一種細胞電融合晶片及加工方法
2023-07-01 18:27:31
專利名稱：一種細胞電融合晶片及加工方法
技術領域：
本發明涉及生物細胞電融合的裝置。具體地，本發明涉及提供細胞電融合的晶片，提供 並產生細胞排隊、電致穿孔、融合所需要的電場強度和電場梯度。
背景技術：
生物細胞通過融合可以形成新的細胞，在現代生物醫學工程基礎領域有著重要的意義。 細胞融合有化學融合方法(如PEG)、物理融合方法，其中物理融合方法中，電場融合方法 因其便於精確控制、重複性好、融合率高等優點而得到了廣泛的應用。
生物細胞處於非均勻電場中時，被電場激化形成偶極子，該偶極子在非均勻電場作用力 下發生運動，即介電電泳(dielectrophoresis),利用電介質電泳可以控制細胞的運動，在細 胞電融合過程中，利用電介質電泳現象使細胞排列成串，壓緊相互接觸的細胞，完成細胞電 融合過程所需的排隊和融合後壓緊。
細胞在強電場作用下，會導致細胞膜穿孔，這種效應稱為細胞膜電致穿孔效應 (electroporation)。在細胞電融合過程中利用電致穿孔效應，使兩接觸的細胞膜穿孔，細胞 間進行膜內物質交換，使細胞質、膜融合，在一定強度的電場作用下的電穿孔是一種可逆穿 孔，細胞膜會在減小或撤銷電場強度時回復原狀，致使細胞電融合過程的膜融合。
根據上述分析，為了實現細胞電融合，暈關鍵的是將細胞置於非均勻電場中，使細胞受 到電介質電泳力和強電場穿孔力。根據電場基本理論電場強度E^V/d，為了獲得較強的電場 強度，必須靠增加電壓或縮短電極間距來實現，在細胞電融合晶片的設計中，以減小電極間 距來實現高電場強度，所以，電極間距可以根據細胞大小進行設計選擇，在細胞尺寸數量級 範圍內，產生足以是細胞膜穿孔所需電壓降低至十幾伏至幾十伏即可，大大降低了細胞電融 合信號發生器設計製造難度，提高了細胞電融合後細胞的成活率。為了獲得非均勻電場，需 要設計合適的電極形狀和電信號，為此，本發明設計了能在相同條件下產生強電場梯度的電 場，即矩形非對稱梳狀電極。
目前國內在細胞電融合晶片研究開發較少，中國專利20061005412Lx是基於晶片概念的 細胞融合裝置，國外在該領域的專利相對較多，如Pohl在1982年申請的美國專利(4326934)、 Chang在1994年的美國專利(5304486)等。目前的細胞電融合晶片一方面在微電極數量上 較少，不能實現高通量融合，另一方面，微電極產生的電場強度和電場梯度比較弱，在細胞
的精確控制方面顯得比較弱，而且加工材料選擇方面抗腐蝕、抗氧化能力也較弱，本發明能 較好解決以上問題。
國內外相關專利如下
200610054121.x， 2006年，重慶大學，趙志強等；
CN1482234, 2003年，中國科學院上海技術物理研究所，張濤等；
CN86210174, 1995年，遼寧腫瘤研究所，梁偉；
4326934, April 27， 1982， Pohl;
441972, April 10, 1982, Pohl;
4578168， March 25，1986，Hofinan;
4695547,September 22， 1987,Hillard;
4699881,Oct. 13,1987，Matschke et. al;
5007995,Apr. 16， 1991 ，Takahizuki.
