供釋放抗癌藥的小顆粒脂質體氣霧劑的製作方法

2023-05-28 13:42:56

專利名稱：供釋放抗癌藥的小顆粒脂質體氣霧劑的製作方法
背景技術：
發明領域本發明總的涉及藥理學和癌症治療領域。特別是，本發明提供了通過吸入攜帶抗癌藥的脂質體水分散液來釋放小顆粒氣霧劑進入呼吸道的製劑和方法。
相關技術描述小顆粒脂質體氣霧劑治療由包入脂質體的脂溶性的或水溶性的抗癌藥構成，它可用從噴嘴噴霧器從水分散液進行給藥(參見美國專利5,049,388)。噴霧時產生的總的中位空氣動力學直徑為1-3微米的氣霧劑能靶向釋放到呼吸道的表面。沉積的脂質體接著在肺裡局部釋放藥物或在血液循環裡將藥物釋放到肺外組織。若藥物是脂溶的，它可能與脂質分子締合，締合的方式將所用的脂質、所用的抗癌藥物可能具特異性，它也可能被懸浮的水性介質裡包含的各種可溶性組分進一步改變。這類可溶性組分包括緩衝鹽和可能的肌醇，從而增加具表面活性的磷脂的合成和分泌入肺部組織，並使已存在的呼吸窘迫或由氣霧劑治療可能引起的窘迫減到最小(Hallman，M.等，患有呼吸窘迫症候群的早產兒的肌醇補充(Inositol Supplementation in Premature Infants with Respiratory DistressSyndrome)，N.Eng.J.Med.1992 3261233-1239)。
若藥物是水溶的，可通過合適的過程包入存在於多層的脂質體層(薄層)之間的同心空間裡的水性囊泡裡。可製備單層脂質體；但是，它們包容脂溶或水溶性藥物的能力會減少，因為截留被限制在中央囊泡裡。
氣霧劑水滴可含一種或多種藥物脂質體。噴霧將脂質體剪切成易於從噴霧器的噴嘴裡排出的大小。最大直徑達數微米的脂質體典型地被剪切成直徑小於500nm，根據噴霧器的操作特徵和其它變量直徑可變得更小。剪切包含於脂質體裡的水溶性藥物能釋放明顯數量的水溶性化合物，可能是50％。這不是它們使用的禁忌徵象，而表示給予了兩種形式的藥物製劑，其作用包括兩種形式中的每一種單狡給予時所產生的治療作用。美國專利5,049,388揭示了脂質體氣霧劑治療的許多其它細節。此外，也可通過混合含不同藥物的脂質體，或使用幾種藥物已被混合併一起包入脂質體而可能在氣霧劑脂質體治療時包括一種以上的藥物。
現有技術在供小顆粒氣霧劑釋放含抗癌藥的脂質體水分散液的製劑和方法上是有缺陷的。本發明滿足了本技術領域中該長期的需求。
發明綜述本發明的小顆粒脂質體氣霧劑化合物和治療方法涉及包入脂質體裡的脂溶或水溶的抗癌藥物。然後脂質體以水分散液從噴射噴霧器給藥。本發明顯示，通過氣霧劑肺部給藥後，藥物的全身吸收速度和效率比肌肉注射或口服給藥的更快、更有效。
本發明的一個目的是提供治療癌症的方法，包括通過小顆粒氣霧劑，向需要這類治療的個體的呼吸道釋放抗癌藥物的水分散液。用於本發明這個實施方案的抗癌藥物例子包括，但不限於，20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼、紫杉醇、紫杉醇-A、米託坦、甲氨蝶呤、巰嘌呤、洛莫司汀、幹擾素、5-氟尿嘧啶和依託泊甙。在更優選的實施方案中，抗癌藥選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼和紫杉醇。另外，在本發明優選的實施方案裡，通過噴射噴霧器釋放抗癌藥。
本發明的另一個目的是提供通過含抗癌藥和脂質的小顆粒氣霧劑釋放抗癌藥的脂質體，其中抗癌藥的濃度不超過製劑總體積的約10％，抗癌藥與合適溶劑的比率範圍是約1∶1到約1∶200，優選的是約1∶10到約1∶100，最好是約1∶10到約1∶50(重量∶重量)。一個特別好的實施方案包括9-硝基-喜樹鹼和二月桂醯磷脂醯膽鹼，其比率為約1∶10到1∶50(重量∶重量)；特別優選的實施方案是約1∶50wt∶wt的9-硝基-喜樹鹼和二月桂醯磷脂醯膽鹼。另一個實施方案提供了通過含約1∶30wt∶wt的紫杉醇和二月桂醯磷脂醯膽鹼的小顆粒氣霧劑釋放抗癌藥物的脂質體。
本發明另一個實施方案提供了由下列步驟產生的脂質體將脂溶性的抗癌藥物溶於適合溶解抗癌藥物的溶劑裡得到溶解的抗癌藥；將溶解的抗癌藥物加入溶解的適合配製並通過氣霧劑釋放藥物的脂質，以形成溶液，其中溶解的抗癌藥物濃度不超過溶液總體積的約10％，抗癌藥物與脂質的比的範圍為約1∶1到約1∶200，優選的是約1∶10到約1∶100，最優選的範圍是約1∶10到約1∶50(wt∶wt)；冷凍和凍幹此溶液。此時，溶液可冷凍貯存供以後使用，或溶於無菌水供使用，形成懸浮液，其中抗癌藥物在懸浮液無菌水裡的濃度不超過約5.0mg/ml。
本發明優選的實施方案提供了由下列步驟製備的20-S-喜樹鹼(CPT)、9-硝基喜樹鹼(9-NC)和其它脂溶性喜樹鹼衍生物的脂質體製劑製備所述20-S-喜樹鹼(CPT)、9-硝基喜樹鹼(9-NC)或其它脂溶的喜樹鹼衍生物和脂質在相容溶劑裡的濃儲備溶液；將合適體積的20-S-喜樹鹼(CPT)、9-硝基喜樹鹼(9-NC)或其它脂溶喜樹鹼衍生物和脂質的濃儲備溶液加入一定體積的叔丁醇中，形成第二種溶液，其中所述20-S-喜樹鹼(CPT)、9-硝基喜樹鹼(9-NC)和其它脂溶喜樹鹼衍生物的濃度不超過所述第二種溶液的10％，其中第二種溶液裡的藥物與脂質的比範圍為約1∶1到約1∶200，優選的範圍為約1∶10到約1∶100，最好範圍為約1∶10到約1∶50(wt∶2t)；冷凍所述的第二種溶液；凍幹所述的第二種溶液，以形成粉末製劑。此時，粉末製劑可冷凍貯存供以後使用或溶於無菌水，形成懸浮液，其中所述抗癌藥物在所述懸浮液裡的濃度不超過約5毫克/毫升。
更特定的實施方案提供了由下列步驟製備的脂質體製備抗癌藥的濃儲備溶液，如100毫克CPT在1毫升叔丁醇裡，或100毫克9-NC在DMSO裡，製備脂質的儲備溶液，如100毫克DLPC在1毫升叔丁醇裡；將合適體積的所述濃儲備溶液加到一定體積的叔丁醇裡，形成第二種溶液，其中最終體積約10毫升，DMSO的體積不超過所述最終體積的10％(體積∶體積)，抗癌藥物的濃度不超過最終體積的10％(wt∶wt)，其中藥物與脂質的比範圍約為1∶1到1∶200，優選的範圍是約1∶10到約1∶100，最好的範圍比約1∶10到約1∶50(wt∶wt)；冷凍所述的第二種溶液；凍幹所述的冷凍溶液，製備粉末製劑。然後粉末製劑可冷凍貯存供以後使用，或溶於無菌水，形成懸浮液。一般來說，懸浮液裡的抗癌藥物濃度不超過約5毫克/毫升。
本發明另一個優選的技術方案提供了由下列步驟形成的脂質體使紫杉醇與合成的α卵磷脂二月桂醯磷脂醯膽鹼混合；使紫杉醇-DLPC溶於叔丁醇，以製備製劑；冷凍和凍幹製劑。通過在高於25℃的溫度下加入無菌的純水來製備脂質體，其中紫杉醇與二月桂醯磷脂醯膽鹼的最終濃度比為約1∶1到約1∶200，優選的範圍為約1∶10到約1∶100，最好的範圍為約1∶25到1∶40(wt∶wt)。除了α卵磷脂外，也可使用其它天然或合成的卵磷脂，包括，但不限於蛋黃磷脂醯膽鹼、氫化大豆磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二油醯二棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼和二棕櫚醯磷脂醯膽鹼。
可這樣試驗9-NC和其它喜樹鹼衍生物和抗癌藥物包入脂質體的效率使凍幹的藥物-脂質體製劑的水分散液在PercollTM梯度上成層，並離心。在試管底部收集未包入的藥物，在Percoll梯度和水相之間的界面處收集包入脂質體的藥物。當在偏振光下用顯微鏡檢查藥物-脂質體分散液時，可觀察藥物晶體來對包裹效率進行定性試驗。其他方法是，如用分析的HPLC方法定量分析未包裹的、晶體藥物。
本發明的其它方面和進一步特徵和優點從下列對本發明優選實施方案的描述中可得以了解。這些實施方案僅供闡述用。
附圖簡述所附的附圖包含於本文，以便清楚和詳細地理解本發明的上述特徵、優點和目的。這些附圖形成了說明書的一個部分。但是，值得注意的是，附圖僅描述本發明優選的實施方案，不能認為限定本發明的範圍。


圖1顯示9-NC-DLPC脂質體氣霧劑對裸鼠中異種移植的人體乳腺癌的治療作用。
圖2顯示9-NC-DLPC脂質體氣霧劑對選自圖1的小鼠的進一步治療的作用。
圖3顯示9-NC-DLPC脂質體氣霧劑對裸鼠中異種移植人體結腸癌(Squires)的治療的作用。
圖4顯示9-NC-DLPC通過脂質體氣霧劑或通過口服治療對裸鼠中人體肺癌異種移植物(Spark)生長的作用，通過測量腫瘤體積來定量。
圖5顯示用Aerotech II型噴霧器輸出的紫杉醇-DLPC脂質體(1∶30；1毫克/毫升)。
