IgG免受降解，由此延長其血清半衰期。認為受體使來自核內體的IgG再循環。 (參見，Holliger 等，Nat Biotechnol 15(7) :632-6(1997))。
[0321] 結合血清白蛋白的dAb
[0322] 在一個實施方案中，本發明提供了多肽或拮抗劑（例如，雙特異性配體），其含有 結合TNFRl的抗TNFRldAb (第一 dAb)和結合血清白蛋白（SA)的第二dAb，第二dAb結合 SA，具有通過表面等離子共振測定的InM至1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、 300、400 或 500 μ M(即，χ10_9 至 5xl0_4)的 KD，或 IOOnM 至 ΙΟμΜ，或 1 至 5μΜ，或 3 至 70nM， 或IOnM至1、2、3、4或5μΜ。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個 實施方案中，第一 dAb (或dAb單體）結合SA(例如，HSA)，具有通過表面等離共振測定的 大約1、50、70、100、150、200、30011]\1或1、2或34]\1的1( 1)。在一個實施方案中，對於含有第一 抗-SA dAb和第二對TNFRl的dAb的雙特異性抗體，第二dAb對其目標的親和性（例如Kd 和/或Ktjff，如通過表面等離子共振所測量的，例如使用BiaCore)為dAb對SA的親和性的1 至 100000 倍（例如，100 至 100000,或 1000 至 100000,或 10000 至 100000 倍）。在一個實 施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白（HSA)。例如，第一 dAb以大約10 μ M的親和性結合 SA，而第二dAb以IOOpM的親和性結合其目標。在一個實施方案中，血清白蛋白是人血清白 蛋白（HSA)。在一個實施方案中，第一 dAb以大約50,例如，70、100、150或200nM的Kd結合 SA(例如，HSA)。雙特異性配體的詳細內容可以在W003002609、W004003019和W004058821 中找到。
[0323] 在一個實施方案中，本發明的配體包含結合血清白蛋白（SA)的dAb，具有通過 表面等離子共振測定的 InM 至 1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400 或 500μΜ(艮P，xl(T9 至 5xl(T4)的 KD，或 IOOnM至 ΙΟμΜ，或 1 至 5μΜ，或 3 至 70nM，或 IOnM至 1、2、3、4或5μΜ。例如，30至70nM，如通過表面等離子共振所測定的。在一個實施方案中， 第一 dAb (或dAb單體）結合SA(例如，HAS)，具有通過表面等離共振測定的大約1、50、70、 100、150、200、300nM或1、2或3 μ M的KD。在一個實施方案中，第一和第二dAb通過連接物 連接，例如，1至4個胺基酸的連接物，或1至3個胺基酸，或多於3個胺基酸，或多於4、5、 6、7、8、9、10、15或20個胺基酸。在一個實施方案中，可以使用較長的連接物（多於3個氨 基酸）來提高功效（拮抗劑中一個或兩個dAb的K d)。
[0324] 在配體和拮抗劑的特定實施方案中，dAb結合人血清白蛋白並與選自以下的dAb 競爭與白蛋白的結合：
[0325] MSA-16、MSA-26(對於這些序列的公開內容，參見TO04003019,在此將該序列及其 核酸對應物引入作為參考並形成本發明文本公開內容的一部分），
[0326] D0M7m-16(SEQ ID NO ：473) , D0M7m-12 (SEQ ID NO ：474) , D0M7m-26 (SEQ ID NO :475)、D0M7r-l (SEQ ID NO :476)、D0M7r-3(SEQ ID NO :477)、D0M7r-4(SEQ ID NO : 478)、DOM7r-5(SEQ ID NO :479)、DOM7r-7(SEQ ID NO :480)、DOM7r-8(SEQ ID NO :481)、 D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID N0:484)、 D0M7h-6(SEQ ID N0:485)、D0M7h-l(SEQ ID N0:486)、D0M7h-7(SEQ ID N0:487)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID NO :492)、D0M7h-26(SEQ ID NO :493)、D0M7h-21 (SEQ ID NO :494)、 D0M7h-27(SEQ ID N0:495)、D0M7h-8(SEQ ID N0:496)、D0M7r-13(SEQ ID N0:497)、 D0M7r-14(SEQ ID NO ：498), D0M7r-15 (SEQ ID NO ：499), D0M7r-16 (SEQ ID NO ：500), D0M7r-17(SEQ ID NO ：501), D0M7r-18 (SEQ ID NO ：502), D0M7r-19 (SEQ ID NO ：503), D0M7r-20(SEQ ID N0:504)、D0M7r-21(SEQ ID N0:505)、D0M7r-22(SEQ ID N0:506)、 D0M7r-23(SEQ ID NO ：507), D0M7r-24 (SEQ ID NO ：508), D0M7r-25 (SEQ ID N0：509), D0M7r-26 (SEQ ID NO ：510), D0M7r-27 (SEQ ID NO ：511), D0M7r-28 (SEQ ID NO ：512), D0M7r-29(SEQ ID NO ：513), D0M7r-30 (SEQ ID NO ：514), D0M7r-31 (SEQ ID N0：515), D0M7r-32(SEQIDN0:516)、D0M7r-33(SEQIDN0:517)(對於這些序列的公開內容，參見 W02007080392,在此將其序列及其核酸對應物引入作為參考並形成本發明文本公開內容的 一部分；該段落中的SEQ ID NO是W02007080392公開的那些），
[0327] dAb8 (dAblO)、dAblO、dAb36、dAb7r20 (D0M7r20)、dAb7r21 (D0M7r21)、 dAb7r22 (D0M7r22)、dAb7r23 (D0M7r23)、dAb7r24 (D0M7r24)、dAb7r25 (D0M7r25)、 dAb7r26 (D0M7r26)、dAb7r27 (D0M7r27)、dAb7r28 (D0M7r28)、dAb7r29 (D0M7r29)、 dAb7r29 (D0M7r29)、dAb7r31(D0M7r31)、dAb7r32 (D0M7r32)、dAb7r33 (D0M7r33)、 dAb7r33 (D0M7r33)、dAb7h22 (D0M7h22)、dAb7h23 (D0M7h23)、dAb7h24 (D0M7h24)、 dAb7h25 (D0M7h25)、dAb7h26(D0M7h26)、dAb7h27 (D0M7h27)、dAb7h30 (D0M7h30)、 dAb7h31 (D0M7h31)、dAb2(dAbs4、7、41)、dAb4、dAb7、dAbll、dAb 12 (dAb7ml2)、 dAbl3(dAbl5)、dAbl5、dAbl6(dAb21、dAb7ml6)、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、 dAb23、 dAb24、 dAb25(dAb26、 dAb7m26)、 dAb27、 dAb30(dAb35)、 dAb31、 dAb33、 dAb34、 dAb35、dAb38(dAb54)、dAb41、dAb46(dAbs47、52 和 56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、 dAb55、 dAb56、 dAb7ml2、 dAb7ml6、 dAb7m26、 dAb7rl(D0M7rl)、 dAb7r3(D0M7r3)、 dAb7r4(D0M7r4)、dAb7r5(D0M7r5)、dAb7r7(D0M7r7)、dAb7r8(D0M7r8)、dAb7rl3(D0M7rl3)、 dAb7rl4 (D0M7rl4)、dAb7rl5 (D0M7rl5)、dAb7rl6 (D0M7rl6)、dAb7rl7 (D0M7rl7)、 dAb7rl8(D0M7rl8)、 dAb7rl9(D0M7rl9)、 dAb7hl(D0M7hl)、 dAb7h2(D0M7h2)、 dAb7h6(D0M7h6)、dAb7h7(D0M7h7)、dAb7h8(D0M7h8)、dAb7h9(D0M7h9)、dAb7hlO(DOM7hlO)、 dAb7hll (D0M7hll)、dAb7hl2 (D0M7hl2)、dAb7hl3 (D0M7hl3)、dAb7hl4(D0M7hl4)、 dAb7pl (D0M7pl)和 dAb7p2(D0M7p2)(對於這些序列的公開內容，參見PCT/GB2008/000453， 2008年2月8日申請，在此將其序列及其核酸對應物引入作為參考並形成本發明文本的 公開內容的一部分）。dAb後括號中顯示了可替換的名稱，例如dAb8具有可替換的名稱 dAblO,即dAb8(dAblO)。還在圖51a和b中列出了這些序列。
[0328] 在特定的實施方案中，dAb結合人血清白蛋白，並包含與選自以下的dAb的胺基酸 序列具有至少約80 %或至少約85 %，或至少約90 %，或至少約95 %，或至少約96 %，或至少 約97%，或至少約98%，或至少約99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列：
[0329] MSA-16, MSA-26,
