一種控制水稻抽穗期基因及其應用的製作方法

2023-07-01 15:17:11

專利名稱：：一種控制水稻抽穗期基因及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於植物基因工程領域。具體涉及一種控制水稻抽穗期基因，採用正向遺傳學的方法，篩選水稻T-DNA插入突變體庫，通過突變表型與T-DNA插入位點基因共分離檢測及互補實驗證明，分離克隆的OsCM2基因為控制水稻抽穗期基因。本發明還涉及含有該基因或其同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調控植物的抽穗期在農業生產中的應用。
背景技術：
：水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人以其為主食。同時，由於水稻具有基因組小、精細的遺傳和物理圖譜、相對容易的轉基因技術及與其它禾本科作物的共線性，而被作為基因組研究的模式植物。隨著包括水稻在內的多種生物基因組測序的完成，人類開始進入後基因組時代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學的前沿領域。水稻基因功能的研究對社會經濟發展和生物學研究具有重大意義。水稻抽穗期是決定品種地區與季節適應性的重要農藝性狀，能否適應特定地區生態環境、栽培耕作制度，主要取決於該品種在當地的生育期。選育早熟高產的水稻品種一直為水稻育種家所重視，水稻早熟基因的發現和利用將有助於解決早熟與豐產難以兼顧的矛盾，也有利於克服秈粳亞種間F1超親遲熟的障礙。水稻秈粳亞種間雜種具有強大的雜種優勢。但目前亞種間強優組合的廣泛選配和實際利用仍受到諸多限制，其中生育期超親就是最主要的制約因素之一。抽穗期遺傳研究對指導育種實踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，另外越來越頻繁的自然災害使選育合適生育期以及抽穗期受環境影響較小的品種在避災利用中顯得尤其重要。因此發掘和鑑定水稻抽穗期基因包括QTL(quantitativetraitlocus)，並深入探討水稻抽穗期基因的分子作用機理，具有重要的理論意義和應用價值。此外，分析抽穗期感光基因在栽培稻主要生態型中的分布頻率，對探討水稻類型的演化、起源與進化，以及種質的合理利用也具有重大意義。同時水稻作為單子葉模式植物，這方面研究也對同類植物特別是禾本科糧食作物的抽穗期基因和QTL研究具有指導意義。研究水稻抽穗期基因和QTL的最終目的是促進水稻遺傳育種，實現水稻早熟高產。(董春林等，水稻抽穗期基因研究進展。中國農學通報，2005，21(6)75-78；嶽兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進展。分子植物育種，2005，3(2)222-228；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農業大學學報，2001，19(2)172-178)抽穗期的長短主要由品種的基本營養生長、感光性和感溫性決定，但感溫性與水稻的抽穗期沒有直接關係。在生理上，水稻生育期可分為營養生長階段和生殖生長階段，營養生長階段又可分為基本營養階段(basicvegetativephase，BVP)和感光階段(photoperiodsensitivephase，PSP)。水稻的生殖生長期和成熟期對大多數水稻品種來說都較穩定，而營養生長期則變化較大。因此，水稻品種生育期的不同主要是營養生長期變化所致，通常可用抽穗期即播種到抽穗的天數來反映生育期長短。由營養生長階段轉入生殖生長階段是水稻感受外界信號完成其生活史的重要過程，植物感受外界光溫信號後，通過一系列信號傳導及放大最終引起營養生長向生殖生長的轉變。感光性和基本營養生長性組合的多樣性及強弱的不同，使得抽穗期呈現多種多樣的變化，同時抽穗期容易受到環境條件的影響，其遺傳基礎較為複雜，一般認為抽穗期是由主效基因和微效基因共同控制的(嶽兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進展。分子植物育種，2005，3(2)222-228；羅林廣等，水稻抽穗期的遺傳學研究。江蘇農業學報，2001，17(2)119～126；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農業大學學報，2001，19(2)172-178)。由於抽穗期的重要性，人們對抽穗期的研究已較為深入。特別是DNA分子標記技術的發展，藉助高密度的分子連鎖圖譜，使數量性狀基因定位工作發展很快。利用分子標記進行水稻抽穗期QTL定位已有不少研究報導。其它禾穀類作物抽穗期QTL定位工作也已廣泛開展。已有的遺傳研究表明在控制水稻抽穗期基因中，感光基因及其修飾基因有18個顯性感光基因有Se-1、Se-3(t)、Se-4(t)、Se-5、E1、E2、E3、E4和U，隱性感光基因有se-2、se-6(t)、se-7(t)、se-9(t)和ef-2(t)，感光修飾基因有i-Se-1、Su-Se-1(t)、En-Se-1(t)和se-pat(t)。