圖6顯示從圖5所述的製劑裡回收的紫杉醇；紫杉醇-DLPC劑量為15bpm，500ml TV。
發明詳述現給出下列定義。未作特別定義的術語表示含義與本技術領域常規的相同。本文使用的術語「氣霧劑」指固體或液體顆粒在空氣中的分散液，所述的顆粒足夠細小，因此沉降速率低，有相對的空中漂浮穩定性(參見Knight，V.，呼吸道的病毒和支原體感染，1973，Lea和Febiger，Phila.Pa.，pp2)。「脂質體氣霧劑」由水性液滴構成，其中分散著一種或多種含欲釋放到人體或動物呼吸道的一種或多種藥物的脂質體顆粒(Knight，V.和Waldrep，J.C.供釋放哮喘類藥物的脂質體氣霧劑；也參見Kay，B.，過敏和過敏性疾病，1997，BlackwellPublications，英國牛津，第I卷，pp730-741)。本申請氣霧劑液滴的大小如美國專利5,049,338所述，即總的中位空氣動力學直徑(MMAD)為1-3微米，幾何標準偏差約1.8-2.2。但是，對於低濃度9-NC和可能的其它喜樹鹼衍生物，MMAD會低於1微米，如0.8微米。基於本發明揭示的研究，當脂質體與周圍相對溼度平衡時，脂質體可基本上構成所有體積的液滴。
本文使用的「Weibel肺模型」指一類人體肺結構，它可識別出人體氣道的23個連續的分支。氣管標記為0，支氣管和細支氣管延伸到16。氣道的這些部分含纖毛上皮和粘液腺體。它們一起構成了黏膜纖毛覆蓋物。分支17-23構成了肺部的肺泡，沒有黏膜纖毛覆蓋物。因此，沉積在此的顆粒不會沿著氣管上升而被吞下。
本文使用的術語「20-S-喜樹鹼」或「CPT」指具有抗癌性質的植物生物鹼。
本文使用的術語「9-硝基-喜樹鹼」或「9-NC」、「9-氨基-喜樹鹼」或「9-AC」和「10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼」或「MDC」指衍生自20-S-喜樹鹼的活性抗癌藥物，它們在水裡不溶，在某些脂質溶劑裡可溶。
本文使用的術語「二月桂醯磷脂醯膽鹼」或「DLPC」是用於配製脂質體的脂質。
本發明涉及治療癌症的方法，包括通過小顆粒氣霧劑向需要這類治療的個體的呼吸道釋放抗癌藥物的水分散液。在本發明優選的實施方案裡，抗癌藥物選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼和10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼。另外，在本發明優選的實施方案裡，優選的是通過噴射噴霧器釋放抗癌藥物。
另外，提供了通過小顆粒氣霧劑釋放抗癌藥物的含抗癌藥物和脂質的脂質體，其中抗癌藥物濃度不超過製劑總體積的約10％，抗癌藥物與合適溶劑之比範圍約1∶1到1∶200，優選的範圍約1∶10到約1∶100，最優選的範圍是約1∶10到約1∶50(wt∶wt)。本發明一個特定的實施方案包括9-硝基-喜樹鹼和二月桂醯磷脂醯膽鹼之比為約1∶10到約1∶50wt∶wt；特別優選的實施方案是9-硝基-喜樹鹼和二月桂醯磷脂醯膽鹼之比為約1∶50wt∶wt。
紫杉醇是另一種脂溶的抗癌藥，可容易地包入脂質體製劑。紫杉醇和二月桂醯磷脂醯膽鹼的最佳比為約1∶1到約1∶200，較好的範圍為約1∶10到約1∶100，更好的範圍為約1∶25到約1∶40(wt∶wt)。優選的形式是紫杉醇與DLPC的比為約1∶30。紫杉醇溶於叔丁醇，不使用DMSO，而一些喜樹鹼使用DMSO。紫杉醇脂質體製劑與喜樹鹼製劑其它方面是相似的。
進一步的是，本發明涉及通過小顆粒氣霧劑釋放抗癌藥物的脂質體，它通過下列步驟製備使脂溶的抗癌藥物溶於適合溶解抗癌藥的溶劑裡，以得到溶解的抗癌藥物；將溶解的抗癌藥物加到溶解的適合配製並通過氣霧劑釋放藥物的脂質裡，以製備溶液，其中溶解的抗癌藥物的濃度不超過溶液總體積的約10％，抗癌藥物與合適溶劑的比的範圍為約1∶1到約1∶200；冷凍和凍幹溶液。此時，溶液可冷凍貯存供以後使用，或溶於無菌水，以製備懸浮液，其中懸浮液裡無菌水中的抗癌藥物濃度不超過約5.0毫克/毫升。本發明特別優選的實施方案提供了通過下列步驟製備的脂質體將選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼和10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼的脂溶性抗癌藥物溶於100％DMSO，以製備溶解的抗癌藥物；將所述的溶解的抗癌藥物加到溶於叔丁醇的二月桂醯磷脂醯膽鹼中，以製備溶液，其中溶解的抗癌藥濃度不超過溶液總體積的約5％，抗癌藥與二月桂醯磷脂醯膽鹼的比為約1∶50。冷凍溶液，並凍幹過夜。為了使用，將凍幹的溶液懸浮於合適體積的無菌蒸餾水裡。另外，可使用本技術領域公知的其它的脂質體製備方法，如以旋轉蒸發代替凍幹。