發明內容
針對現有技術存在的上述不足，本發明提出一種細胞電融合晶片及加工方法，對晶片從 結構、材料、加工工藝、封裝進行了重新設計，以使融合過程中的電場誘導力達到最大，提 高細胞聚集排隊和電穿孔的能力，從而提高細胞電融合效率。
本發明的技術方案如下
一種細胞電融合晶片，由陶瓷管芯、安裝在陶瓷管芯的安裝窗口中的晶片和將晶片封裝 在窗口內的蓋玻片組成。其中，晶片的絕緣基底材料上加工有獨立可控的融合小池，融合小 池中加工有梳狀微電極組，梳狀電極組的梳齒呈交叉插入狀，並引出導線，梳狀微電極組的 梳齒兩側加工有矩形微電極，同一融合小池中的矩形微電極按陣列分布，並且相鄰梳齒上的 矩形微電極交錯相向，梳齒之間形成連續的微流通道，微流通道與該融合小池的細胞進樣通 道連通。
所述晶片上的融合小池至少有兩個，各融合小池中的梳狀電極組尺寸各不相同，各融合 小池中相鄰梳齒上交錯相向的相鄰矩形微電極的近角距離的範圍從20微米到100微米不等， 但同一融合小池中相鄰梳齒上交錯相向的相鄰矩形微電極的近角距離是相同的。以相鄰梳齒 上交錯相向的相鄰矩形微電極的近角連線為斜邊d，以相鄰梳齒上交錯相向的矩形微電極的 橫向和縱向平行間距為兩直角邊c和a，它們形成的直角三角形滿足夠勾股定理，a:c:d-3:4:5。 矩形微電極的寬度b為50微米，同一梳齒上相鄰矩形微電極的間距為2a+b。 每個小池中梳狀微電極組引出導線各自獨立成對，連接獨立的控制電信號，這樣可以 單獨對每個小池的微電極施加融合電信號，而其它融合小池不會受到幹擾。所述電極的引出 導線採用金絲鍵合。
梳狀微電極組從上到下依次由金電鍍層、金濺射層、鉻濺射層和絕緣基底構成。所述鉻 濺射層的厚度為200-300納米，金濺射層的厚度為l-2微米。
所述晶片的絕緣基底材料選用玻璃、矽或聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane (PDMS)。
細胞電融合晶片微電極加工工藝採用以下工藝流程濺射鉻一刻蝕電極一濺射鉻—刻蝕 鉻一蒸發金一電鍍金一刻蝕金。 本發明的優點如下
1、 在晶片的微電極結構、排列、分布上進行了系統設計和優化，採用了獨特結構的矩 形非對稱梳狀電極，其結構、分布、排列可以提高微電極周圍和微通道內部的電場強度和電 場梯度，同時對細胞在微通道內的流場分布更加有利於細胞運動，該結構的微電極組成形成 的電場強度和電場梯度能夠達到最大，即融合過程中的電場誘導力達到最大，該誘導力大大 提高了細胞聚集排隊和電穿孔的能力，從而提高細胞電融合效率。
2、 晶片在結構上由多個細胞融合小池組成，各融合小池內微電極結構尺寸各不相同，
以滿足不同尺寸的細胞能在同意中晶片中進行融合。各小池分別獨立可控並互不影響，使細 胞電融合控制可一做得更加精確。
3、 晶片對微電極的形狀和尺寸進行了特殊的設計，這是保證獲得強電場和較大梯度電
場的重要因素。
4、 在材料選擇上，以玻璃為基底，提高晶片抗腐蝕、抗氧化能力，而且具有很高的絕 緣性能和機械強度，適宜採用MEMES加工技術完成電極和微通道的加工，保證加工精度和 電極形狀。同時由於玻璃的透光性，能清楚觀察細胞電融合的全過程，便於計算機監控。該 晶片可以清洗，再次使用，降低了實施細胞電融合成本。
5、 在晶片微電極上濺射鉻/金材料，提高晶片微電極的導電性能，提高微電極在縱/橫向 電壓分布的均勻性，使加工後的電極形成的電場更加符合設計要求。特別是克服了矽材料導 電電阻大造成電極深度方向電壓不均勻和隨機性，使得電場分布達不到預先設計的缺陷。