[0330] D0M7m-16(SEQ ID NO :473)、D0M7m-12(SEQ ID NO :474)、D0M7m-26(SEQ ID NO :475)、D0M7r-l (SEQ ID NO :476)、D0M7r-3 (SEQ ID NO :477)、D0M7r-4(SEQ ID NO : 478)、D0M7r-5(SEQ ID NO :479)、D0M7r-7(SEQ ID NO :480)、D0M7r-8(SEQ ID NO :481)、 D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID N0:484)、 D0M7h-6(SEQ ID N0:485)、D0M7h-l(SEQ ID N0:486)、D0M7h-7(SEQ ID N0:487)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、D0M7h-26(SEQ ID N0:493)、D0M7h-21(SEQ ID N0:494)、 D0M7h-27(SEQ ID N0:495)、D0M7h-8(SEQ ID N0:496)、D0M7r-13(SEQ ID N0:497)、 D0M7r-14(SEQ ID NO ：498), D0M7r-15 (SEQ ID NO ：499), D0M7r-16 (SEQ ID N0：500), D0M7r-17(SEQ ID NO ：501), D0M7r-18 (SEQ ID NO ：502), D0M7r-19 (SEQ ID NO ：503), D0M7r-20(SEQ ID N0:504)、D0M7r-21(SEQ ID N0:505)、D0M7r-22(SEQ ID N0:506)、 D0M7r-23(SEQ ID NO ：507), D0M7r-24 (SEQ ID NO ：508), D0M7r-25 (SEQ ID NO ：509), D0M7r-26(SEQ ID NO ：510), D0M7r-27 (SEQ ID NO ：511), D0M7r-28 (SEQ ID NO ：512), D0M7r-29(SEQ ID NO ：513), D0M7r-30 (SEQ ID NO ：514), D0M7r-31 (SEQ ID N0：515), D0M7r-32(SEQIDN0:516)、D0M7r-33(SEQIDN0:517)(該段落中的SEQIDN0是 W02007080392中公開的那些），
[0331] dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、 dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、 dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、 dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、 dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、 dAb7hl4、dAb7pl 和 dAb7p2。
[0332] 例如，結合人血清白蛋白的dAb可以含有與以下序列具有至少約90 %，或至少 約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99 %胺基酸序列同一 性的胺基酸序列：D0M7h-2(SEQ ID N0:482)、D0M7h-3(SEQ ID N0:483)、D0M7h-4(SEQ ID NO :484)、D0M7h-6 (SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO :486)、D0M7h-7 (SEQ ID NO : 487)、D0M7h-8 (SEQ ID NO :496)、D0M7r-13 (SEQ ID NO :497)、D0M7r-14 (SEQ ID NO :498)、 D0M7h-22(SEQ ID N0:489)、D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、 D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、D0M7h-26(SEQ ID N0:493)、D0M7h-21(SEQ ID N0:494)、 D0M7h-27(SEQIDN0:495)(該段落中的SEQIDN0是W02007080392 中公開的那些），
[0333] dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、 dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、 dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7hl、dAb7h2、 dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0334] 在特定的實施方案中，dAb結合人血清白蛋白並含有與以下序列具有至少約80% 或至少約85%，或至少約90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約 98%，或至少約99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列：
[0335] D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h-6(SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO : 486)、D0M7h-7(SEQ ID NO :487)、D0M7h-8(SEQ ID NO :496)、D0M7h-22(SEQ ID NO :489)、 D0M7h-23(SEQ ID N0:490)、D0M7h-24(SEQ ID N0:491)、D0M7h-25(SEQ ID N0:492)、 D0M7h-26(SEQIDN0:493)、D0M7h-21(SEQIDN0:494)、D0M7h-27(SEQIDN0 :495)(該段 落中的SEQ ID NO是W02007080392中公開的那些），