這樣製備9-NC-DLPC氣霧劑首先將藥物溶於DMSO；為了溶解，需要加熱到50-60℃。將該溶液加到較大體積的叔丁醇裡，以使DMSO溶液不超過合併的叔丁醇和DMSO總體積的5-10％。在液氮下從溶液裡蒸發除去有機溶劑DMSO和叔丁醇，得到淡黃色粉末。為了使用，向含適當濃度藥物的小瓶裡加入無菌蒸餾水，並將其加入噴霧器的容器裡。使用Aerotech IITM噴霧器(CIS-USA，Inc.，美國馬裡蘭Bedford)，但也可使用能形成相似的氣霧劑的噴霧器。
本發明特別的實施方案涉及下列步驟形成的脂質體使紫杉醇與合成的α卵磷脂二月桂醯磷脂醯膽鹼混合；將紫杉醇-DLPC溶於叔丁醇，以製備溶液；冷凍和凍幹溶液。通過在高於25℃的溫度下加入無菌純水製備脂質體，其中紫杉醇與二月桂醯磷脂醯膽鹼的最終濃度為約1∶1到約1∶200，優選的範圍是約1∶10到約1∶100，更優選的範圍是約1∶25到1∶40(wt∶wt)。
本發明的藥物組合物可用於氣霧劑向呼吸道釋放攜帶抗癌藥物的脂質體的水分散液。本技術領域人員不需經過多的實驗即可容易地決定這些氣霧劑製劑的合適劑量。供體內治療時，本發明的氣霧劑製劑以治療有效量，即能消除或減少腫瘤負載的量給予病人。像所有的藥品一樣，劑量和劑型方案可根據癌症性質(原發或轉移的)、特定藥物的特徵(如其治療指數)、病人、病史和其它因素而定。氣霧劑量典型的範圍，對於9-NC是約8微克/kg病人體重/天到約100微克/kg病人體重/天。劑量和劑型方案根據本技術領域公知的因素而定。參見Remington’sPharmaceutical Sci.，第17版(1990)Mark Publishing Co.，Easton，Penn；以及Goodman和Gilman’s治療的藥理學基礎(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第8版(1990)Pergamon Press.
本發明的小顆粒脂質體氣霧劑化合物和治療方法涉及包入脂質體的脂溶或水溶的抗癌藥物。脂質體以噴射噴霧器放出的水分散液給藥。可使用各種抗癌藥，包括20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼和紫杉醇。
下列實施例供闡述本發明的各種實施方案，並非用來限定本發明實施例1抗癌藥物CPT和它的9-NC衍生物本發明代表性的抗癌藥物是20-S-喜樹鹼和它的9-NC衍生物。其它的喜樹鹼，如9-AC和10，11-MDC以及本技術領域公知的其它抗癌製劑也具有適合使用的性質。所有這些抗癌藥物可用於脂質體製劑。
表1顯示對人體、狗和小鼠口服給藥後，9-NC的血液或血漿濃度，和達到血藥峰濃度的時間的比較。(Hinz，H.R.等，人體、狗和小鼠中9-硝基20-(S)-喜樹鹼體內和體外轉化為9-氨基-20-(S)-喜樹鹼的藥物動力學。癌症研究(Cancer Research)1994 543096-3100)。單劑口服的劑量範圍對於人體和狗是0.1-1.0mg/kg，對於小鼠是4.1mg/kg。CPT和9-NC的藥物動力學可能有些不同，但合理的可能性是前述的不同是由兩種藥物的性質可以預見的。
表1 單劑口服、鼻內給藥或氣霧劑給藥後比較9-NC的血液濃度或血漿濃度
*鼻內製劑和氣溶膠從Baylor Aerosol實驗室得到，其它來自Hinz，H.R.(參見正文供參考)。
表2 揭示了對小鼠計算氣霧劑劑量的方法，這是確定表1中引證的劑量的基礎。由於齧齒動物複雜的鼻子結構，所以許多吸入的藥物沉積在小鼠的鼻咽處。相似的是，滴鼻導致鼻咽處沉積是大。沉積在此的物質迅速轉運到食道口，並被吞下。但吸入的氣霧劑約10-15％會滲透進入外周肺部。
