一種纖維單胞菌科作為工業生物催化劑的應用的製作方法
2023-05-28 13:35:36
本發明屬生物化工領域，具體涉及一種纖維單胞菌科作為工業生物催化劑的應用。
背景技術：
紫杉烷類藥物，代表藥如紫杉醇、多烯紫杉醇，是目前最主要的抗癌藥之一(Nature Reviews Cancer 4,253-265(2004))。但由於結構複雜，化學合成困難，目前主要來自基於紅豆杉植株的生產工藝(Current Medicinal Chemistry 20,880-891(2013))。紅豆杉植株中紫杉醇本身的含量並不高(0.01％in bark of Taxus brevifolia)，一度出現過嚴重的資源危機。但一些紅豆杉植株中卻存在著大量的紫杉烷類前體化合物或衍生物，如10-DAXP在Taxus yunnanensis和Taxus mairei枝葉中的含量同10-DAB處於同一水平(～0.1％)，因而也是紫杉烷藥物的一個重要潛在來源。如果能夠從10-DAXP到紫杉醇完成高效轉化，將會大大提高自然資源的利用度，進一步解決紫杉醇資源危機。另外，10-DAB到紫杉醇需要合成側鏈再乙醯化需要11步反應和7步純化7，而10-DAXP則只需要去掉C-7木糖基後，C-10乙醯化即可得到紫杉醇。將10-DAB只用於多西紫杉醇的合成，將會節約大量的活潑化學試劑和有機溶劑，無論是資源的浪費、經濟成本還是對環境的危害，都會大大降低7。因此，10-DAXP資源的轉化利用研究一直是一個熱點。
前人的篩選結果顯示，已商業化的糖苷酶並未表現出10-DAXP水解活性。從自然界中篩選出的代謝水解菌或酶有Moraxella sp.13,Leifsonia shinshuensis14,Enterobacter sp.,Streptomyces matensi,Arthrobacter nicotianae,Achromobacter piechaudii,and Pseudomonas plecoglossicida16,and Lentinala edodes17等，其中來 自Lentinala edodes的木糖苷酶催化效率最高，對10-DAXP的Km為1.79±0.07mM，kcat為1.92s-1，但該效率完全無法到達上述DAXP工業化要求，該酶經重組表達為胞內酶後，難以富集和分離而導致催化效率受到更進一步限制。上述研究結果表明，10-DAXP的C-7木糖苷鍵的選擇性高效水解極具挑戰，需要全新的催化和穩定性結構才能完成。
此外，還有很多天然化合物都存在類似情況，如黃芪甲苷，薯蕷皂苷等等。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種纖維單胞菌科作為工業生物催化劑的應用，可將含木糖苷鍵或葡糖苷鍵的化合物水解而獲得相應的苷元。本發明使用微球菌亞目下的纖維單胞菌科所有已知菌屬的至少5個典型菌株或該菌株所產生的酶接觸含有至少一種木糖苷鍵或葡糖苷鍵的黃芪皂苷類、紫杉烷木糖苷類化合物，並水解相應的糖苷鍵。該方法可以製備至少一種上述糖苷化合物的苷元，也可以製備在轉化上述苷元的過程中所產生的具有藥理活性的中間產物。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案是：
一種纖維單胞菌科作為工業生物催化劑的應用，該纖維單胞菌科用於水解糖苷化合物的木糖苷和葡萄糖苷鍵，從而製備其相應的苷元或半水解產物；應用於生物醫藥領域、製備醫藥中間體，也可以用於能源、農業、食品領域，製備單糖或者其相應苷元。
所述的纖維單胞菌科為：Cellulomonadaceae及其所包含的種屬，包括Cellulomonas flavigena，Oerskovia enterophila，Oerskovia turbata，Demequina aestuarii，或者Actinotalea fermentans，(包括纖維單孢菌屬，厄氏菌屬,去甲基醌菌屬或光柱菌屬)。
所述的糖苷化合物為：帶有木糖基和/或葡萄糖基的化合物，如紫杉烷木糖苷類化合物，黃芪皂苷類化合物。
一種纖維單胞菌科作為工業生物催化劑的應用方法，按照以下步驟進行：
(1)粗酶液的製備：將纖維單胞菌通過發酵方法獲得粗酶液，培養基的組成包括1～10％％誘導劑，0.2～2％％氮源，0.2％～5％生長因子，0.2％～5％磷酸氫二鉀，發酵條件為20-40℃下振蕩培養；
(2)苷元或半水解產物的製備：用上述粗酶液水解糖苷化合物的木糖苷和葡萄糖苷鍵，糖苷化合物溶液與粗酶液以體積比1:10～1混合，孵育溫度為20-40℃，反應時間為1-6h；轉化後，可用乙酸乙酯萃取合併，減壓蒸乾後，上矽膠柱並用氯仿:甲醇進行洗脫，可得苷元或半水解產物。
所述的糖苷化合物溶液為紫杉烷木糖苷類化合物或黃芪皂苷類化合物。
所述苷元或半水解產物為7-羥基紫杉烷類化合物或者黃芪皂苷元。
所書糖苷化合物溶液的濃度為：0.01～100毫摩爾每升。
微球菌亞目下纖維單胞菌科的典型菌屬的至少5個典型菌株菌株(見圖1)，它們分別為Cellulomonas flavigena JCM 18109，Oerskovia enterophila JCM 7350(X83807)，Oerskovia turbata JCM 3160，Demequina aestuarii JCM 12213，Actinotalea fermentans JCM 9966。
