抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸稈分解菌劑及其製備方法
2023-05-27 21:25:36
抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸稈分解菌劑及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸稈分解菌劑及其製備方法，利用纖維素酶活性高、同時能夠抑制蘆蒿連作土壤中絲核菌、鐮刀菌等土傳病原菌的枯草芽孢桿菌菌株和裡氏木黴菌株，生產蘆蒿秸稈分解菌劑。該菌劑能夠加速蘆蒿連作土壤中蘆蒿秸稈殘茬的分解速度，同時抑制秸稈殘茬上病原微生物的繁殖增生，降低蘆蒿連作障礙的危害。菌劑中功能微生物數量≧2×108cfug-1，含水量小於15%，有機質含量大於35%。試驗表明，蘆蒿連作障礙發病嚴重地塊，施用蘆蒿秸稈殘茬分解菌劑後，相較於不使用分解菌劑土壤，蘆蒿秸稈分解失重率提高80.9%，下茬蘆蒿發病率降低75%，蘆蒿產量增116%；該秸稈分解菌劑能夠很好的抑制蘆蒿的連作病害。
【專利說明】抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸稈分解菌劑及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑及其製備方法，屬於微生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蘆蒿(Jrtemisia selengens Turcz.)又名萎蒿、藜蒿、水蒿、柳蒿、香艾、狹葉艾,為菊科蒿屬多年生草本植物。蘆蒿以鮮嫩莖杆供食用，是廣受喜愛的蔬菜之一，是我國冬春蔬菜市場供應的主要野菜品種之一。
[0003]隨著蘆蒿集約化生產的發展，種植一畝蘆蒿可為農民增收數萬元，部分鄉鎮為單位的蔬菜種植基地，蘆蒿種植面積佔當地耕地面積的60%左右。土壤長期種植一種作物容易造成連作障礙，表現為作物生長緩慢、病蟲害嚴重、作物產質量下降等，尤其是土壤傳播的病害，隨著土壤中病原菌的一茬一茬的積累，病害會越來越嚴重，最終造成作物的絕收，給種植戶造成很大的損失。隨著種植年限和種植強度的增加，不少蘆蒿種植基地已經出現很嚴重的連作障礙現象。剛開始是三五株蘆蒿發病，接下來就是成片的蘆蒿植株死亡，發病的田塊即使停種或者輪作一季，第二年種植蘆蒿還會出現類似的植株發病症狀。
[0004]作物的殘茬(落葉、土壤中根莖和秸杆等)是土傳病原菌的主要附著物，而且據報導，殘茬腐解物能夠促進病原微生物的生長，病原菌隨著植物殘茬在土壤中的分解腐爛，進一步在土壤中增生和定殖，威脅到下茬植物的生產。
[0005]因此，加速作物連作系統中殘茬的分解速度、同時抑制分解過程中病原微生物的生長，是有效地減少土傳病害的治本方法。
[0006]隨著社會發展，對食品安全的要求越來越高，來源於土壤的微生物菌株生產的微生物菌劑，高效無公害，具有十分廣闊的應用前景。
[0007]迄今為止，沒有發現涉及本發明主題的文獻報導。
【發明內容】
[0008]目的:為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供一種抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，能夠抑制蘆蒿連作土壤病原微生物繁殖和增生，該菌劑中的功能微生物能夠在土壤中大量存活和定殖，在分解蘆蒿秸杆等殘茬的過程中抑制土壤病原微生物的生長和繁殖，有效緩解蘆蒿連作障礙對蘆蒿產業的危害。
[0009]技術方案:為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為:
一種抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，其特徵在於:所述蘆蒿秸杆分解菌劑為枯草芽抱桿菌D9 {Bacillus subtilis D9)和裡氏木黴ressi )菌株通過發酵工藝生產，產品有效菌落形成單位(cfu) ^ 2X 18Cfu g4，含水量〈15%。