在用口腔呼吸的人體中，只有少量氣霧劑顆粒會沉積在口腔裡，事實上在鼻咽處沒有沉積。沉積在中央氣道中的物質通過粘液纖毛運動會返回咽部，在此它被吞下。對於常在支氣管分支處發生的原發肺部腫瘤，藥物會沉積在腫瘤的表面，並被直接吸收進入腫瘤塊。沉積在第16Weibel層次以下的物質不受纖毛上皮作用，故不會向上移動；這樣在周圍肺實質中的腫瘤裡，藥物會沉積在相鄰區域，並直接吸收進入腫瘤塊。另外，本發明最大的優點是沉積在不受纖毛上皮作用的部位的藥物被組質間隙裡的毛細血管和肺部的淋巴管獲得，會進入循環。
表2 以氣霧劑給藥時，9-NC在不同種對象中沉積劑量的計算
*K(成人)0.108L-分鐘/kg×0.7假設經鼻和口呼吸，僅經口＝1/2K(棉鼠)0.7L-分鐘/kg×0.5K(小鼠)1L-分鐘/kg×0.3K(狗，金黃色)0.2L-分鐘/kg×0.5**每次治療後評估的峰值分泌體積＝1毫升/kg***來自Patton(3570)和Philadelphia info的數據；人僅經口呼吸。
表3顯示DLPC脂質體氣霧劑噴霧15分鐘後CPT的組織分布。沉積的劑量計算值為486ng/小鼠。肺部和肝臟的平均濃度與其它被檢查的部位的較小濃度相似。表4顯示在鼻內滴入7微克/小鼠(233微克/kg)後一小時裡組織的分布。藥物迅速從肺部清除，結果停止噴霧後15分鐘，肺部只存在可忽略量的藥物。肝臟、腎臟和脾臟開始有明顯量的藥物，在研究的一小時裡逐漸消除。有趣的是，血藥濃度在整個研究中極低。這些研究表明，藥物在肺部大量即刻沉積，並從內臟裡迅速清除。經吞咽而吸收的藥物的量是不確定的。
表3 吸入CPT脂質體氣霧劑15分鐘後CPT的組織分布
用Aerotech II噴霧器在流速10升/分時操作產生氣霧劑，噴霧器中脂質體製劑的CPT濃度為0.2mg/ml。
表4 鼻內給藥後CPT的時間依賴的器官分布
說明CPT以脂質體製劑給藥，所述的脂質體製劑用DLPC製備，最初的藥物濃度為0.2mg/ml。
每個動物滴入35微升分散液(每個時間點處理3個動物/組)。
表5顯示肌肉注射CPT後藥物在血液和內臟裡的分布。在肌肉注射後最初12小時裡藥物從注射部位的消失很慢，肝臟裡只檢測到極小的濃度，事實上藥物在其它部位不存在。整個研究中血液中的藥物濃度可以忽略。給藥劑量與滴鼻相同。這些發現表明肺部給藥比肌內途徑給藥的全身吸收速度更快，更有效。可能是器官和血管腔裡的沉積會增加暴露於白蛋白分子和使藥物降解成羧基形式的機會。
表5 肌內給藥後CPT的時間依賴性器官分布
說明將CPT在DMSO裡的5毫克/毫升原始儲備液懸浮於鹽水(1.4微升儲液+48.6微升鹽水)，每個小鼠總共肌內注射50微升懸浮液。
每個時間點處理3個動物/組。
實施例2由DLPC和9-AC構成的脂質體的溶解度表6顯示了9-NC和DLPC重量比固定於1∶50(w/w)，但藥物從濃度0.1mg/ml增加到1.0mg/ml的脂質體的穩定性。樣品在各種條件下於渦動後試驗在噴霧開始前，噴霧1.5-2分鐘後(樣品取自噴霧器貯庫中的液體)，以及用全玻璃衝擊器(All-Glass Impinger，Ace Glass Co.，美國新澤西Vineland)收集的氣霧劑。表6 製備9-NC DLPC脂質體製劑時的脂質體粒徑和藥物晶體
最穩定的製劑是濃度最低的製劑。噴霧後少量晶體在貯庫裡出現。由於與噴霧相關的剪切力，噴霧使脂質體粒徑減少10倍。從氣霧劑回收的脂質體顆粒的粒徑進一步減少。該發現與選擇較小的顆粒供氣霧劑發射是一致的。缺少晶體提示晶體不象脂質體那樣易於噴霧。脂質體劑量較大時，噴霧後粒徑變小，但從氣霧劑回收的顆粒的粒徑與在噴霧器的藥庫裡循環的顆粒粒徑相比並不變小。
實施例3內酯環打開的動力學將一些喜樹鹼溶於水性介質後，其抗腫瘤活性消失。這是由於α-羥基內酯環(環E)可水解。該改變起因於醯基裂解，得到分子無生物活性的羧酸鹽形式。藥物的內酯環形式在脂質體裡被掩蔽(Burke，T.G.，生物化學(Biochemistry)1993，325352-5364)，但藥物的羧基形式對人體血清白蛋白有高親合力。這導致內酯在人體血清白蛋白存在下迅速轉化為羧酸鹽，從而失去了抗癌活性。在幾乎沒有白蛋白和/或與脂質體成分物相互作用的肺內肺泡表面沉積很顯然可以保存9-NC的抗癌作用。