圖1細胞電融合晶片內部結構圖2晶片封裝圖3微電極結構尺寸圖4晶片加工工藝流程圖5微電極3-D示意圖6細胞排隊實驗的電鏡圖片；
圖7細胞融合實驗的電鏡圖片。
具體實施例方式
實施例h
參見圖2，細胞電融合晶片封裝結構圖，圖中1是標準40DIP封裝的陶瓷管芯，2是芯 片安裝窗口， 3是封裝玻璃。加工完成的玻璃基底晶片4置於晶片安裝窗口2處，並黏合在 窗口底部，然後通過鍵合技術用金絲將晶片電極與管芯內的引腳相連，最後用蓋玻片將晶片 4封裝在晶片安裝窗口2中。
如圖1所示，晶片4是在玻璃基底上加工獨立可控的六融合小池5、 6、 7、 8、 9、 10構 成，各融合小池中加工有梳狀微電極組11，梳狀電極組11的梳齒12呈交叉插入狀，並引出 導線，在梳齒12兩側加工矩形微電極13，同一融合小池中的矩形微電極13按陣列分布，並 且相鄰梳齒上的矩形微電極交錯相向，梳齒之間形成連續的微流通道14,微流通道14與該 融合小池的細胞進樣通道15連通。
圖3為矩形非對稱梳狀電極分布、結構、排列示意圖，六個小池的電極結構、形狀、分 布完全相同，不同的是電極大小尺寸不同，使同一種晶片能夠至少滿足六種尺度的細胞進行 電融合。以相鄰梳齒上交錯相向的相鄰矩形微電極13的近角連線為斜邊d，以相鄰梳齒上交 錯相向的矩形微電極的橫向和縱向平行間距為兩直角邊c和a，矩形微電極的寬度b，同一 梳齒上相鄰矩形微電極的間距為e，微電極的其尺度為a、 c、 d尺度構成直角三角形的條 邊且滿足勾股定理(3: 4: 5比例)，d的尺度分別為20、 40、 50、 60、 80、 IOO微米(對應 於六個小池)，b的尺度均為50微米，e的尺寸-a尺寸的2倍+b尺寸。微電極高度(可根據 圖3看出)等於圖3中d的尺寸。形成的直角三角形滿足夠勾股定理，a:c:d=3:4:5。
本細胞電融合晶片是採用玻璃作為基底，採用MEMES技術在玻璃上刻蝕矩形非對稱梳 狀電極並形成容納細胞及緩衝液的微通道，微電極表層採用鉻/金材料，利用濺射和電鍍技 術使鉻/金材料均勻覆蓋整個微電極。晶片加工工藝基本流程見圖4，主要工藝為A、濺射 鉻(Cr):便於刻蝕玻璃後能在顯微鏡下看清楚電極；B、刻蝕電極首先刻蝕掉Cr,然後
採用離子刻蝕技術保證垂直斷面兩次刻蝕玻璃，兩次刻蝕確保刻蝕深度；C、濺射鉻(Cr): 確保金與玻璃之間有良好的粘附力；D、刻蝕底層Cr:確保橫向電極之間絕緣；E、蒸發 金約幾500-600埃；F、電鍍Au(約lpm); G、刻蝕底層Au:確保橫向電極之間絕緣。
圖5是微電極、微通道的3-D示意圖。其材料分別為16是玻璃基底，厚度為lmm, 17是金屬鉻，厚度為200-300納米(根據加工工藝設備決定)，目的是保證金與玻璃能夠有 很好的粘附力，18是蒸發的金(Au)，厚度為500—600埃，19是電鍍的金，厚度為1-2微米， 不一次蒸發到1-2微米的金是為了降低加工成本。
實驗效果
我們採用MEMES加工技術，製作了細胞電融合晶片原型，並進行了動物、微生物、植 物原生質體(黃瓜葉片細胞)的融合研究。
在施加排對信號(一種類正弦信號)後可以觀察到，絕大多數細胞沿電極對角方向排列， 更多地集中於接近電極尖端的地方(見圖6)。
在4 0V直流脈衝控制電壓條件下，緊挨在一起的植物原生質體間出現了明顯的融合(見 圖7)。根據計算得到的融合效率達到了 40%左右，大大高於傳統的化學(PEG小於iy。)方 法和電融合方法(小於10%)。這表明，該設計方案可以大大提高融合效率，實現高通量的 細胞融合。
權利要求
