一種表達雙基因的真核表達載體的製作方法

2023-05-28 16:11:36

專利名稱：：一種表達雙基因的真核表達載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種表達雙基因的真核表達載體。
背景技術：
：在通過過表達技術研究基因功能及轉基因動物製備過程中，我們往往藉助真核表達載體來實現，傳統的方法就是通過分子生物學手段將目的基因片段連接到真核啟動子下遊，整合到細胞基因組中後能指導外源基因表達。該方法在基因表達及功能的研究中有著極其廣泛的應用，但該研究手段也有不足的一方面現在的研究很多情況下可能需要研究多基因之間相互作用關係，如果通過表達單一基因的真核表達載體來研究，則需要分別構建多個載體，在細胞水平上的研究必然要多次轉染並分別篩選才能得到同時整合多個基因的細胞。同樣，在轉基因動物中要製備轉不同基因的動物時，首先必須分別製備單基因轉基因動物，並分別篩選純合子，然後純合子之間交配得到能同時表達多個基因的後代，上述方法不但研究周期長、操作繁瑣而且耗費高。
發明內容本發明的目的是提供一種表達雙基因的真核表達載體。本發明所提供的表達雙基因的真核表達載體，其序列含有植酸酶基因表達盒和人粘病毒抗性基因1表達盒。所述植酸酶基因表達盒是由依次串聯的CMV啟動子、植酸酶基因(appA)和BGH終止子組成；所述人粘病毒抗性基因1表達盒由依次串聯的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因1(Mxl)和BGH終止子組成；所述植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列；所述CMV啟動子具有GENBANK號為X03922的自5'端第541—1128位核苷酸序列；所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列。所述表達雙基因的真核表達載體是以pcDNA3.1(+)載體為出發載體構建得到。所述表達雙基因的真核表達載體的核苷酸序列優選為序列表中序列1。本發明通過高保真酶擴增出含啟動子、目的基因及終止子的完整真核表達調控區域，連接到另外一個真核表達載體上，構建出各自含表達調控基因的多基因真核表達載體。本發明的表達雙基因的真核表達載體的可同時高效表達植酸酶基因(appA)、人粘病毒抗性基因1(Mxl)。本發明的表達載體在細胞水平上驗證了含雙基因的表達載體的表達效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。本發明的含雙基因的AMP質粒轉染豬PK15細胞及製備轉基因小鼠，通過定量PCR檢測出AMP的表達雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因l(Mxl))的效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。本發明的載體顯著優勢表現在多個基因過表達時於不影響各自表達效率的前提下，實現兩個基因功能，為製備轉聯合基因動物等提供一種便捷的手段。圖1:PCR擴增appA產物電泳圖2:pcDNA-appA質粒圖譜；圖3:PCR擴增Mxl產物電泳圖4:pcDNA-Mxl質粒圖譜；圖5:pcDNA-appA-Mx(AMP)質粒圖譜；圖6:菌液PCR檢測AMP重組質粒；圖7:各組細胞中appA表達水平；圖8:各組細胞中Mx表達水平；圖9:AMP轉基因鼠PCR檢測外源基因；圖10:AMP轉基因鼠SOUTHERNBLOT檢測外源基因；圖ll:半定量檢測appA及Mx的表達電泳圖具體實施例方式下述實施例中提到的實驗方法，如無特別說明均為常規方法。實施例1、表達雙基因的載體的構建1、單基因表達載體基本構件的獲得(1)真核表達載體pcDNA-appA的製備以大腸桿菌DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)為模板，以表1中列舉的擴增appA的引物擴增植酸酶基因(appA)片段(GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列)和BGH終止子片段(具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列)。反應體系為反應體系為50|il，5pL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM引物appA-Ll、lpL20引物appA-Rl(引物序列見表l)、0.5)aL5U/pL高保真Tag聚合酶，2pl大腸桿菌DH5a做模板，加超純水至50pL(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增程序98°C10s，68。C2min，循環30次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖l所示)。PCR產物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用HindIII、EcoRl雙酶切純化產物;同時用HindIII、EcoRI雙酶切pcDNA3.1(+)載體(購自invitrogen公司)；將PCR擴增產物和酶切後的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態大腸桿菌；菌液塗瓊脂糖凝膠板，於37t:培養箱中培養過夜；挑單菌落接種於液體LB培養基中培養，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結果表明含有appA和BGH終止子的載體，提取質粒備用，將該測序表明正確的質粒命名為pcDNA-appA(質粒圖譜如圖2所示)。