實施例49-NC對小鼠中人體乳腺癌移植物生長的作用圖1顯示了用9-NC-DLPC脂質體氣霧劑治療期間皮下乳腺癌異種移植物的生長。有6個小鼠進行9-NC治療，另有和5個對照小鼠。每天治療15分鐘，每周5天。劑量是8.1微克/千克/天。每一小鼠呼吸道中沉積的劑量估計為234ng/天。對腫瘤大小數據標準化，在治療第17天兩組腫瘤大小(最初腫瘤大小的％)有明顯的分歧(p＜0.011)。此後，由於大的壞死腫瘤塊存在而使對照小鼠死亡。圖2顯示其中兩個經處理的小鼠於16天不處理之後，再用較高劑量藥物處理，的病程。用5倍量的9-NC脂質體氣霧劑再開始治療數天後，被治療動物的腫瘤迅速減小，於開始治療後的第85天不再看到腫瘤。
實施例59-NC對小鼠中人體結直腸癌異種移植物的作用在帶有人體結腸癌異種移植物的裸鼠裡進行相似的研究，結果如圖3所示。有15個被治療小鼠和20個對照小鼠。10個對照動物接受空的DLPC脂質體，10個不接受處理。不接受治療或只接受DLPC的對照動物的腫瘤均迅速增大，到第36天發生死亡。對照小鼠的腫瘤生長總速率比用9-NC-治療小鼠的速率大7～11倍。治療小鼠被分成兩組，每組10個。一組接受77微克/kg/天，每周治療五天，貫穿整個實驗。另一組接受77微克/kg/天，每周5天，直到第35天，此時，劑量增加到153微克/kg/天，每周治療5天，直到第46天，此時劑量增加到307微克/kg，給藥方案相同，直到第61天。接受較高劑量的小鼠腫瘤大小增加稍慢，但其差異統計學上不顯著，圖中組合了這些數據。在DLPC處理組裡的四個小鼠由於在第61天之前大腫瘤或腫瘤壞死而死亡，未處理組的6個小鼠在第61天前因相同的原因死亡。治療組5個小鼠因腫瘤壞死或衰弱而於第61天前死亡。高劑量組的小鼠消瘦提示藥物有毒性。另一個處理的小鼠由於直腸下垂而死亡。基於第28天腫瘤生長速度減慢(p＜0.007，Student t-試驗，雙例)和死亡率減少的觀察，9-NC治療有明確的治療作用(p＜0.002-chi方試驗)。
實施例69-NC對裸鼠中人體肺癌異種移植物的作用另外，通過測量腫瘤體積來研究通過脂質體氣霧劑或通過口服給藥，9-NC-DLPC治療對裸鼠中人體肺癌異種移植物(Spark)生長的作用。腫瘤移植後約2周開始治療。對照動物顯示腫瘤的體積迅速增加。口服接受脂質體藥物水懸浮液，劑量為100微克/kg/天(為氣霧劑劑量的兩倍以上)動物對治療沒有反應。參見圖4。
氣霧劑和口服製劑劑量在第13天加倍。增加劑量後，氣霧劑治療的小鼠中的腫瘤變小，但口服治療的小鼠中腫瘤大小沒有減小。因此，儘管對小鼠進行氣霧劑給藥有一半或更多劑量沉積在鼻、頭部、氣管和上部支氣管，它被粘液膜纖毛系統迅速運送到食管，在此被吞下，吸入的藥物中沉積在肺部的部分主要對腫瘤生長起作用。
氣霧劑給藥的清除效率最可能的解釋是藥物快速進入循環，由此它返回左心，然後到大動脈和外周循環。因此，藥物在「首過」時得到達腫瘤而不經過會從血液中除去大量藥物的肝臟。
實施例7動物模型裸鼠這些實驗中使用瑞士免疫缺陷裸鼠NIH-1高繁殖株，由Stehlin協會哺育和安置(Giovella，B.C.等，用20-(S)-喜樹鹼治療便裸鼠的人體癌異種移植物的生長完全抑制。癌症研究(Cancer Research)1991 513052-3055)。
人體癌異種移植物人體異種移植物建立於裸鼠。為了移植，將在0.5毫升Eagles最低必需培養其中的溼重約50毫克的細細切碎的腫瘤注射到右背側胸部的皮膚下。在腫瘤移植後約10天對動物開始用實驗藥物治療。用卡鉗測量乳腺癌的二維大小(即面積)，而結腸癌則用卡鉗測量三維尺寸(即體積)。
實施例8喜樹鹼脂質體氣霧劑製劑和給藥由Stehlin協會(美國德克薩斯州Houston)的Beppino Giovanella博士提供CPT和9-硝基喜樹鹼。從Avanti Polar Lipids(美國阿拉斯加Pelham)得到DLPC。從Cis-USA，Inc.(美國馬裡蘭Bedford)得到Aerotech II噴霧器。
