一種與鉑類化療藥物肝臟毒性相關的snp標誌物及其應用的製作方法
2023-05-28 01:57:01
一種與鉑類化療藥物肝臟毒性相關的snp標誌物及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程及腫瘤學領域，公開了一種與鉑類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物及其應用。該標誌物為rs6681909、rs4140932、rs13131227、rs4446279、rs17053350、rs9402873、rs16878272、rs13267737、rs7008590、rs947853、rs2838566、rs1383888、rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rs1048037和rs10086636的組合。該標誌物及引物探針可用於製備鉑類化療藥物肝臟毒性診斷試劑盒，靈敏度和特異度較好。
【專利說明】一種與鉑類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物及其應用
發明領域
[0001]本發明屬於基因工程及腫瘤學領域，涉及一種鉬類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物及其應用。
【背景技術】
[0002]自20世紀60年代以來，以順鉬為代表的鉬類抗癌藥廣泛用於非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)等惡性腫瘤的治療，已成為NSCLC化療中不可缺少的藥物。鉬類藥物進入人體後迅速分布至全身，既可抑制腫瘤生長和擴散，也可殺滅遠處轉移的腫瘤，對原發灶、轉移灶和亞臨床轉移灶均有治療作用。但由於鉬類化療藥物對細胞選擇性差，在殺滅腫瘤細胞的同時對正常的細胞也有很大的破壞作用，常引起一些毒副反應。
[0003]雖然在標準劑量下鉬類藥物化療較少出現脂肪變性或膽汁淤積等肝臟組織學改變，但轉氨酶升高等肝臟的功能性損傷卻較常發生，當鉬類藥物劑量較大時，肝損傷發生更頻繁。鉬類藥物肝臟毒性主要表現為血清膽紅素、穀草轉氨酶、谷丙轉氨酶、以及鹼性磷酸酶水平的升高，並可按照這些指標，將肝臟毒性嚴重程度分為O~4五個等級。肝臟毒性增加了患者的生理負擔與心理痛苦，降低了患者的生命質量，還常因此被迫停止化療，從而影響了 NSCLC患者的預後。因此，對接受鉬類藥物化療的NSCLC患者進行肝臟毒性發病風險的診斷，對高危個體提前採取針對性的保護措施，真正實現個體化治療，顯得尤為重要。[0004]許多因素能影響鉬類藥物毒副反應的發病風險，如年齡、性別、吸菸、種族等。然而，在接受鉬類藥物化療的NSCLC患者中，有些病人即使年齡、性別、吸菸狀況、病理類型、臨床分期等情況相似，其是否發生肝臟毒性以及肝毒性的嚴重程度仍有很大差異，提示在同等環境暴露下，具有不同遺傳背景的NSCLC個體鉬類藥物肝臟毒性的易感性不同。
[0005]研究表明，單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)是引起鉬類藥物毒副反應的重要遺傳因素。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP的存在被認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對於環境暴露、藥物治療等因素的不同反應性，因此SNP可能是導致個體對常見疾病發生、預後，以及對藥物反應易感性差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病的發生，不僅靈敏、準確和快速，具有廣闊的應用前景。近年來，利用SNP診斷疾病的發生發展已經成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和心腦血管疾病等常見重大疾病診斷上的應用價值已初見端倪。
[0006]然而，目前還沒有將SNP應用於鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷的報導，若能篩選出鉬類化療藥物肝臟毒性易感的SNP作為生物標誌物，並研製相應的輔助診斷試劑盒，對我國鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷的現狀必將是一次有力的推動，也為其藥物預防與控制開闢了新的途徑。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是針對上述技術問題，提出一種與鉬類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物。
[0008]本發明的第二個目的是提供上述SNP標誌物的特異性引物。
[0009]本發明的第三個目的是提供上述SNP標誌物的特異性螢光探針對。
[0010]本發明的第四個目的是提供上述SNP標誌物及其特異性引物和/或特異性螢光探針在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
[0011]本發明第五個目的是提供鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒。
[0012]發明人通過分離和研究接受鉬類藥物化療並發生不同程度肝臟毒性的NSCLC患者外周血DNA中的單核苷酸多態性，尋找一組與鉬類化療藥物肝臟毒性高度相關的高特異性和敏感性的SNP，並研製出可便於臨床應用的鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒，為鉬類化療藥物肝臟毒性的預防和控制提供數據支持，為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數據支持。
[0013]本發明的目的是通過下列技術方案實現的:
[0014]一種與鉬類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物，該標誌物為rs6681909、rs4140932、rsl3131227、rs4446279、rsl7053350、rs9402873、rsl6878272、rsl3267737、rs7008590、rs947853、rs2838566、rsl383888、rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rsl048037 和 rs10086636 的組合。
[0015]所述的SNP標誌物的特異性引物，這些引物為:
[0016]rs6681909 的引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ;rs4140932 的引物序列為 SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ;rsl3131227 的引物序列為 SEQ ID No:9 和 SEQ IDNo:10 ;rs4446279 的引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;rsl7053350 的引物序列為 SEQ ID No:17 和 SEQ ID No: 18 ;rs9402873 的引物序列為 SEQ ID No:21 和 SEQ IDNo:22 ；rsl6878272 的引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ；rsl3267737 的引物序列為 SEQ ID No:29 和 SEQ ID No:30 ;rs7008590 的引物序列為 SEQ ID No:33 和 SEQ IDNo:34 ;rs947853 的引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ;rs2838566 的引物序列為SEQ ID No:41 和 SEQ ID No:42 ;rsl383888 的引物序列為 SEQ ID No:45 和 SEQ ID No:46 ；rs9642723 的引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ；rs3822296 的引物序列為 SEQID No:53 和 SEQ ID No:54 ;rs2160046 的引物序列為 SEQ ID No:57 和 SEQ ID No:58 ；rs10002931 的引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ；rs10032941 的引物序列為 SEQID No:65 和 SEQ ID No:66 ;rs6449138 的引物序列為 SEQ ID No:69 和 SEQ ID No:70 ；rsl048037 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ;rs10086636 的引物序列為 SEQID No:77 和 SEQ ID No:78。
[0017]所述的SNP標誌物的特異性螢光探針對，這些螢光探針為:
[0018]rs6681909 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:4 ;rs4140932 的螢光探針對序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsl3131227的螢光探針對序列為SEQ IDNo: 11 和 SEQ ID No:12 ;rs4446279 的螢光探針對序列為 SEQ ID No: 15 和 SEQ ID No: 16;rsl7053350的螢光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No: 20 ;rs9402873的螢光探針對序列為SEQ ID No:23和SEQ ID No:24 ;rsl6878272的螢光探針對序列為SEQ ID No:27和SEQ ID No: 28 ;rsl3267737 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No: 32 ；rs7008590的螢光探針對序列為 SEQ ID No:35和SEQ ID No:36 ;rs947853的螢光探針對序列為SEQ IDNo:39 和 SEQ ID No:40 ;rs2838566 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ；rsl383888的螢光探針對序列為SEQ ID No:47和SEQ ID No:48 ;rs9642723的螢光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No:52 ;rs3822296的螢光探針對序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No: 56 ;rs2160046 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:59和 SEQ ID No:60 ；rs10002931的螢光探針對序列為SEQ ID No:63和SEQ ID No:64 ;rs10032941的螢光探針對序列為SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68 ;rs6449138 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:71 和 SEQ IDNo:72 ;rsl048037 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:75 和 SEQ ID No:76 ;rs10086636 的螢光探針對序列為SEQ ID No:79和SEQ ID No:80。
[0019]所述的SNP標誌物在製備鉬類 化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
[0020]所述的SNP標誌物的特異性引物在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
[0021]所述的SNP標誌物的特異性螢光探針對在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
[0022]一種鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒，該試劑盒用於檢測外周血DNA中rs6681909、 rs4140932、 rsl3131227、 rs4446279、 rsl7053350、 rs9402873、 rsl6878272、rsl3267737、rs7008590, rs947853、rs2838566、rsl383888、rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rsl048037 和 rs10086636。
[0023]所述的輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標誌物的特異性引物和/或特異性螢光探針。
[0024]所述的輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標誌物的特異性引物為:
[0025]rs6681909 的引物序列為 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No: 2 ;rs4140932 的引物序列為 SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ;rsl3131227 的引物序列為 SEQ ID No:9 和 SEQ IDNo:10 ;rs4446279 的引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;rsl7053350 的引物序列為 SEQ ID No: 17 和 SEQ ID No: 18 ;rs9402873 的引物序列為 SEQ ID No:21 和 SEQ IDNo:22 ；rsl6878272 的引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ；rsl3267737 的引物序列為 SEQ ID No:29 和 SEQ ID No:30 ;rs7008590 的引物序列為 SEQ ID No:33 和 SEQ IDNo:34 ；rs947853 的引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ；rs2838566 的引物序列為SEQ ID No:41 和 SEQ ID No:42 ;rsl383888 的引物序列為 SEQ ID No:45 和 SEQ ID No:46 ；rs9642723 的引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ；rs3822296 的引物序列為 SEQID No:53 和 SEQ ID No:54 ;rs2160046 的引物序列為 SEQ ID No:57 和 SEQ ID No:58;rs10002931 的引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ；rs10032941 的引物序列為 SEQID No:65 和 SEQ ID No:66 ;rs6449138 的引物序列為 SEQ ID No:69 和 SEQ ID No:70 ；rsl048037 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ;rs10086636 的引物序列為 SEQID No:77 和 SEQ ID No:78。
[0026]所述的輔助診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標誌物的特異性螢光探針對為:
[0027]rs6681909 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:4 ;rs4140932 的螢光探針對序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsl3131227的螢光探針對序列為SEQ IDNo: 11 和 SEQ ID No:12 ;rs4446279 的螢光探針對序列為 SEQ ID No: 15 和 SEQ ID No: 16;rsl7053350的螢光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No: 20 ;rs9402873的螢光探針對序列為SEQ ID No:23和SEQ ID No: 24 ;rs 16878272的螢光探針對序列為SEQ ID No: 27和SEQ ID No:28 ;rsl3267737 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:31 和SEQ ID No:32 ；rs7008590的螢光探針對序列為SEQ ID No:35和SEQ ID No:36 ;rs947853的螢光探針對序列為SEQ IDNo:39 和 SEQ ID No:40 ;rs2838566 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ；rsl383888的螢光探針對序列為SEQ ID No:47和SEQ ID No:48 ;rs9642723的螢光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No:52 ;rs3822296的螢光探針對序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ;rs2160046 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:59和SEQ ID No:60 ；rs10002931的螢光探針對序列為SEQ ID No:63和SEQ ID No:64 ;rs10032941的螢光探針對序列為SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68 ;rs6449138 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:71 和 SEQ IDNo:72 ;rsl048037 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:75 和 SEQ ID No:76 ;rs10086636 的螢光探針對序列為SEQ ID No:79和SEQ ID No:80。
[0028]所述輔助診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP混合液、MgC12溶液、去離子水等；還可以含有標準品和/或對照品。
[0029]具體地說，本發明解決問題的技術方案包括:(1)建立統一標準的標本庫和資料庫:以標準操作程序(SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)基因型檢測:選擇接受鉬類藥物化療並有詳細肝臟毒性評價信息的NSCLC患者，利用高密度SNP晶片，在全基因組範圍內找出與鉬類化療藥物肝臟毒性相關的SNP。(3)鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒的研製:根據不同程度肝臟毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發SNP輔助診斷試劑盒。
[0030]本發明人以標準操作程序(SOP)採集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料、臨床資料等，並採用了 Affymetrix6.0晶片進行全基因組掃描。
[0031]具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:
[0032]1.研究樣本的選擇
[0033](I)首次入院就診並經病理組織學或細胞學確診的新發NSCLC患者，其診斷按照世界衛生組織頒布的標準由至少兩位病理科醫生確認；
[0034](2)首次化療前肝功能檢查各項指標均正常；
[0035](3)接受2~6周期的以鉬類化療為主的治療；排除化療前或化療期間接受放療的NSCLC患者；
[0036](4)有詳細的化療2周期或3周期後肝臟毒性的評價信息。
[0037]本研究共採用334例符合標準的樣本進行研究。