(2)真核表達載體pcDNA-Mxl的製備以人cDNA(以提取專利人血液提取總RNA，反轉錄而來)為模板，以表l中列舉的擴增Mxl的引物擴增人粘病毒抗性基因1(Mxl)片段(GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列)。反應體系為反應體系為50|iil，5|iL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20|iM引物Mx-Ll、l|uL20pM引物Mx-Rl(序列見表l)、0.5|LiL5U/pL高保真Tag聚合酶，100ng人cDNA為模板，加超純水至50|nL(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增程序98°C10s，68°C2min，，循環30次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)。PCR產物用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用HindIII、EcoRI雙酶切純化產物；同時用HindIII、EcoRI雙酶切pcDNA3.1(+)載體(購自invitrogen公司)；將PCR擴增產物和酶切後的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態大腸桿菌；菌液塗瓊脂糖凝膠板，於37'C培養箱中培養過夜；挑單菌落接種於液體LB培養基中培養，部分菌液送公司測序(invitrogen北京公司)；選取測序結果表明含有Mxl表達盒的載體，提取質粒備用，將該測序表明正確的質粒命名為pcDNA-Mxl(質粒圖譜如圖4所示)。2、雙基因表達載體AMP構建以pcDNA-appA(質粒圖譜如圖2所示)為模板，以表1所列的引物擴增表1所列的相應構件。5nL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、l|iL20pM引物CMVappA-Ll、lpL20liM引物CMVappA-Rl(序列見表l)、0.5pL5U/高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質粒，加超純水至50^L(高保真酶購自大連寶生物，貨號DR010A)。PCR擴增程序98°C10s，68°C3min，，循環30次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物部分測序(iiwitrogen公司)；測序結果表明擴增得到的CMV-appA-BGHpA片段；CMV-appA-BGHpA片段由依次串連的CMV啟動子、appA和BGH終止子組成；其中CMV啟動子具有GENBANK號X03922的自5'端第541—1128位核苷酸的序列；植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列(appA基因)。所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596—5881位核苷酸序列。上述PCR產物CMV-appA-BGHpA片段用QIAGEN瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化(操作步驟見公司試劑盒)，用MluI酶切純化產物；同時用MluI單酶切pcDNA-Mxl質粒;將PCR擴增產物和酶切後的載體連接(連接酶購自promega公司，貨號M1804);按公司要求操作步驟轉化DH5a(購自北京全式金公司，貨號CD201)感受態大腸桿菌；菌液塗瓊脂糖凝膠板，於37'C培養箱中培養過夜。挑單菌落接種於液體LB培養基中培養，菌液PCR檢測插入片段中CMV-appA-BGHpA片段(擴增體系同上擴增CMV-appA-BGHpA片段部分(引物見表l)，其中模板改為菌液2微升)，結果見圖6，可見7號及12號泳道中有對應的CMV-appA-BGHpA片段擴增條帶，將上述兩樣的部分菌液送公司測序(irwitrogen北京公司)；結果表明獲得含有CMV-appA-BGHpA片段和Mxl表達盒的重組表達載體，將該載體命名為pcDNA-appA-Mx，簡稱為AMP。測序表明，AMP具有序列表中序列1的核苷酸序歹U，其序列中含有appA表達盒和Mxl表達盒，其中appA表達盒由依次串聯的CMV啟動子、植酸酶基因(appA)和BGH終止子組成；Mxl表達盒由依次串聯的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因l(Mxl)和BGH終止子組成；CMV啟動子具有GENBANK號X03922的自5'端第541—1128位核苷酸的序列(對應自序列表中序列1的5'端第232-819位核苷酸序列和自序列表中序列1的5'端第2675-3262位核苷酸序列)；植酸酶基因(appA基因)具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列(對應自序列表中序列1的5'端第917-2221位核苷酸序列)；人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列(對應自序列表中序列1的5'端第3360-5438位核苷酸序列)。所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第5596_5881位核苷酸序列(對應自序列表中序列1的5'端第2292-2577位核苷酸序列和自序列表中序列1的5'端第5425-5710位核苷酸序列)。AMP的質粒圖譜如圖5所示。表l:3^發明中用於擴增載體構件的引物擴增片段名稱引物代號引物序列產物長度(bp)5'端引入的酶切位點tableseeoriginaldocumentpage7實施例2、本發明的含雙基因真核表達載體的細胞水平表達檢驗1、凍存細胞的復甦與培養pcDNA-appA、pcDNA-Mxl及AMP質粒用Seal大量酶切線性化後，QIAGEN純化試劑盒膠回收線性化片段，產物終濃度為500ng/ul用於細胞轉染。