[0336] dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、 dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hl0、 dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0337] 在更特別的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的Vk dAb，並具有選自以下的 胺基酸序列：
[0338] D0M7h-2(SEQ ID NO :482)、D0M7h-6(SEQ ID NO :485)、D0M7h-l (SEQ ID NO : 486)、D0M7h-7(SEQ ID NO :487)、D0M7h-8(SEQ ID NO :496)(該段落中的 SEQ ID NO 是 W02007080392中公開的那些），
[0339] dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、 dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3 和 dAb7hl4。
[0340] 在更特別的實施方案中，dAb是結合人血清白蛋白的Vh dAb，並具有選自dAb7h30 和dAb7h31的胺基酸序列。
[0341] 在更特別的實施方案中，dAb是dAb7hll或dAb7hl4。
[0342] 在其他實施方案中，dAb、配體或拮抗劑結合人血清白蛋白，並含有之前任一氨基 酸序列的一個、兩個或三個⑶R，例如，dAb7hll或dAb7h 14的一個、兩個或三個⑶R。
[0343] 合適的結合血清白蛋白的Camelid Vhh包括TO2004/041862(Ablynx N. V.)和 W02007080392中公開的那些（在此將其Vhh序列及其核酸對應物引入作為參考，並形成本 發明文本公開內容的一部分），如序列A(SEQ ID N0:518)、序列B(SEQ ID N0:519)、序列 C(SEQIDN0:520)、序列D(SEQIDN0:521)、序列E(SEQIDN0 :522)、序列F(SEQIDN0: 523)、序列G(SEQIDN0:524)、序列H(SEQIDN0:525)、序列I(SEQIDN0 :526)、序列J(SEQ IDN0:527)、序列K(SEQIDN0:528)、序列L(SEQIDN0 :529)、序列M(SEQIDN0:530)、 序列 N(SEQ ID NO :531)、序列 0 (SEQ ID NO :532)、序列 P (SEQ ID NO :533)、序列 Q (SEQ ID NO :534)，這些序列編號對應於 W02007080392 或 W02004/041862(Ablynx N. V.)中引用的 那些。在特定的實施方案中，Camelid Vhh結合人血清白蛋白並含有與W0200708030392中 公開的ALB 1或SEQ ID NO :518-534中任一個具有至少約80%，或至少約85%，或至少約 90%，或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%，或至少約98%，或至少約99 %胺基酸 序列同一性的胺基酸序列，這些序列編號對應於W02007080392或W02004/041862中引用的 那些。
[0344] 在一些實施方案中，配體或拮抗劑含有與在此公開的任一抗-血清白蛋白dAb競 爭與血清白蛋白（例如，人血清白蛋白）結合的抗-血清白蛋白dAb。
[0345] 在可替換的實施方案中，拮抗劑或配體含有TNFRl (例如，人TNFR1)特異性的結 合部分，其中該部分含有非免疫球蛋白序列，如2008年2月8日申請的共同未決申請PCT/ GB2008/000453中所述的，這些結合部分、它們的生產和選擇方法（例如，來自不同的文庫） 及其序列的公開內容在此引入作為參考，作為本發明文本的公開內容的一部分。
[0346] 與半衰期延長部分（例如，白蛋白）的綴合
[0347] 在一個實施方案中，將（一個或更多個）半衰期延長部分（half-life extending moiety)(例如，白蛋白、轉鐵蛋白及其片段和類似物）綴合或連接本發明的TNFRl-結合多 肽、dAb或拮抗劑。對用於TNFRl-結合形式中的合適白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的 實例描述於W02005077042中，在此將其公開內容引入作為參考，並形成本發明文本的公開 內容的一部分。特別地，以下的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體可以用於本發明中：
[0348] *SEQ ID NO :1(如W02005077042中公開的，在此明確地將該序列引入本發明公開 內容中作為參考）；