[0038]2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規方法操作。通常能得到20ng/ μ I~50ng/ μ I DNA，純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1.6-2.0。
[0039]3.Affymetrix6.0 晶片檢測
[0040](I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0041 ] (2)在Affymetrix6.0晶片(購於美國昂飛公司，下同)上進行全基因組掃描；
[0042](3)檢測並比較各基因型在不同程度肝臟毒性的NSCLC患者中的分別差異。
[0043]4.診斷試劑盒製備方法
[0044]Affymetrix6.0晶片進行全基因組掃描確定不同程度肝臟毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為鉬類化療藥物肝臟毒性診斷指標。最後篩選出的與鉬類化療藥物肝臟毒性發生有關的SNP組成輔助診斷試劑盒(rs6681909、rs4140932、rsl3131227、rs4446279、rsl7053350、rs9402873、rsl6878272、rsl3267737、rs7008590、rs947853、rs2838566、rsl383888、rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931,rs10032941、rs6449138、rsl048037和rs10086636)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性引物和特異性螢光探針對，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0045]6.統計分析方法
[0046]運用卡方檢驗(用於分類變量)或者student t檢驗(用於連續性變量)比較人口學特徵、吸菸、組織類型、分期等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進行關聯分析,計算比值比(Odds Ratio, OR)以及它們的95%可信區間。定義那些肝臟毒副反應OR小於I的SNP為保護性SNP ;定義那些肝臟毒副反應OR大於I的SNP為危險性SNP。
[0047] 為了進一步研究這20個SNP構成的綜合指徵用於鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷的效果，我們構建了一個數學公式，綜合考慮每個SNP與鉬類化療藥物肝臟毒性發生的正、負關聯情況和聯繫強度。具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進行評分，野生純合型=「0」，雜合型=「1」，變異純合型=「2」，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸係數為權重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究對象確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下:危險分值=(0.72Xrs6681909的評分)+ (0.63Xrs4140932的評分)+ (0.63Xrsl3131227 的評分)+ (0.69Xrs4446279 的評分)+ (0.71 Xrsl7053350 的評分)+ (1.21Xrs9402873 的評分)+ (-0.67Xrsl6878272 的評分)+(0.77Xrsl3267737 的評分)+ (0.73Xrs7008590 的評分)+ (-0.65Xrs947853 的評分)+ (1.33Xrs2838566 的評分)+ (-0.78Xrsl383888 的評分)+ (-0.65Xrs9642723 的評分)+ (0.67Xrs3822296 的評分)+ (0.67Xrs2160046 的評分)+ (0.66Xrs10002931 的評分)+ (0.66Xrs10032941 的評分)+ (0.66Xrs6449138 的評分)+ (0.65Xrsl048037 的評分)+ (0.73Xrs10086636 的評分)，獲得的危險分值係數以及界限值被應用於全基因組關聯研究的334例樣本中。(以rs6681909為例:0.72為rs6681909變異位點的回歸係數(見表l);rs6681909的評分，野生純合型=「0」，雜合型=「1」，變異純合型=「2」。某個SNP是野生純合型、雜合型還是變異純合型由儀器檢測結果確定；某個樣本的總評分是這20個SNP分別評分的總和，單個SNP的基因型只是計算評分的一個中間過程，不需要列明具體基因型。)
[0048]統計學分析均通過專門的統計學分析軟體完成(PLINK1.07)。統計學顯著性水平P值設為1.0X 10-4，所有統計學檢驗均為雙側檢驗。
[0049]以下是本發明進一步的說明:
[0050]我們將上述接受鉬類藥物化療後發生不同程度肝臟毒性的NSCLC患者經Affymetrix6.0晶片進行全基因組掃描獲得相關結果。
[0051]根據Affymetrix6.0晶片檢測，本發明人檢測到在不同程度肝臟毒性的NSCLC患者中基因型分布頻率存在差異的SNP包括:rs6681909、rs4140932、rsl3131227、rs4446279、rsl7053350、rs9402873、rsl6878272、rsl3267737、rs7008590、rs947853、rs2838566、rsl383888、rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs1003294Urs6449138、rsl048037 和 rs10086636。
[0052]多因素logistic回歸分析結果表明，這20個SNP與鉬類化療藥物肝臟毒性發生風險存在著劑量-反應關係:危險因素(rs6681909、rs4140932、rsl3131227、rs4446279、rsl7053350、rs9402873、rsl3267737、rs7008590、rs283856、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rsl048037 和 rs10086636，變異等位基因型增加肝毒性風險),保護因素(rsl6878272、rs947853、rsl383888和rs9642723，變異等位基因型降低肝毒性風險)。
[0053]進一步分析這20個SNP的組合用於鉬類化療藥物肝臟毒性診斷的效果，發現其組合能夠很好的區分不同程度肝臟毒性的NSCLC患者。
[0054]根據上述實驗結果，本發明人製備了一種能用於臨床鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血標本DNA中上述SNP的特異性引物、特異性螢光探針對和其他檢測試劑。
[0055]具體而言，這20個SNP的組合，或者這20個SNP的特異性引物及特異性螢光探針對的組合構成的相關診斷試劑盒有助於鉬類化療藥物肝臟毒性的診斷，對高危個體提前採取針對性的保護措施，真正實現個體化治療，顯得非常重要。