1.一種細胞電融合晶片，由陶瓷管芯、安裝在陶瓷管芯的安裝窗口中的晶片和將晶片封裝在窗口內的蓋玻片組成；其特徵在於晶片的絕緣基底材料上加工有獨立可控的融合小池，融合小池中加工有梳狀微電極組，梳狀電極組的梳齒呈交叉插入狀，並引出導線，梳狀微電極組的梳齒兩側加工有矩形微電極，同一融合小池中的矩形微電極按陣列分布，並且相鄰梳齒上的矩形微電極交錯相向，梳齒之間形成連續的微流通道，微流通道與該融合小池的細胞進樣通道連通。
2. 根據權利要求1所述的細胞電融合晶片，其特徵在於融合小池至少有兩個，各融合 小池中的梳狀電極組尺寸各不相同，各融合小池中相鄰梳齒上交錯相向的相鄰矩形微 電極的近角距離的範圍從20微米到100微米不等，但同一融合小池中相鄰梳齒上交 錯相向的相鄰矩形微電極的近角距離是相同的。
3. 根據權利要求1或2所述的細胞電融合晶片，其特徵在於以相鄰梳齒上交錯相向的 相鄰矩形微電極的近角連線為斜邊d，以相鄰梳齒上交錯相向的矩形微電極的橫向和 縱向平行間距為兩直角邊c和a，形成的直角三角形滿足夠勾股定理，a:c:d=3:4:5。
4. 根據權利要求3所述的細胞電融合晶片，其特徵在於矩形微電極的寬度b為50微 米，同一梳齒上相鄰矩形微電極的間距e為2a+b。
5. 根據權利要求4所述的細胞電融合晶片，其特徵在於每個小池中梳狀微電極組引出 導線各自連接獨立的控制電信號。
6. 根據權利要求5所述的細胞電融合晶片，其特徵在於所述電極的引出導線採用金絲 鍵合。
7. 根據權利要求6所述的細胞電融合晶片，其特徵在於梳狀微電極組從上到下依次由金電鍍層、金濺射層、鉻濺射層和絕緣基底構成。
8. 根據權利要求7所述的細胞電融合晶片，其特徵在於所述鉻濺射層的厚度為200-300 納米，金濺射層的厚度為l-2微米。
9. 根據權利要求8所述的細胞電融合晶片，其特徵在於所述晶片的絕緣基底材料選用 玻璃、矽或聚二甲基矽氧垸。
10. 權利要求9所述的細胞電融合晶片的加工方法，其步驟如下(1)在玻璃基底上濺射鉻Cr:(2) 刻蝕電極首先刻蝕掉Cr,然後採用離子刻蝕技術保證垂直斷面兩次刻蝕玻璃, 兩次刻蝕確保刻蝕深度；(3) 再濺射鉻Cr，確保金與玻璃之間有良好的粘附力；(4) 刻蝕底層Cr，確保橫向電極之間絕緣；(5) 蒸發金，約500-600埃;(6) 電鍍Au,約l拜；(7) 刻蝕底層Au，確保橫向電極之間絕緣，獲得玻璃基底晶片；(8)採用標準40DIP封裝的陶瓷管芯，加工完成的玻璃基底晶片置於晶片安裝窗口 處，並黏合在窗口底部，然後通過鍵合技術用金絲將晶片電極與管芯內的引腳相連，最 後用蓋玻片將晶片封裝在晶片安裝窗口中。
全文摘要
本發明涉及一種細胞電融合晶片，由陶瓷管芯、安裝在陶瓷管芯的安裝窗口中的晶片和將晶片封裝在窗口內的蓋玻片組成；晶片的絕緣基底材料上加工有獨立可控的融合小池，融合小池中加工有梳狀微電極組，梳狀電極組的梳齒呈交叉插入狀，並引出導線，梳狀微電極組的梳齒兩側加工有矩形微電極，同一融合小池中的矩形微電極按陣列分布，並且相鄰梳齒上的矩形微電極交錯相向，梳齒之間形成連續的微流通道，微流通道與該融合小池的細胞進樣通道連通。本發明對晶片從結構、材料、加工工藝、封裝進行了重新設計，使融合過程中的電場誘導力達到最大，可提高細胞聚集排隊和電穿孔的能力，從而提高了細胞電融合效率。
文檔編號C12M1/42GK101168724SQ20071009289
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月26日 優先權日2007年10月26日
發明者侯文生, 張瑞強, 毅 曹, 軍 楊, 靜 楊, 寧 胡, 蓉 許, 鄭小林 申請人:重慶大學