[0349] ?含有 W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 1-387 或由 W02005077042 中的 SEQ ID NO :1的胺基酸1-387組成的白蛋白片段或變體；
[0350] ?白蛋白、或其片段或變體，含有選自以下的胺基酸序列：（a)W02005077042中的 SEQ ID N0:1 的胺基酸 54-61;(b)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的胺基酸 76 至 89; (c)TO2005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 92 至 100 ; (d)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的胺基酸 170 至 176;(e)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的胺基酸 247 至 252; (f)TO2005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 266 至 277 ; (g)W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 280 至 288 ; (h)W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 362 至 368 ; (i) W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 439 至 447 ; (i)W02005077042 中的 SEQ ID NO : 1 的胺基酸 462 至 475;(k)W02005077042 中的 SEQ ID N0:1 的胺基酸 478 至 486;和（1) W02005077042 中的 SEQ ID NO :1 的胺基酸 560 至 566。
[0351] 對用於TNFRl結合形式中的合適白蛋白、片段或類似物的更多實例描述於 W003076567中，在此將其公開內容引入作為參考，並形成本發明文本的公開內容的一部分。 特別地，以下的白蛋白、片段或變體可以用於本發明中：
[0352] ?如W003076567中所述的人血清白蛋白，例如，圖3中（在此明確地將該序列信息 引入本發明公開內容中作為參考）；
[0353] ?由具有66, 500通式分子量的585個胺基酸的單非糖基化多肽鏈組成的人血 清白蛋白（參見，Meloun 等，FEBS Letters 58 :136(1975) ;Behrens 等，Fed. Proc. 34 : 591 (1975) ;Lawn 等，Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981) ;Minghetti 等， J. Biol. Chem. 261 :6747(1986))；
[0354] ?白蛋白的多態變體或類似物或片段，如Weitkamp等，Ann. Hum. Genet. 37 : 219(1973)中所述的；
[0355] ?如EP322094中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-373)、HA(1-388)、 HA (1-389)、HA (1-369)和 HA (1-419)以及 1-369 和 1-419 之間的片段；
[0356] ?如EP399666中所述的白蛋白片段或變體，例如，HA(1-177)和ΗΑ(1-200)以及 HA(I-X)之間的片段，其中X是178至199的任何數字。
[0357] 在將（一個或更多個）半衰期延長部分（例如，白蛋白、轉鐵蛋白及其片段和類似 物）用于格式化本發明的TNFRl-結合多肽、dAb和拮抗劑的情況中，可以使用任何合適的 方法來綴合，如通過直接融合TNFRl-結合部分（例如，抗-TNFRldAb)，例如，通過使用編碼 融合蛋白的單核苷酸構建體，其中將融合蛋白編碼為單多肽鏈，在位於TNFR 1結合部分的 N-或C-端具有半衰期延長部分。或者，可以通過在部分之間使用肽連接物來完成綴合，例 如，W003076567或W02004003019中所述的肽連接物（在此將這些連接物的公開內容引入 作為參考，以提供用於本發明中的實例）。通常，提高體內血清半衰期的多肽是在體內天然 產生的多肽，並且能抵抗從生物體內（例如，人）除去不利物質的內源機制的降解或去除。 例如，提高體內血清半衰期的多肽可以選自胞外基質的蛋白，血液中發現的蛋白，血腦屏障 或神經組織中發現的蛋白，位於腎臟、肝臟、肺、心臟、皮膚或骨中的蛋白，應激蛋白，疾病特 異性蛋白或涉及Fc轉運的蛋白。
[0358] 在整個公開內容中所述的本發明的實施方案中，替代本發明的拮抗劑或配體中的 抗-TNFRl "dAb"的使用，考慮了本領域技術人員可以使用含有本發明的結合TNFRl的dAb 的一個或更多個或全部3個CDR的多肽或結構域（例如，嫁接在合適蛋白支架或骨架上的 CDR，支架或骨架例如為，親和體、SpA支架、LDL受體A類結構域或EGF結構域）。因此，認為 該公開內容作為整體提供了使用這樣的結構域替代dAb的拮抗劑的公開內容。在這點上， 參見2008年2月8日申請的PCT/GB2008/000453,在此將其公開內容引入作為參考）。