[0010]所述枯草芽抱桿菌D9 QBacillus subtilis W) 20]Λ年'?只16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，菌株保藏號為CGMCC N0.9170，簡稱為枯草芽孢桿菌CGMCC N0.9170。[0011]所述的枯草芽孢桿菌CGMCC N0.9170的主要生物學特性為:菌落為白色、邊緣不整齊、表面乾燥不透明，革蘭氏染色陽性，具運動性，通過電鏡觀察，杆狀，芽孢中生，兩端鈍圓。
[0012]所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
1)將裡氏木黴接種到木黴液體培養基，進行液體發酵生產裡氏木黴發酵液，其發酵生產的條件為:培養溫度25-30°C，溶氧通氣量範圍為30~100%，110-170rpm,發酵後期菌絲球全部打碎成菌絲片段，裡氏木黴發酵液菌株的菌落形成單位> 0.5 X 18Cfu ml-1 ；
2)將稻殼、秸杆粉和麥麩按照30:40:30比例混合，按照1:1.2-1.5的比例添加水，121°C滅菌30min，製成木黴固體發酵培養基，冷卻到室溫後按照10%的接種量接種裡氏木黴發酵液，20-25°C培養30天，每3-5天翻動固體發酵培養基，發酵結束形成裡氏木黴固體發酵菌種；
3)將枯草芽孢桿菌D9接種到液體發酵培養基製得枯草芽孢桿菌發酵液，其發酵生產的條件為:初始pH範圍為6.5-7.2，培養溫度35-37°C，溶氧通氣量範圍為30~100%，120-180rpm，發酵18h，枯草芽孢桿菌發酵液中芽孢數量> 2 X 108cfu ml—1 ；
4)將製得的枯草芽孢桿菌發酵液按照10%比例接種到固體發酵培養基，發酵溫度為37°C，發酵培養時間為 5天，發酵過程中每10-20小時翻動一次，發酵結束獲得枯草芽孢桿菌D9固體發酵菌種；
5)將裡氏木黴固體發酵菌種和枯草芽孢桿菌D9菌固體發酵菌種按照1:1質量比徹底的混合，用粉碎機粉碎，按照30%質量比添加粉碎碳酸鈣粉，徹底混勻，基質含水量低於15%，包裝即得抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑。
[0013]所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:所述木黴液體培養基配製方法為:土豆澱粉5g,玉米澱粉20g,鹿糖10g, pH值自然，自來水1000ml, 115。。滅菌 30min。
[0014]所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:枯草芽孢桿菌D9的液體發酵培養基配製方法為:葡萄糖3.5g、玉米澱粉8.5g、黃豆柏25g、碳酸鈣3g、硫酸銨lg、硫酸錳0.2g、磷酸二氫鉀0.35g、硫酸鎂0.2g，自來水1000ml, 115°C滅菌
0.5h0
[0015]所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:枯草芽孢桿菌D9的固體發酵培養基的配置方法為:將麩皮80g、稻殼10g、玉米粉5g、豆餅粉5g、硫酸銨0.8g、硫酸鎂0.3g、硫酸錳0.1g徹底混合，按照1:1.2的比例添加自來水，121°C滅菌 30min。
[0016]有益效果:本發明提供的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，通過具有高效分解蘆蒿秸杆能力和抑制蘆蒿土傳病原菌能力的微生物固體發酵，採用一定的工藝生產，本發明的微生物菌劑與目前市場上的產品相比具有如下優點:1)該微生物菌劑能夠快速的分解蘆蒿收穫后土壤中的蘆蒿殘茬，在分解殘茬的過程中能夠有效的抑制蘆蒿土傳病原微生物生長和繁殖。2)蘆蒿連作土壤施用本品2-5kg/畝，蘆蒿秸杆殘茬分解速度增加19.2-80.9%，土壤病原微生物在秸杆殘茬分解過程中，數量減少10.3-52.1%。3)由於菌劑是生物菌株通過一定的工藝生產，完全沒有化學殺菌劑使用所帶來的一系列問題，安全環保，有利於蔬菜安全生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為枯草芽孢桿菌D9對鐮刀菌的拮抗作用；
圖2為枯草芽孢桿菌D9對立枯絲核菌的拮抗作用；
圖3為蘆蒿連作土壤微生物菌劑抑制連作障礙效果的盆缽實驗；