為了配製脂質體，將9-NC(100毫克/毫升)或CPT(10毫克/毫升)溶於100％DMSO，並將其加到溶於叔丁醇(40℃)中的DLPC裡，結果最終的DMSO濃度不超過總體積的5％，藥物與脂質體的比率為1∶50(w/w)。最終的懸浮液是澄清的。若發生沉澱，再加熱到50-60℃。使製劑在液氮裡冷凍，並凍幹過夜。使物質溶於無菌水以得到合適的藥物濃度供使用，任一藥物均不超過1.0mg/ml。通過在偏振光下以顯微鏡定性檢查在脂質體裡藥物的包裹效率。未包入的藥物為雙折射晶體。通過使脂質體的水懸浮液在PercollTM梯度中離心來考察包裹效率。1/10毫升懸浮液在2毫升梯度上分層，以2000轉/分鐘離心25-30分鐘。脂質體層在水-Percoll界面上，而未包入的藥物在試管的底部沉積。許多其它脂質可代替DLPC進行配製並將脂質體通過氣霧劑釋放藥物(Sugarman，S.M.等，與脂質複合的喜樹鹼配製以及初步生物分布和抗腫瘤活性研究。Cancer Chemotherapy Pharmacol.1996 37531-538)。
實施例9HPLC分析Waters(美國馬裡蘭Milford)710B Wisp自動進樣器和Waters Nova-Pak C18柱在室溫時用於定量CPT和9-NC。流動相是30％乙腈和70％0.1％冰乙酸。設置激發波長370納米、發射波長是440納米，用Waters 470掃描螢光檢測器檢測CPT。用Waters 440吸光檢測器於254納米檢測9-NC。數據用Waters Millenium軟體分析。
實施例10氣霧劑液滴測定根據以前的方法(Waldrep，J.C.等，J.Aerosol Med.1994 7135-145)，氣霧劑液滴的大小用Andersen ACFM無生命環境顆粒篩析取樣器測定(AndersenInstruments，Inc.Atlanta，Ga)。用KaleidaGraph 2.0(SynergySoftware，Reading Pa.)測定總的中位空氣動力學直徑和幾何標準差。氣霧劑液體由脂質體的水懸浮液構成。脂質體直徑在水懸浮液裡用3300型NICOMP雷射顆粒測徑器測定。
實施例11通過氣霧劑釋放的紫杉醇-DLPC脂質體的製備和效應紫杉醇是另一類脂溶的、很容易包入脂質體製劑的抗癌藥物。紫杉醇可直接溶於叔丁醇而不與喜樹鹼相似地使用DMSO。紫杉醇脂質體製劑其它方面與喜樹鹼相同。
紫杉醇與DLPC的最佳比是約1∶30wt∶wt。適合噴霧和氣霧劑給藥的製劑每毫升用1毫克紫杉醇和30毫克DLPC生成。最佳的紫杉醇-DLPC脂質體，是使5毫克紫杉醇與150毫克合成的α卵磷脂二月桂醯磷脂醯膽鹼(DLPC)混合。在37℃下使藥物/DLPC在20毫升叔丁醇裡攪拌混合。混合後，將藥物/脂質製劑吸入玻璃小瓶中，迅速冷凍，凍幹過夜以除去叔丁醇，得到粉末。這樣製備多層脂質體在DLPC相變溫度(Tc)25℃之上加入5毫升超純水，以釋放最終的標準藥物濃度為每毫升1毫克紫杉醇30毫克DLPC。使混合物在室溫下保溫30分鐘，間歇混合以產生多層囊小泡(MLV)脂質體。取出一分供HPLC測定藥物濃度。
圖5顯示紫杉醇-DLPC脂質體氣霧劑的粒徑分布為1.4MMAD微米，幾何標準偏差為2.0，圖6顯示從圖5所述製劑裡回收的紫杉醇。在用於測量從噴霧器(Aerotech II)噴出的紫杉醇的肺模型(Harvard呼吸器)中，87.75升氣霧劑被取樣，得到3000微克紫杉醇。因此氣霧劑濃度為34.2微克/升。從該信息可計算出，吸入後沉積在呼吸道的氣霧劑劑量。
本說明書裡提及的任何專利或出版物表明本發明涉及的本技術領域的水平。進一步的是，這些專利和公開物包括入本文的程度，似乎每一出版物特別或個別地需要包括在本文中供參考。
本技術領域人員能很容易地了解到本發明適合實施各個目的並得到提及的結果和優點，以及本文隱含的目的、結果和優點。所提出的實施例及其方法、過程、治療、分子和特定的化合物是代表性的優選的技術方案，供例舉，而並非用來限定本發明的範圍。本技術領域人員對其進行的改變和其它的用途，包括在如權利要求書所限定的範圍的本發明精神裡。
權利要求
1.一種治療癌症的方法，包括步驟通過小顆粒氣霧劑，向需要這類治療的個體的呼吸道釋放脂質體中抗癌藥物的水分散液。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的抗癌藥物選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼、紫杉醇、紫杉醇-A、米託坦、甲氨蝶呤、巰嘌呤、洛莫司汀、幹擾素、5-氟尿嘧啶和依託泊甙。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述的抗癌藥選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼和紫杉醇。