[0359] 因此，在一個實施方案中，本發明的拮抗劑包含具有TNFRl結合特異性的免疫球 蛋白單可變域或結構域抗體（dAb)或該dAb合適形式的互補性決定區。拮抗劑可以是由該 dAb組成的多肽，或基本上是由該dAb組成的多肽。拮抗劑可以是包含合適形式的dAb (或 dAb的(DR)的多肽，如抗體形式（例如，IgG-樣形式，scFv、Fab、Fab'、F(ab'）2)，或含有結 合TNFRl的dAb和結合另一個目標蛋白、抗原或表位（例如，血清白蛋白）的第二dAb的雙 特異性配體。
[0360] 可以將根據本發明的多肽、dAb和拮抗劑格式化成本領域已知的各種合適的抗體 形式，如IgG-樣形式、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體重鏈、 抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同型二聚體和雜二聚體、之前任一項的抗原結合片段（例 如，Fv片段（例如，單鏈Fv) (scFv)、二硫化物鍵合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片 段）、單可變域（例如，V H、VJ、dAb和之前任一項的修飾形式（通過共價連接聚烷撐二醇 (例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇）或其他合適聚合物的修飾）。
[0361] 在一些實施方案中，本發明提供了為IgG-樣形式的配體（例如，抗-TNFRl拮抗 劑）。這樣的形式具有IgG分子常規的四條鏈結構（2條重鏈和兩條輕鏈），其中一個或更 多個可變區（V h和或')已經由本發明的dAb替代。在一個實施方案中，每個可變區（2個 Vh區和2個 '區）由dAb或單可變域替代，其中至少一個是根據本發明的抗-TNFRldAb。 IgG-樣形式中包括的dAb或單可變域可以具有相同的特異性或不同的特異性。在一些實施 方案中，IgG-樣形式是三價的，並可以具有一種（只抗-TNFR1)、兩種（例如，抗-TNFRl和 抗-SA)、三種或四種特異性。例如，IgG樣形式可以是單價的，並含有具有相同特異性的4個 dAb ;是雙特異性的並含有3個具有相同特異性的dAb和另一個具有不同特異性的dAb ;是 雙特異性的並含有兩個具有相同特異性的dAb和兩個具有共同的但不相同特異性的dAb ; 三特異性的並含有具有相同特異性的第一和第二dAb，具有不同特異性的第三dAb和具有 不同於第一、第二和第三dAb的特異性的第四dAb ;或四特異性的，並含有四個具有各不相 同特異性的dAb。可以製備IgG樣形式的抗原結合片段（例如，Fab、F(ab'） 2、Fab'、Fv、 scFv)。在一個實施方案中，IgG樣形式或其抗原結合片段不與TNFRl交聯，例如，形式對於 TNFRl可以是單價的。如果需要補體激活和/或抗體依賴性細胞毒性（ADCC)功能，配體可以 是IgGl-樣形式。如果需要，IgG-樣形式可以包含突變的恆定域（變體IgG重鏈恆定域）， 以最小化與Fc受體的結合和/或固定補體的能力。（參見，例如，Winter等，GB2, 209, 757B ; Morrison 等，W089/07142 ;Morgan 等，W094/29351，1994 年 12 月 22 日）。
[0362] 本發明的配體（多肽、dAb和拮抗劑）可以格式化成融合蛋白，其含有與第二免疫 球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球蛋白單可變域。如果需要，該形式可以進一步包含 半衰期延長部分。例如，配體可以包含與第二免疫球蛋白單可變域直接融合的第一免疫球 蛋白單可變域，而第二免疫球蛋白單可變域與結合血清白蛋白的免疫球蛋白可變域直接融 合。
[0363] 通常，不管配體是否包含連接物，具有對目標有結合特異性的結合位點的多肽結 構域的方向是設計選擇的問題。然而，一些方向，使用或不使用連接物，可以提供比其他 方向更好的結合特徵。本發明包括的所有方向（例如，dAbl-連接物-dAb2;dAb2-連接 物-dAbl)是含有提供所需結合特徵的方向的配體，該結合特徵可以通過篩選容易地識別。
[0364] 根據本發明的多肽和dAb，包括dAb單體、二聚體和三聚體，可以連接抗體Fc區， 包含C H2和CH3結構域中的一個或兩個，和任選鉸鏈區。例如，作為單個核苷酸序列連接Fc 區的載體編碼配體可以用來製備這樣的多肽。
[0365] 此外，本發明提供了上述dAb單體的二聚體、三聚體和多聚體。
[0366] 密碼子優化序列
[0367] 如上所述，本發明的實施方案提供了編碼本發明的多肽和可變域的密碼子優化核 苷酸序列。如以下說明中所示的，可以產生編碼相同可變域的約70%同一性的密碼子優化 序列（在該情況中，可變域胺基酸序列與DOM lh-131-206相同）。在這種情況下，對於通過 巴斯德畢赤酵母（密碼子優化序列1-3)或大腸桿菌（密碼子優化序列4和5)的表達，將 序列優化。
[0368] 我們在考慮了遺傳密碼的簡併性之後進行了計算，並將通過D0Mlh-131_206(如 顯示於圖19中）的核苷酸序列和理論核苷酸序列編碼的每個簡併密碼子內的核苷酸變化 數量最大化，理論核苷酸序列仍然編碼與DOM lh-131-206相同的可變域。計算揭示了理論 序列與顯不於圖19中的DOM lh-131-206的核苷酸序列只具有57%的同一性。