所述生物學純的上述菌株或其發酵產生的水解酶，接觸至少一種含有木糖苷鍵或葡糖苷鍵的黃芪皂苷類、紫杉烷木糖苷類化合物，並水解相應的糖苷鍵，製備得到相應的苷元。
本發明提供的水解方法已考慮到具有上述分子結構的化合物的手性中心的所有立體構型，這些立體異構體或單獨被水解，或與其它立體異構體混合在一起被水解。
本發明提供的方法的實用價值在於：至今為止，未有關於上述纖維單胞菌科菌株水解上述糖苷化合物活力的報導。本發明提供該科屬菌株的新功能，及其在糖苷類化合物苷元及其半水解產物製備中的應用。
由植物材料提取的紫杉烷木糖苷和黃芪甲苷混合物用本發明提供的方法水解，效果很好。
附圖說明
圖1為：纖維單胞菌科和原小單胞菌科的進化關係及其對紫杉烷木糖苷的水解功能分布圖。
圖2為：7-木糖紫杉烷的轉化結果HPLC-UV圖；
其中(a)10-DAXP到10-DAP的生物轉化；(b)7-木糖紫杉烷混合物的轉化；1 10-DAXP,2 10-DAXC,3 10-DAXPc,1』10-DAP,2』10-DAC,3』10-DAPc,1」7-epi-10-DAP。
具體實施方式
以下實施例只是用於展示本發明的一些具體實施案例，而不是為了限制本發明的適用範圍的。
實施例1
粗酶液的製備
使用含1％澱粉，0.2％蛋白腖，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氫二鉀的培養基(滅菌前pH 7.0)作為培養基。將纖維單胞菌科(Cellulomonadaceae)的Cellulomonas flavigena菌，接種到上述培養基中，30℃下150rpm振蕩培養24h。發酵培養結束後，離心去細胞後，取上清，即為粗酶液。
實施例2
粗酶液的製備
使用含1％澱粉，0.2％蛋白腖，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氫二鉀的培養基(滅菌前pH 7.0)作為培養基。將纖維單胞菌科(Cellulomonadaceae)的Oerskovia enterophila或Oerskovia turbata菌，接種到上述培養基中，30℃下150rpm振蕩培養24h。發酵培養結束後，離心去細胞後，取上清，即為粗酶液。
實施例3
粗酶液的製備
使用含1％澱粉，0.2％蛋白腖，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氫二鉀的培養基(滅菌前pH 7.0)作為培養基。將纖維單胞菌科(Cellulomonadaceae)的Demequina aestuarii菌，接種到上述培養基中，30℃下150rpm振蕩培養24h。發酵培養結束後，離心去細胞後，取上清，即為粗酶液。
實施例4
粗酶液的製備
使用含1％澱粉，0.2％蛋白腖，0.2％酵母提取物，0.2％磷酸氫二鉀的培養基(滅菌前pH 7.0)作為培養基。將纖維單胞菌科(Cellulomonadaceae)的Actinotalea fermentans菌，接種到上述培養基中，30℃下150rpm振蕩培養24h。發酵培養結束後，離心去細胞後，取上清，即為粗酶液。
實施例5
黃芪甲苷IV的水解
在0.9ml實施例一中的粗酶液中加入1ml 50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)，再加入0.1ml黃芪甲苷IV的甲醇溶液(濃度為10mg/ml)。100rpm,35℃孵育 12小時後，以環黃芪醇標準品作對照，TLC分析，黃芪甲苷IV幾乎全部轉化為環黃芪醇。
實施例6
7-木糖-10-去乙醯紫杉醇水解製備10-去乙醯紫杉醇
將10ml 7-木糖-10-去乙醯紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)加入到90ml實施例一所述的粗酶液中，100rpm，30℃下反應20小時後，加入20ml乙酸乙酯萃取，合併上層有機相，減壓蒸乾，獲得固體物質，上矽膠柱(20g)並用氯仿:甲醇(98:2)進行洗脫，經HPLC-UV驗證(見附圖2)，圖中1 10-DAXP,2 10-DAXC,3 10-DAXPc,1』10-DAP,2』10-DAC,3』10-DAPc,1」7-epi-10-DAP得到10-去乙醯紫杉醇。
實施例7
黃芪甲苷IV的水解
在0.9ml實施例二或實施例三或實施例四中的粗酶液中加入1ml 50mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)，再加入0.1ml黃芪甲苷IV的甲醇溶液(濃度為10mg/ml)。100rpm,35℃孵育12小時後，以環黃芪醇標準品作對照，TLC分析，黃芪甲苷IV幾乎全部轉化為環黃芪醇。
實施例8
7-木糖-10-去乙醯紫杉醇水解製備10-去乙醯紫杉醇
將10ml 7-木糖-10-去乙醯紫杉醇的甲醇溶液(濃度為5mg/ml)加入到90ml實施例二或實施例三或實施例四所述的粗酶液中，100rpm，30℃下分別反映8 小時，12小時和24小時後，加入20ml乙酸乙酯萃取，合併上層有機相，減壓蒸乾，獲得固體物質，上矽膠柱(20g)並用氯仿:甲醇(98:2)進行洗脫，得到10-去乙醯紫杉醇。