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的釋放步驟通過噴射噴霧器進行。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述的脂質體被所述的噴射噴霧器剪切成直徑低於500納米。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗癌藥物在所述脂質體裡的最終濃度不大於5.0mg/ml。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述抗癌藥物在所述脂質體裡的最終濃度不大於1.0mg/ml。
8.一種通過小顆粒氣霧劑釋放抗癌藥物的脂質體，其中抗癌藥物與脂質的比約1∶1到約1∶200wt∶wt。
9.根據權利要求8所述的脂質體，其中抗癌藥物與脂質的比約1∶10到1∶100wt∶wt。
10.根據權利要求9所述的脂質體，其中抗癌藥物與脂質的比約1∶10到1∶50wt∶wt。
11.根據權利要求8所述的脂質體，其中所述抗癌藥物是喜樹鹼或喜樹鹼的衍生物，所述脂質是二月桂醯磷脂醯膽鹼，所述比是約1∶10到約1∶50。
12.根據權利要求8所述的脂質體，其中所述抗癌藥物是紫杉醇或其衍生物，所述脂質是二月桂醯磷脂醯膽鹼，所述比是約1∶25到約1∶40。
13.一種脂質體，它由下列步驟產生將脂溶的抗癌藥物溶於合適溶劑，以得到溶解的抗癌藥物；在合適的溶劑裡溶解脂質，所述的脂質適合於製劑並能通過氣霧劑釋放抗癌藥物，以得到溶解的脂質；混合所述的溶解的抗癌藥物和所述的溶解的脂質，以產生溶液，其中所述的溶解的抗癌藥物的濃度不超過所述溶液總體積的約10％，所述抗癌藥物與所述合適脂質比率的範圍為1∶1到1∶200wt∶wt；從所述溶液裡蒸發所述溶劑，以得到粉末。
14.根據權利要求13所述的脂質體，它進一步包括將所述粉末溶於無菌水以得到懸浮液，其中所述抗癌藥物在所述無菌水裡的濃度不超過約5.0mg/ml。
15.根據權利要求13所述的脂質體，其中所述適合製劑並通過氣霧劑釋放藥物的合適脂質是二月桂醯磷脂醯膽鹼。
16.根據權利要求13所述的脂質體，其中所述的抗癌藥物選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼、紫杉醇、紫杉醇-A、米託坦、甲氨蝶呤、巰嘌呤、洛莫司汀、幹擾素、5-氟尿嘧啶和依託泊甙。
17.根據權利要求13所述的方法，其中所述的抗癌藥選自20-S-喜樹鹼、9-硝基-喜樹鹼、9-氨基-喜樹鹼、10，11-亞甲基二氧基-喜樹鹼和紫杉醇。
18.根據權利要求13所述的脂質體，其中抗癌藥物與脂質的比約1∶10到1∶100wt∶wt。
19.根據權利要求18所述的脂質體，其中抗癌藥物與脂質的比約1∶10到1∶50wt∶wt。
20.一種脂質體，它由於下列步驟形成將選自20-S-喜樹鹼(CPT)、9-硝基喜樹鹼(9-NC)和其它脂溶性喜樹鹼衍生物的脂溶的抗癌藥物溶於一定體積的DMSO，以得到溶解的抗癌藥物；使所述溶解的抗癌藥物與合適溶劑混合；使適合配製並通過氣霧劑釋放藥物的脂質溶於合適的溶劑，以得到溶解的脂質；混合所述溶解的抗癌藥和所述溶解的脂質，以得到溶液，其中所述DMSO的濃度不超過所述溶液總體積的約10％，所述抗癌藥物與所述合適的脂質的比例範圍是1∶1到1∶200；從所述溶液蒸發所述溶劑，得到粉末。
21.根據權利要求20所述的脂質體，其中所述脂質是二月桂醯磷脂醯膽鹼。
全文摘要
本發明涉及小顆粒脂質體氣霧劑化合物和治療方法,它涉及將脂溶或水溶的抗癌藥包入脂質體。水分散體中的脂質體從噴射噴霧器對個體的呼吸道給藥。可使用各種抗癌藥物,包括20－S－喜樹鹼、9－硝基—喜樹鹼、9－氨基—喜樹鹼、10,11－亞甲基二氧基—喜樹鹼和紫杉醇或其衍生物。通過吸入給予這些藥物使抗癌藥物的吸收比肌內給藥或口服給藥的吸收更快更有效。
文檔編號A61K31/519GK1271275SQ98809371
公開日2000年10月25日 申請日期1998年9月23日 優先權日1997年9月23日
發明者J·V·萘特, G·吉爾伯特, J·C·瓦爾德普, N·科什金, C·W·韋倫, B·焦萬埃拉 申請人:研究發展基金會