[0369] 密碼子優化序歹Il 1
[0370] DNA 序列
[0371] gaggttcaattgttggaatccggtggtggattggttcaacctggtggttctttgagattgtcctgtgct gcttccggttttactttcgctcacgagactatggtttgggttagacaggctccaggtaaaggattggaatgggtttc ccacattccaccagatggtcaagatccattctacgctgactccgttaagggaagattcactatctccagagacaact ccaagaacactttgtacttgcagatgaactccttgagagctgaggatactgctgtttaccactgtgctttgttgcca aagagaggaccttggtttgattactggggacagggaactttggttactgtttcttcc
[0372] 相應的AA序列
[0373] evqlIesggglvqpggslrlscaasgftfahetmvwvrqapgkglewvshippdgqdpfyadsvkgrft isrdnskntIylqmnslraedtavyhcalIpkrgpwfdywgqgtlvtvss
[0374] ?與WT序列74. 1 %的核苷酸序列同一性
[0375]

【權利要求】
1. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206的 胺基酸序列（顯示於圖3中）為至少93%同一性的胺基酸序列。
2. 抗1即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206的 胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列。
3. 抗1冊〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其是由與0011111-131-206的 核苷酸序列（顯示於圖19中）具有至少80%同一性的核苷酸序列編碼的。
4. 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域，其是由與與DOMlh-131-206 的核苷酸序列（顯示於圖19中）相同的序列編碼的。 5. TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)拮抗劑，其含有根據前述任一項權利要求的抗-TNFRl 免疫球蛋白單可變域。
6. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與001111-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列，或者在不超過25個胺基酸位置與 DOMlh-131-206的胺基酸序列不同並具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的CDRl序列的胺基酸序列。
7. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列，或者在不超過25個胺基酸位置與 DOMlh-131-206的胺基酸序列不同並具有與DOMlh-131-206的CDR2序列為至少50%同一 性的CDR2序列的胺基酸序列。
8. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列，或者在不超過25個胺基酸位置與 DOMlh-131-206的胺基酸序列不同並具有與DOMlh-131-206的CDR3序列為至少50%同一 性的CDR3序列的胺基酸序列。
9. 抗-了即〇1型受體〇'即1?1巾55)免疫球蛋白單可變域，其含有與0011111-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列，或者在不超過25個胺基酸位置與 DOMlh-131-206的胺基酸序列不同並具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的⑶Rl序列和具有與DOMlh-131-206的⑶R2序列為至少50%同一性的⑶R2序列的氨 基酸序列。
10. 抗-TNFa I型受體（TNFR1 ;p55)免疫球蛋白單可變域，其含有與DOMlh-131-206 的胺基酸序列（顯示於圖3中）相同的胺基酸序列，或者在不超過25個胺基酸位置與 DOMlh-131-206的胺基酸序列不同並具有與DOMlh-131-206的CDRl序列為至少50%同一 性的⑶Rl序列和具有與DOMlh-131-206的⑶R3序列為至少50%同一性的⑶R3序列的氨 基酸序列。
【文檔編號】C07K16/28GK104311663SQ201410440384
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2008年6月4日 優先權日:2007年6月6日
【發明者】L.耶斯珀斯, M.普佩卡, I.湯林森, C.埃內弗 申請人:杜門蒂斯有限公司