圖4為不同處理對蘆蒿連作地秸杆分解效果；
圖5為不同處理對蘆蒿發病率的影響；
圖6為不同處理對蘆蒿產量的影響。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例對本發明作更進一步的說明。
[0019](一)功能微生物菌株的獲取 在蘆蒿連作田塊，選擇發病率較重田塊中生長最好的植株，採集該植物根際土壤，低溫保存，採用馬丁氏培養基分離真菌，牛肉膏蛋白腖培養基分離細菌，高氏一號培養基分離放線菌。
[0020]上述馬丁氏培養基配製方法為(以配製IL培養基為例):蛋白腖5g,葡萄糖1g,KH2P04 lg，MgS04 0.5g，瓊脂 20g，水 1000ml,pH 自然，1% 孟加拉紅水溶液 3.3ml, 115°C滅菌30min，臨用時每10ml培養基中加1%鏈黴素液0.3ml。上述牛肉膏蛋白腖培養基配製方法為(以配製IL培養基為例):牛肉膏3g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，pH=7.2，自來水1000ml，121°C滅菌20min。上述高氏一號培養基的配製方法為(以配製IL培養基為例):可溶性澱粉 20g、KNO3 lg、K2HPO4 0.5g、MgSO4 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4 0.01g、pH 值自然，配製時，先用少量冷水，將澱粉調成糊狀，倒入少量水中加熱，使澱粉溶解，然後加入其它成分，補足水分至 1000ml, 121°C 滅菌 20min。
[0021]分離出來的菌株用PDA培養基進一步擴大培養。真菌培養條件為:25°C，培養4天。放線菌用高氏一號的培養條件為:33°C，培養48h。細菌的培養條件為:35°C，培養18h。上述PDA培養基的配置方法為(以配製IL培養基為例):取200g洗淨去皮的馬鈴薯切成小塊，沸水煮20min，用2層紗布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，水分補充至1000ml，20g瓊月旨，115°C滅菌30min。
[0022]以蘆蒿連作土壤中立枯絲核菌和鐮刀菌作為生物防治的目標菌株，採用平皿對峙培養，能夠顯著抑制立枯絲核菌和鐮刀菌的微生物菌株選擇備用。
[0023]採用濾紙培養基進一步測定分離出來的菌株，纖維素酶活性最高的菌株選擇留用。上述濾紙培養基配方為:(NH4) 2S04 lg, KH2PO4 lg, MgSO4 0.7g，NaCl 0.5g，瓊脂 20g,純淨水1000ml ,濾紙條I片。
[0024]從健康蘆蒿根際分離出來的、能夠抑制立枯絲核菌和鐮刀菌菌株並且能夠高效分解纖維素和蘆蒿秸杆殘茬的菌株屬於枯草芽孢桿菌iBacillus subtilis、，鋃號D9，對立枯絲核菌和鐮刀菌抑制效果分別如圖1和圖2所示。主要生物學特徵為:菌落為白色、邊緣不整齊、表面乾燥不透明，革蘭氏染色陽性，具運動性，通過電鏡觀察，菌體杆狀，芽孢中生，兩端鈍圓。生理生化測試顯示，接觸酶陽性，氧化酶陰性，V-P反應陽性，能利用甘露醇、麥芽糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、檸檬酸鹽，能還原硝酸鹽成亞硝酸鹽，不能利用丙二酸鹽。能水解澱粉、明膠和酪素。16S rRNA序列進化分析顯示該菌株和枯草芽孢桿菌相似度為99%。該菌株保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，菌株保藏號為CGMCC N0.9170，簡稱為枯草芽孢桿菌CGMCC N0.9170。
[0025]裡氏木黴菌株由河海大學農業環境研究所提供，菌株5天發酵液纖維素酶活為33.6U ml—1，能夠快速的腐解水稻秸杆、小麥秸杆、蘆蒿秸杆。
[0026](二)菌劑生產
1)將裡氏木黴接種到木黴液體培養基，進行液體發酵生產，其發酵生產的條件為:培養溫度25-30°C，溶氧通氣量範圍為30~100%，110-170rpm，發酵後期菌絲球全部打碎成菌絲片段，發酵液菌株的菌落形成單位≥ 0.5 X 18Cfu ml-11 ;木黴液體培養基為:土豆澱粉5g,玉米澱粉20g,鹿糖10g, pH值自然，自來水1000ml, 115°C滅菌30min。