[0056]本發明有益效果:
[0057]本發明提供的SNP標誌物作為鉬類化療藥物肝臟毒性相關的標誌物的優越性在於:
[0058](1) SNP是一種新型基因生物標誌物，區別於傳統生物標誌物,穩定、微創、易於檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標誌物的成功開發將為鉬類化療藥物肝臟毒性的診斷和控制開創全新局面，為其他疾病生物標誌物的研製提供借鑑。
[0059](2) SNP試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用於鉬類化療藥物肝臟毒性的輔助診斷，有助於反映腫瘤患者對鉬類藥物肝臟毒性的易患程度，為臨床醫生快速準確掌握患者病情、及時採取更具個性化的防治方案提供支持。
[0060](3)本發明人採用全基因組晶片掃描以獲取鉬類藥物肝臟毒性相關的SNP譜，覆蓋的SNP較全面；該策略的應用加速和保證了 SNP生物標誌物和輔助診斷試劑盒在臨床上的應用，也為其他疾病生物標誌物的研製提供方法和策略上的借鑑。
[0061]本發明通過控制年齡等對毒副反應發生的影響因素，研究SNP在鉬類化療藥物肝臟毒性的診斷中的應用前景，闡述SNP對於鉬類化療藥物肝臟毒性進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發明獲得了鉬類化療藥物肝臟毒性相關SNP譜和特異性標誌物；通過SNP生物標誌物和輔助診斷試劑盒的研製和應用，可使得臨床醫生更好地識別鉬類藥物肝臟毒性的高危個體，為快速準確掌握患者病情及實現個體化治療奠定基礎，並為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0062]圖1:顯示全基因組關聯研究中發生或未發生肝臟毒性的NSCLC患者的ROC曲線。
[0063]顯示接受鉬類藥物化療的NSCLC患者中發生肝臟毒性組對未發生肝臟毒性組為參照的ROC曲線。
【具體實施方式】
[0064]實施例1樣品的收集和樣品資料的整理[0065]發明人於2005月4月開始至2011年I月從南京醫科大學附屬腫瘤醫院及南京醫科大學附屬第一醫院收集了大量的原發性NSCLC患者血標本，通過對樣品資料的整理，發明人從中選擇了 334例符合下列標準的全基因組晶片掃描樣本:
[0066](I)首次入院就診並經病理組織學或細胞學確診的新發NSCLC患者，其診斷按照世界衛生組織頒布的標準由至少兩位病理科醫生確認；
[0067](2)首次化療前肝功能檢查各項指標均正常；
[0068](3)接受2~6周期的以鉬類化療為主的治療；排除化療前或化療期間接受放療的NSCLC患者；
[0069](4)有詳細的化療2周期或3周期後肝臟毒性的評價信息。
[0070]並系統採集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
[0071]實施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描
[0072]將上述符合條件的334例接受鉬類藥物化療的NSCLC患者外周血DNA進行AfTymetrix6.0晶片檢測獲得相關結果。具體步驟為:
[0073]1、向儲存於2ml凍存管中的血細胞加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖 219.72g、氯化鎂 2.02g 和曲拉通 X-100 (amresco0694) 20ml 混合後，用 TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻後完全轉入。
[0074]2、去除紅細胞:用溶血試劑將5ml離心管補至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉澱中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次,4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0075]3、抽提DNA:向沉澱中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化鈉，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8μ I蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0076] 4、去除蛋白質:加Iml飽和酹充分混勻(手輕搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘，取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1, v/v,下同),充分混勻後(手搖15分鐘),4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個
1.5ml的離心管)。
[0077]5、DNA沉澱:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ I,再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉澱物，再以12000rpm離心10min。
[0078]6、DNA洗漆:在沉澱中加入冰無水乙醇lml, 12000rpm離心10min,棄上清後真空
抽乾或置於清潔乾燥環境中蒸乾。
[0079]7、測量濃度:通常能得到20ng/ μ l_50ng/ μ I DNA，純度(紫外2600D與2800D比值)在 1.6-2.0。
[0080]8、進行全基因組掃描:Affymetrix6.0晶片進行全基因組掃描
[0081]9、數據分析與處理:在接受鉬類藥物化療後發生不同程度肝臟毒性的NSCLC患者中發現的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經羅列出，結果見表1。
[0082]表1不同程度肝臟毒性的NSCLC患者全基因組關聯分析結果
【權利要求】
1.一種與鉬類化療藥物肝臟毒性相關的SNP標誌物，其特徵在於該標誌物為rs6681909、 rs4140932、 rsl3131227、 rs4446279、 rsl7053350、 rs9402873、 rsl6878272、rsl3267737、 rs7008590, rs947853、 rs2838566、 rsl383888、 rs9642723、 rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rsl048037 和 rs10086636 的組合。