從液氮中取出裝有豬PK15細胞(購自中國科學院細胞庫)的凍存小管，立即投入37-40'C的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解；在l-2min內完成復溫；將細胞懸液移入無菌的離心管，加入5mL培養液，輕輕吹勻；將細胞懸液800-1000r/min離心5min，棄上清；向含有細胞沉澱的離心管加入lmL完全培養基，輕輕吹勻，將細胞懸液轉入細胞培養瓶，加入適量的完全培養基進行培養。2、細胞轉染與篩選將豬PK15細胞系細胞(購自中國科學院細胞庫)分為四組(轉染空pcDNA質粒組、轉染AMP質粒組、轉染pcDNA-Mxl組及轉染pcDNA-appA組)，每組3個重複。轉染前1天，向每孔含10%胎牛血清(購自GIBCO公司，貨號21640-079)的500pLDMEM高糖培養基(購自GIBCO公司，貨號12100-046)的24孔板中分別接種0.5-2><105個豬PK15細胞，使細胞在轉染前達到卯-95%的匯合；用50pL的無血清、無抗生素的培養基分別稀釋0.8嗎待轉染DNA(其中，轉染空pcDNA質粒組使用Seal線性化的pcDNA，轉染AMP質粒組使用Seal線性化AMP質粒，轉染pcDNA-Mxl組使用Seal線性化的pcDNA-Mxl質粒，轉染pcDNA-appA組使用Seal線性化的pcDNA-appA質粒)，並溫和的混勻；使用前將脂質體溫和搖勻，將2pLlipefectaminTM-2000加入50pL的無血清、無抗生素的DMEM培養基(購自GIBCO公司，貨號12100-046)並輕輕混勻，於室溫孵育5min;5min後，分別將50pL的各組DNA稀釋液加入50pL的脂質體稀釋液，輕輕混勻並於室溫放置20min;將lOOpL的DNA脂質體混合物加入到準備好的孔內，輕輕來回晃動培養板，將其置於37"C、飽和溼度、5%<302的培養箱中培養，於4-6h後用完全培養基代替轉染培養基，在後代培養中，於細胞培養液中加入G418(購自Gibco，貨號11811-023)，篩選兩周。3、轉染細胞表達量鑑定1)細胞總RNA提取及cDNA的製備按照試劑盒(購自北京天跟公司，貨號DP430)操作說明，提取上述轉染空pcDNA質粒組、轉染AMP質粒組、轉染pcDNA-Mxl組及轉染pcDNA-appA組細胞總RNA;按照TOYOBO反轉錄試劑盒(購自TOYOBO公司，貨號FSK-100)，將提取的總RNA反轉錄成cDNAo2)螢光定量PCR檢測以1)中製備的cDNA為模板，梯度稀釋模板驗證選定最佳模板濃度，以豬GAPDH基因為內參(引物為mGAPDH-Ll和mGAPDH-Rl)，進行螢光定量PCR測定appA(appA引物為表1所示的appA-RTLl和appA-RTRl)、Mxl(Mxl引物為表1所示的hMxl-RTL1和hMxl-RTR1)表達量，上樣體系按照ABI定量試劑說明書上樣，反應體系為20(il，10|iiL2xMixturer(TAKARA，貨號DRR041A)、lpL20pM上遊引物、lpL20nM下遊引物、1微升cDNA，加超純水至20pL。PCR擴增程序95°C5min;94。C20s，退火溫度56r，72。Clm，循環40次，最後72°C延伸5min。螢光定量檢測結果如圖7、圖8所示，在進行MX1表達水平檢測時，以轉pcDNA質粒對照組為基準，轉pcDNA-MXl組及AMP組的表達水平平均為對照組的37.27倍和39.37倍；進行appA表達水平檢測時，以轉pcDNA質粒對照組為基準，轉pcDNA-appA組合，AMP組的表達水平分別是對照組的32.27倍和39.07倍，轉染AMP基因組能有效高表達appA及Mxl基因，且單基因載體和雙基因載體表達效率不能從細胞水平鑑定出差異(P<0.05)。(圖中縱坐標是定量PCR儀顯示的格式，以logn)值為單位，各組的值為每組目的基因的表達水平和內參的表達水平的比值。以對照組細胞相應基因表達為參照基數0，其餘各組表達水平值為對照組相應基因表達的倍數)實施例3、含雙基因真核表達載體製備的轉基因動物的檢驗(l)AMP轉基因小鼠的製備將線性化AMP載體利用體內精原幹細胞介導的的轉基因動物製備的方法(採用李碧春、孫國波等，體內外精原幹細胞介導大群生產轉基因雞，中國科學C輯:生命科學，2008，38，626-634)，製備出含AMP的轉聯合基因小鼠。(2)轉基因小鼠的整合檢測分別利用appA、Mxl定量檢測引物(見表l，同細胞表達檢測時appA、Mxl定量檢測引物)檢測轉基因小鼠基因組DNA中相應基因的整合檢測步驟1)獲得的轉聯合基因小鼠後代小鼠中外源基因的整合情況。PCR反應體系為50|il，5pL10xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM引物PL、l^L20pM引物PR、0.5|uL5U/pL高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質粒，加超純水至50|iL。PCR擴增程序95°C5min;94°C20s，退火溫度56°C，72。Clm，循環30次，最後72°C延伸5min。PCR擴增產物用1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出分別能擴增出appA及Mxl基因的鼠為基因真核鼠(圖9)(圖中，+:陽性對照，AMP質粒DNA為模板；一陰性對照，正常鼠DNA為模板；1一16:為轉基因後代鼠擴增條帶，上圖可見l-16號鼠能擴增出355bp左右的條帶，和預期擴增的appA條帶一致；下圖可見1-16號鼠能擴增出355bp左右的條帶，和預期擴增Mxl條帶325bp—致；擴增產物送公司測序分別和appA及Mxl序列一致)。