[0027]2)將稻殼、秸杆粉和麥麩按照30:40:30比例徹底的混合，按照1: 1.2-1.5的比例添加水，121°C滅菌30min，製成木黴固體發酵培養基，冷卻到室溫後按照10%的接種量接種步驟I)裡氏木黴發酵液，20-25°C培養30天，每3-5天翻動固體發酵培養基，發酵結束形成木黴固體發酵物。
[0028]3)將枯草芽孢桿菌D9接種到液體發酵培養基，其發酵生產的條件為:初始pH範圍為6.5-7.2，培養溫度35-37 °C，溶氧通氣量範圍為30~100%，120-180rpm,發酵18h，發酵液中芽孢數量> 2 X 18Cfu cml-1 ;枯草芽孢桿菌D9液體發酵液配方為:葡萄糖3.5g、玉米澱粉8.5g、黃豆柏25g、碳酸鈣3g、硫酸銨lg、硫酸錳0.2g、磷酸二氫鉀0.35g、硫酸鎂0.2g，自來水 1000ml, 115°C滅菌 0.5h。
[0029]4)將麩皮80g、稻殼10g、玉米粉5g、豆餅粉5g、硫酸銨0.8g、硫酸鎂0.3g、硫酸錳0.1g徹底混合，按照1:1.2的比例添加自來水，121°C滅菌30min，製成枯草芽孢桿菌D9的固體發酵培養基。將步驟3)枯草芽孢桿菌發酵液按照10%比例接種到固體發酵培養基，發酵溫度為37°C，發酵培養時間為5天，發酵過程中每10-20小時翻動一次，發酵結束獲得枯草芽孢桿菌D9固體發酵物。
[0030]5)將步驟2)和4)的裡氏木黴固體發酵菌種和枯草芽孢桿菌D9菌固體發酵菌種按照1:1質量比徹底的混合，用粉碎機粉碎，按照30%質量比添加粉碎碳酸鈣粉，徹底混勻，基質含水量低於15%，包裝出廠即為具有抑制蘆蒿土傳病害的蘆蒿秸杆分解菌劑。
[0031](三)蘆蒿連作土壤中秸杆殘茬分解和抑病試驗
1.盆栽實驗
實驗選用種植蘆蒿5年連作土壤，每年「冬春」蘆蒿和「伏秋」蘆蒿種植間歇，主要種植玉米、大豆等作物。蘆蒿發病率較高的年份，「伏秋」蘆蒿發病率約為60%，蘆蒿減產約80%。
[0032]試驗設置2個處理，分別為:
處理1，對照處理，土壤不使用分解菌劑；
處理2，分解菌劑處理,土壤施用分解菌劑lg/kg 土壤。
[0033]種植品種為碎葉蒿，盆缽(直徑25cm，高18cm)放入5kg連作土壤(包括土壤中上茬蘆蒿的落葉、根和秸杆等殘茬)，土壤施用50g豬糞堆肥，1.0g尿素，溫室溫度23-35°C，溼度
60-100%ο
[0034]實驗結果如圖3所示，對照處理的平均株高為25cm，鮮重5.3g，發病率為39%，上季秸杆腐爛失重率為46% ;使用秸杆腐熟劑的處理蘆蒿的平均株高為52cm，單株平均鮮重為35g，發病率為12%，上季秸杆腐爛失重率為83% ;秸杆腐熟劑能夠有效的增加連作土壤中蘆蒿的株高、鮮重，加速土壤中蘆蒿殘茬的分解，降低蘆蒿的發病率。
[0035]2.田間試驗
試驗大棚種植蘆蒿5年，每年「冬春」蘆蒿和「伏秋」蘆蒿種植間歇，主要種植玉米、大豆等作物。蘆蒿發病率較高的年份，「伏秋」蘆蒿發病率約為60%，蘆蒿減產約80%。
[0036]試驗設置3個處理，分別為:
處理1，對照處理，土壤不使用分解菌劑；
處理2,分解菌劑處理,土壤施用分解菌劑5kg/畝；
處理3，多菌靈處理，50%可溼性粉劑1000倍液，每隔30天噴施一次。
[0037]種植品種為碎葉蒿，小區面積100平方米。5月初，在留種田塊挖取植株移栽到試驗大棚，行距30釐米，株距30釐米，每穴栽種2株，栽後踏緊，澆透水。施用有機肥100kg/畝作為基肥，追施25kg尿素。
[0038]蘆蒿連作地秸杆分解失重率如圖4所示，施用秸杆分解菌劑處理秸杆失重率比對照處理高80.9% (p>0.05)，噴施多菌靈對秸杆失重率沒有顯著影響(/7>0.05)。
[0039]蘆蒿累積的發 病率如圖5所示，對照處理蘆蒿發病率顯著的高於施用分解菌劑和噴施多菌靈的處理，分解菌劑處理和噴施多菌靈處理的蘆蒿發病率之間沒有統計學差異(/7>0.05)。施用分解菌劑處理髮病率降低了 75%。
[0040]不同處理蘆蒿的產量如圖6所示，施用分解菌劑處理蘆蒿產量顯著的高於對照和噴施多菌靈處理(/7>0.05)，施用分解菌劑處理蘆蒿產量比對照高116%。