2.權利要求1所述的SNP標誌物的特異性引物，其特徵在於該引物為: rs6681909的引物序列為SEQ ID No:l和SEQ ID No:2 ;rs4140932的引物序列為SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ;rsl3131227 的引物序列為 SEQ ID No:9 和 SEQ ID No: 10;rs4446279 的引物序列為 SEQ ID No: 13 和 SEQ ID No: 14 ;rsl7053350 的引物序列為 SEQID No: 17 和 SEQ ID No: 18 ;rs9402873 的引物序列為 SEQ ID No:21 和 SEQ ID No:22;rsl6878272 的引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ；rsl3267737 的引物序列為 SEQID No:29 和 SEQ ID No:30 ;rs7008590 的引物序列為 SEQ ID No:33 和 SEQ ID No:34;rs947853 的引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ;rs2838566 的引物序列為 SEQID No:41 和 SEQ ID No:42 ;rsl383888 的引物序列為 SEQ ID No:45 和 SEQ ID No:46 ；rs9642723 的引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ；rs3822296 的引物序列為 SEQID No:53 和 SEQ ID No:54 ;rs2160046 的引物序列為 SEQ ID No:57 和 SEQ ID No:58 ；rs10002931 的引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ；rs10032941 的引物序列為 SEQID No:65 和 SEQ ID No:66 ;rs6449138 的引物序列為 SEQ ID No:69 和 SEQ ID No:70 ；rsl048037 的引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ;rs10086636 的引物序列為 SEQID No:77 和 SEQ ID No:78。
3.權利要求1所述的SNP標誌物的特異性螢光探針對，其特徵在於該螢光探針為: rs6681909的螢光探針對序列為SEQ ID No:3和SEQ ID No:4 ;rs4140932的螢光探針對序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsl3131227的螢光探針對序列為SEQ ID No: 11SEQ ID No: 12 ;rs4446279 的螢光探針對序列為SEQ ID No:15和SEQ ID No: 16 ；rsl7053350的螢光探針對序列為SEQ ID No: 19和SEQ ID No:20 ;rs9402873的螢光探針對序列為SEQID No:23 和 SEQ ID No:24 ;rsl6878272 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:27 和 SEQ IDNo:28 ;rsl3267737 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ;rs7008590 的螢光探針對序列為SEQ ID No:35和SEQ ID No:36 ;rs947853的螢光探針對序列為SEQ IDNo:39 和 SEQ ID No:40 ；rs2838566 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ；rsl383888的螢光探針對序列為SEQ ID No:47和SEQ ID No:48 ;rs9642723的螢光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No:52 ;rs3822296的螢光探針對序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No: 56 ;rs2160046 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:59和 SEQ ID No:60 ；rs10002931的螢光探針對序列為SEQ ID No:63和SEQ ID No:64 ;rs10032941的螢光探針對序列為SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68 ;rs6449138 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:71 和 SEQ IDNo:72 ;rsl048037 的螢光探針對序列為 SEQ ID No:75 和 SEQ ID No:76 ;rs10086636 的螢光探針對序列為SEQ ID No:79和SEQ ID No:80。
4.權利要求1所述的SNP標誌物在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
5.權利要求2所述的SNP標誌物的特異性引物在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
6.權利要求3所述的SNP標誌物的特異性螢光探針對在製備鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒中的應用。
7.一種鉬類化療藥物肝臟毒性輔助診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒用於檢測外周血 DNA 中 rs6681909、rs4140932、rsl3131227、rs4446279、rsl7053350、rs9402873、rsl6878272、 rsl3267737、 rs7008590、 rs947853、 rs2838566、 rsl383888、 rs9642723、rs3822296、rs2160046、rs10002931、rs10032941、rs6449138、rsl048037 和 rs10086636。
8.根據權利要求7 所述的輔助診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有權利要求2所述SNP標誌物的特異性引物和/或權利要求3所述SNP標誌物的特異性螢光探針對。
9.根據權利要求7或8所述輔助診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒還包括PCR技術常用的試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911440SQ201410093713
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】沈洪兵, 胡志斌, 靳光付, 馬紅霞, 戴俊程, 江玥, 曹松玉 申請人:南京醫科大學