以表1中檢測appA及Mxl的引物為引物,按照試劑盒操作說明書體系加樣;PCR運行程序如下95°C5min，94°C45S，56°C1min，72°C1min，30個循環後72°C延伸10min(探針標記試劑盒購自innogen-cn公司，貨號DDLK-010)。以PCR產物為探針進行southen雜交檢測，雜交前在95。C變性5分鐘後立即冰水中放置10分鐘備用；大量抽提小鼠尾組織DNA，用Hindm及NotI雙酶切基因組，濃縮基因組酶切產物之300ng/Hl;於1%瓊脂糖凝膠電泳分離各酶切片段，每孔上樣50微升；然後使DNA原位變性後轉移到帶正電荷尼龍膜上。按照試劑盒操作說明進行預雜交、雜交及X-光片曝光檢測雜交信號(購自innogen-cn公司，貨號DIGD-210)。檢測結果(圖IO)表明，PCR檢測陽性鼠樣，southern雜交檢測相應鼠能檢測出相應調帶，說明l-16號樣品所代表的轉基因鼠為雙基因整合鼠。圖10中k為正常飼養鼠(非轉基因鼠)。(3)小鼠血液總RNA提取及cDNA的製備從2)中篩出的陽性轉基因小鼠尾部採集100微升血液，按照天根血液總RNA提取試劑盒(貨號DP433)操作說明，提取各組細胞總RNA;按照TOYOBO反轉錄試劑盒(貨號FSK-100)，將提取的總RNA反轉錄成cDNA.(4)AMP轉基因小鼠半定量PCR檢測以(3)中製備的cDNA為模板，分別以appA、Mxl及小鼠beta-actin基因為內參(擴增方法如實施例1的步驟1(引物見表l))，進行半定量PCR測定，PCR反應體系為50|il，510xBuffer、8pL2.5mMdNTP、lpL20pM上遊引物、lpL20pM下遊引物(擴增appA、Mxl及小鼠beta-actin的引物分別是表1中appA-RTLl、appA-RTRl，hMxl-RTLl、hMxl隱RTR1及actin-RTLl、actin-RTR1)、0.5pL5U/高保真Tag聚合酶，100ngpcDNA-appA質粒，加超純水至50pL。PCR擴增程序95。C5min;94。C20s，退火溫度56。C，72。Clm，，最後72°C延伸5min，內參beta-actin擴增時23個循環，其他模板擴增32個循環。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖11)。半定量結果表明，2、5、7、10、15泳道擴增出陽性條帶，而且在appA和Mxl陽性結果相一致，說明對應的AMP整合陽性鼠能同時表達appA和Mxl基因。序列表1<210〉19825〈212〉DNA<213〉人工序列〈223〉〈400〉1g8Cgg3tCggccgcatagttcgagc犯aatttagggttagg3ttattgactggagttccgcccgcccattattgacgtcaa/tcatatgccatgcccagtatcgctattacactcscggggaaaatcaacggtaggcgtgtctgcttactggtttei33cttaaccccgc犯tgtcagtcgtcccagacgcagctaatcgccga^aagggcccgtaaaacatacccaggcaccaactggattgactttaccgc犯tcaaacgagatctcccaagccagtatttaagctacagcgttttgcgtagttattaacgttacataagacgtcaataatgggtggagaagtacgccccatgacctteicatggtgatgatttccaagtggactttcca3Cggtggg3ggcttatcgaatctgcattcgcatggtgtgctggccaaccttatctcggactgcccgcagtggcgaagcctgatacgtccaaacgcgaacggggcatcggcttgtgccttagatcccctatctgctccctgacaaggcaagctgcttcgcgt3gtaatc^cttacggtaaatgacgtatgtatttacggtcctattgacgtgggactttccggttttggcctccax:ccc8Eiaatgtcgtagtctatataaattaatacgaaagcgatcttctcagagtgagtgctccaacggccggteiaaattaccaacgctggtcaggttcgccgccgggtcccgatcctgactgacgcaaacggcgtta3Cgtgagaaggtgcactctcttgtgtgttgcttgaccgaatgtacgggcttscggggtcatggcccgccttcccatagtaaactgccca_tC肪tg3Cggctacttggcaagtacatcaattgacgtcaaacaactccgcgcagagctctctcactatagaatcccatttgccggagctgcaaggccacgactgggttggccagcgtctgcgcgattattgctggcacctgttattt朋tgatcctcagctcgcgaactgacaggacgaacagtacaatctgctctgatg60ggaggtcgctgagtagtgcg120caattgcatgaagaatctgc180cgttgacatt240attagttcat3gccc3tata300tggctgaccgccc肪cgacc360aacgccaatagggactttcc420cttggcagtacatcaagtgt480taaatggcccgcctggcatt540gtacatctacgtattagtca600tgggcgtggat3gCggtttg660tgggagtttgttttggcacc720cccattgacgcaaatgggcg780ctggctaactagagaaccca840ggagacccaagctggctagc900ttatctcttctgattccgtt960犯gctggaaagtgtggtgat1020caactgatgcaggatgtcac1080ctgacaccgcgcggtggtga1140gtagccgacggattgctggc1200gctgatgtcgacgagcgteic1260gactgtgcaataaccgtaca1320cctctEiaaaactggcgtttg1380agggcaggagggtcaattgc1440gaacgggtgcttaattttcc1500agctgttcattaacgcaggc1560attaccatcggaactcaaggtgagcgccgacaatgtctcattaaccggtgcggtaagcct1620cgcatcaatgctgacgaagatatttctcctgcaacaagcacagggaatgccggagccggg1680gtgggg肌ggatcaccgattcacaccagtgga^caccttgctaagtttgcataacgcgca1740attttatttgttacaacgcacgcc卿ggttgcccgcagccgcgccaccccgttattaga1800tttgatcaagacagcgttgacgccccatccceiggcgtatggtgtgacatt1860acccacttcagtgctgtttatcgccggacacgatactaatctggcaaatctcggcggcgc1920actggagctcaactggacgcttcccggtcagccggataacacgccgccaggtggtg縦t1980ggtgtttg犯cgctggcgtcggc恤gcgataacagccagtgg3ttC3ggtttcgctggt2040cttccagactttacagcagatgcgtgataa肌cgccgctgtcattaaatacgccgcccgg2100ctgaccctggcaggeitgtgaagagcga犯tgcgcagggcatgtgttcgtt2160ggcaggttttacgcaaatcgtgaatgaagcacgcataccggcgtgcagtttgtaagaatt2220ctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctg2280atcagcctcgactgtgccttCtagttgCCELgccatctgttgtttgcccctcccccgtgcc2340ttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttccta^t肌aatgaggaaattgc2400atcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaa2460ggggg鄉3ttgggaagaca_atagcaggcatgctggggatgcggtgggctcta/tggcttc2520tgaggcggaaagaaccagctggggctct3gggggt3tCCCcacgcgccctgtagcggcgc2580attaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgCEigcgtgaccgctacacttgccagcgccct2640agcgcccgctcctttcgctttcttcccttcacgcgttgacattgattattgactagttat2700taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccat3tatgg3gttccgcgttaca2760taactt3cggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacg3CCCCCgCCCattgacgtca2820ataatgacgtatgttcccatagtaacgcca3t3ggg3Ctttccattgacgtcaatgggtg2880gagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac3tc幼gtgtatcatatgccaagtacg2940ccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacc3000ttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtg3060atgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttcca3120agtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgtUtggcaccaaaatcaacgggacttt3180cc犯犯tgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggt鄉cgtgt3Cggtgg3240gaggtctatataagcmgagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatc3300gaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagctta3360tggttgtttccgaagtggaca_tcgC8aaagctg3tccagctgctgcatcccaccctctat3420tactgaatgg8gatgcta_ctgtggcccagactcggtggctgagaacaacc3480tgtgC3gCC3gtatgaggagaaggtgcgcccctgcatcgacctcattgactccctgcggg3540ctctaggtgtggeigc鄉3cctggccctgccagccatcgccgtcatcggggaccagagct3600CgggC3卿gctccgtgttggaggcactgtca_ggagttgcccttcccagaggca^gcggga3660tcgtgaccagatgcccgctggtgctgaaactgaagaaacttgtgaacgaagataagtgga3720gaggcaaggtcagttaccaggacta^cgaga^ttgagatttcggatgcttcagaggteigaaa3780aggaaattaataaagcccagaMgcc3tcgccggggaaggaatggg肌tcagtcatgagc3840taatcaccctggagatcagctcccgagatgtcccggatctgactctaatagaccttcctg3900gcataaccagagtggctgtgggC犯tC3gCctgctgacattgggtataagatcaagacac3960tcatcaBgaagteicatccag鄉caggagacaatcagcctggtggtggtccccagtaatg4020tggacattgccaccacagaggctctcagcatggcccaggaggtgg3CCCCg鄉gagaca4080ggaccatcggaatcttgacgaagcctgatctggtggacaaaggaactgaagacaaggttg4140tggacgtggtgcggaacctcgtgttccacctga財aagggttacatgattgtcaagtgcc4200ggggCCElgC3ggagatccaggaccagctgagcctgtccgaagccctgcagagaLgagaagEi4260tcttctttgatatttcagggatctgctggagg肌gg3aaggccacggttc4320cctgcctggc3gaaaaacttaccagcgagctcatcacacatatctgtaaatctctgcccc4380tgttagaaaatcaaatcaeigga_geictcaccagagaataac卿ggagctacaaaagtatg4440gtgtCg3C3taccggaagacga肌atgaaaaaatgttcttCCtg3t3g8taaaatteiatg4500cctttaatcaggacatcactgctctcatgc呵geigagggi肌ctgtaggggaggaaggica4560ttcggctgtttaccagactccgacacgagttccacaaatggagtacaataattga3aaca4620attttcaagaaggccataaaattttgagtagaaaaatccagaaatttgaaaatcagtatc4680gtggt,gsgctgccaggctttgtgaMtacaggacatttgagacaatcgtgaaacagc4740aaatcaaggcactgga卿gccggctgtggat8tgct3C3caccgtgacggatatggtcc■0ggcttgctttcacagatgtttcgat肌aaaattttgaagagttttttaacctccacagaa4860ccgccaagtcca^aattgaagacattagagcagaacaagagag卿aggtgagaagctga4920tccgcctccacttccagatgg肌caggittgtctactgccaggaccaggtatacaggggtg4980cattgcagaaggtcagagagaaggagctggaagaagaaaiag幼ga^gaaatcctgggatt5040ttggggctttccEiatccagctCggC犯C3gactcttccatgggiggagstctttcagcacc5100tgatggcctatcaccaggaggccagcaagcgcatctccagccacatccctttgatcatcc5160agttcttcatgctccagacgtacggccagca_gcttcagaaggccatgctgcagctcctgc5220aggacaaggacacctacagctggctcctgaaggagcggagcgacaccagcgacaagcgga5280agttcctgaaggagcggcttgcacggctgacgcaggctcggcgccggcttgcccagttcc5340ccggttaggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggcccg5400tttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcc5460cctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaa5520atgaggaLaiattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtgg5580ggcaggacagc肌ggggga^ggattgggaagacaatagcaggceitgctggggELtgCggtgg5640gctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgc5700cctgtagcggcgcsttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac5760ttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcg5820ccggctttccccgtcaagctct犯atcgggggctccctttagggttccgatttagtgctt5880tacggcacctcgsccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgc5940cctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactct6000tgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataaggga6060ttttgccgatttcggccta