[0041]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，其特徵在於:所述蘆蒿秸杆分解菌劑為枯草芽抱桿菌D9 {Bacillus subtilis D9)和裡氏木黴ressi )菌株通過發酵工藝生產，產品有效菌落形成單位(cfu) ≥2X 18Cfu g4，含水量〈15%。
2.根據權利要求1所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，其特徵在於:所述枯草芽孢桿菌D9 (,Bacillus subtilis D9) 2014年5月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，菌株保藏號為CGMCC N0.9170，簡稱為枯草芽孢桿菌CGMCC N0.9170。
3.根據權利要求2所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑，其特徵在於:所述的枯草芽孢桿菌CGMCC N0.9170的主要生物學特性為:菌落為白色、邊緣不整齊、表面乾燥不透明，革蘭氏染色陽性，具運動性，通過電鏡觀察，杆狀，芽孢中生，兩端鈍圓。
4.根據權利要求1-3任一項所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)將裡氏木黴接種到木黴液體培養基，進行液體發酵生產裡氏木黴發酵液，其發酵生產的條件為:培養溫度25-30°C，溶氧通氣量範圍為30~100%，110-170rpm,發酵後期菌絲球全部打碎成菌絲片段，裡氏木黴發酵液菌株的菌落形成單位≥0.5 X 18Cfu ml-1 ； 2)將稻殼、秸杆粉和麥麩按照30:40:30比例混合，按照1:1.2-1.5的比例添加水，121°C滅菌30min，製成木黴固體發酵培養基，冷卻到室溫後按照10%的接種量接種裡氏木黴發酵液，20-25°C培養30天，每3-5天翻動固體發酵培養基，發酵結束形成裡氏木黴固體發酵菌種； 3)將枯草芽孢桿菌D9接種到液體發酵培養基製得枯草芽孢桿菌發酵液，其發酵生產的條件為:初始pH範圍為6.5-7.2，培養溫度35-37°C，溶氧通氣量範圍為30~100%，120-180rpm，發酵18h，枯草芽孢桿菌發酵液中芽孢數量≥2 X 108cfu ml—1 ； 4)將製得的枯草芽孢桿菌發酵液按照10%比例接種到固體發酵培養基，發酵溫度為37°C，發酵培養時間為5天，發酵過程中每10-20小時翻動一次，發酵結束獲得枯草芽孢桿菌D9固體發酵菌種； 5)將裡氏木黴固體發酵菌種和枯草芽孢桿菌D9菌固體發酵菌種按照1:1質量比徹底的混合，用粉碎機粉碎，按照30%質量比添加粉碎碳酸鈣粉，徹底混勻，基質含水量低於15%，包裝即得抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑。
5.根據權利要求4所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:所述木黴液體培養基配製方法為:土豆澱粉5g,玉米澱粉20g,鹿糖10g, pH值自然，自來水 1000ml, 115°C滅菌 30min。
6.根據權利要求4所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:枯草芽孢桿菌D9的液體發酵培養基配製方法為:葡萄糖3.5g、玉米澱粉8.5g、黃豆柏25g、碳酸鈣3g、硫酸銨lg、硫酸錳0.2g、磷酸二氫鉀0.35g、硫酸鎂0.2g，自來水1000ml, 115°C滅菌 0.5h。
7.根據權利要求4所述的抑制蘆蒿土傳病原菌的蘆蒿秸杆分解菌劑的製備方法，其特徵在於:枯草芽孢桿菌D9的固體發酵培養基的配置方法為:將麩皮80g、稻殼10g、玉米粉5g、豆餅粉5g、硫酸銨0.8g、硫酸鎂0.3g、硫酸錳0.1g徹底混合，按照1:1.2的比例添加自來水，121°C滅菌30min。
【文檔編號】A01N63/02GK104026153SQ201410261688
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優先權日:2014年6月12日
【發明者】陳立華, 常義軍, 王長春, 張營, 唐丹, 翟亞明, 談俊益 申請人:河海大學