/ttggttaaaaaatgagctgat11aacaaaaatttaacgcga6120attaattctgtgg城gtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcagg6180cagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaa3gtCCCC6lgg6240ctccccagcaggcagaagtatgc肌agcatgcatctcaatt3gtca_gcaaccatagtccc6300gcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgcccca6360tggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctatt6420ccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaa3gctcccgggagc6480ttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggeitcgtttcgcatgattga6540ttgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctstga6600ctgggcac犯cagax:aatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggg6660gcgcccggttctttttgtcaeigaccgacctgtccggtgccctgaatg肌ctgc鄉acga6720ggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgt6780tgtcactgaagcgggaagggactggctgctELttgggCg肌gtgccggggcaggatctcct6840gtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggct6900gcatacgcttgatccggctacctgcccattCg8CC3CC肪gcgaaacatcgcatcgagcg6960agcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatca7020ggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgscggcgEigga7080tctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtgg肌aatggccgctt7140ttctggeittc3tCg3Ctgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgtt7200ggctacccgtgeitattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgct7260ttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagtt7320cttctgagcgggactctggggttcg犯atgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatca7380Cg3g3tttCgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgg7440gacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacccc7500aacttgtttattgcagcttataatggttacatagcatcacaaatttcaca7560aataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatct7620tatcatgtctgtataccgtcgacctctagct卿gcttggcgtaatcatggtcatagctg7680tttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcata7740肌gtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagct朋ctc3cattaattgcgttgcgctca7800ctgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgccggccaacgc7860gcgggg卿ggcggtttgcgtsttgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctg7920cgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggt犯t8Cggtt37980tcc8cag犯tcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaa肌ggccagcaaaaggcc80403ggaaccgteiaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgag8100catcacaaaaatcgacgctcaagtc卿ggtggcgaaaccCg3C3gg3Ctata肌gat6ic8160caggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttacc8220ggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgt8280aggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacg犯cccccc8340gttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggta^ga8400cscgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgta8460ggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactag8520tttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttga8580tccggcaaac肌acceiccgctggtagcggtttttttgtttgca^gc3gc3gattacgcgc8640a_gaaaaa_a^ggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctga_cgctcagtgg8700cacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaiaaggatcttcacctag8760atccttttaaa^tta犯eiatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttgg8820tctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt8880tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacg3tacggg3gggcttacca8940tctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatca■0gc犯taasccagccagccggaagggccgagcgc卿agtggtcctgcaactttatccgcc9060tccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagt912014ttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatg9180gcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgc9240aa犯aagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtg9300ttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgt犯g89360tgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcga9420ccgagttgctcttgcccggcgtcaatacggg3t肪t3CCgcgccacatagcagaacttta9480aaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctg9540ttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttact9600ttcaccagcgtttctgggtgggaaggca肌atgccgcaaaaa_agggaata9660鄉gCg3C3Cggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatt9720tatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttsgaa9780ggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc982權利要求1、表達雙基因的真核表達載體，其序列含有植酸酶基因表達盒和人粘病毒抗性基因1表達盒。2、根據權利要求1所述的載體，其特徵在於所述植酸酶基因表達盒是由依次串聯的CMV啟動子、植酸酶基因和BGH終止子組成；所述人粘病毒抗性基因1表達盒由依次串聯的CMV啟動子、人粘病毒抗性基因1和BGH終止子組成；所述植酸酶基因具有GENBANK號為AF537219的自5'端第10—1308位核苷酸序列；所述人粘病毒抗性基因1具有GENBANK號為BC032602的自5'端第292—2280位核苷酸序列；所述C匿啟動子具有GENBANK號為X03922的自5'端第541—1128位核苷酸序列；所述BGH終止子具有GENBANK號為FJ495179的自5'端第55恥一5881位核苷酸序列。3、根據權利要求2所述的載體，其特徵在於所述表達雙基因的真核表達載體是以pcDNA3.1(+)載體為出發載體構建得到。4、根據權利要求3所述的載體，其特徵在於所述表達雙基因的真核表達載體的核苷酸序列為序列表中序列1。全文摘要本發明公開了一種表達雙基因的真核表達載體。該載體，其序列其序列含有植酸酶基因表達盒和人粘病毒抗性基因1表達盒。本發明的表達載體在細胞水平上驗證了含雙基因的表達載體的表達效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。本發明的含雙基因的AMP質粒轉染豬PK15細胞及製備轉基因小鼠，通過定量PCR檢測出AMP的表達雙基因(植酸酶基因(appA)和人粘病毒抗性基因1(Mx1))的效率幾乎和兩單基因組表達效率相當。文檔編號C12N15/85GK101608189SQ200910089428公開日2009年12月23日申請日期2009年7月17日優先權日2009年7月17日發明者奎李,白立景,鞠輝明申請人:中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所