感光基因中，效應較大的是位於第6染色體的Se-1和位於第7染色體的E1，可能是控制水稻感光性的2個最主要基因。在已報導的11個非感光基因及其修飾基因中，顯性早熟基因有Ef-1、Ef-x(t)、Ef-y(t)和Ef-cd(t)，隱性早熟基因有ef(t)，隱性遲熟基因有ef-3(t)、ef-4(t)和1ff-3(t)，修飾基因有m-Ef-1w-Ef-1(t)和Su-Ef-cd(t)。而基本營養生長期則由2至3個基因控制。(董春林等，水稻抽穗期基因研究進展。中國農學通報，2005，21(6)75-78)同時不同基因間還存在互作關係，顯性早熟基因位點Ef-1，有增強其早熟效應的修飾基因ma-和mb-Ef-1，及減弱Ef-1早熟效應的修飾基因w-Ef-1。非感光基因之間，如Ef-1與ef-3或ef-4結合時，二者的早、遲熟效應相互抵消，ef-3與ef-4結合時，二者的遲熟效應累加。感光基因與非感光基因之間也存在互作或修飾。如隱性感光基因se-6和se-7在與顯性早熟基因Ef-1結合時，二者的效應可被Ef-1抑制。隱性感光基因ef-2與Ef-1結合時，二者的遲、早熟效應相互抵消，與ef-3或ef-4結合時，二者的遲熟效應累加。強感光基因E1的隱性等位基因e1則是Ef-1的修飾基因。此外隱性基因ef-1和se-1的同時存在可顯著延長水稻的基本營養生長期。控制水稻感光性的基因E1、E2、E3，其中E1基因的作用遠比E2和E3大，但E3的存在，特別是E2和E3同時存在時，E1的感光性效應顯著增強。而隱性感光抑制基因i-Se-1的存在，可抑制Se-1的感光性，使得水稻在長日照下提前抽穗。已有研究表明，大多數早秈品種雖然帶有感光基因但不表現出感光特性，原因就在於這些品種存在隱性感光抑制基因i-Se-1。(羅林廣等，水稻抽穗期的遺傳學研究。江蘇農業學報，2001，17(2)119-126；徐俊鋒等，水稻光溫敏雄性不育系培矮64S的抽穗期基因型分析。遺傳學報，2005，32(1)57-65；鄧曉建等，水稻品種生育期的遺傳和基因定位。四川農業大學學報，2001，19(2)172-178)根據Gramene網站(http://www.gramene.org/qtl/index.html)最新公布的數據，水稻抽穗期QTL定位方面，目前共定位了653個QTLs，分布於水稻12條染色體上，其中第3、7染色體上定位的QTL較多，而第10染色體上發現的最少。對定位的水稻抽穗期QTL構建近等基因系並進行精細定位後，可用圖位克隆法加以克隆。目前有許多控制抽穗期基因已被克隆，如Hdl基因(YanoM.etal.，Hdl，amajorphotoperiodsensitivityquantitativetraitlocusinrice，iscloselyrelatedtotheArabidopsisfloweringtimegeneCONSTANS，ThePlantCell，2000，122473-2483)；SE5基因(IzawaT.etal.，Phytochromesconferthephotoperiodiccontroloffloweringinrice(ashort-dayplant)，PlantJ.，2000，22391-399)；Hd6基因(TakahashiY.etal.，Hd6，aricequantitativetraitlocusinvolvedinphotoperiodsensitivity，encodestheasubunitofproteinkinaseCK2，Proc.Natl.Acad.Sci.，2001，987922-7927)；Hd3a基因(KojimaS.etal.，Hd3a，ariceorthologoftheArabidopsisFTgene，promotestransitiontofloweringdownstreamofHdlundershort-dayconditions，PlantCellPhysiol，2002，431096-1105)；Ehdl基因(DoiK.etal.，Ehdl，aB-typeresponseregulatorinrice，confersshort-daypromotionoffloweringandcontrolsFT-likegeneexpressionindependentlyofHdl，GenesDev.，2004，18(8)926-936)。以上這些抽穗期基因或QTL都是通過傳統圖位克隆法克隆到，首先必須構建一個很好的群體，如重組自交系，DH群體或近等基因系等，再上大量標記，通過基因與標記的共分離，逐漸縮小目標區段，是一個耗時耗力的過程。而通過T-DNA標籤技術克隆基因，完全從另一個不同的角度，打開了克隆抽穗期基因的一扇窗。大量研究表明，農桿菌T-DNA是隨機整合到植物基因組中，由於T-DNA序列已知，猶如給基因組「貼」了一個序列標籤，為分離側翼序列帶來方便。可以通過創建T-DNA插入突變體，觀察突變體抽穗期變異，檢測T-DNA與突變表型共分離，根據分離到的側翼序列，可知道是什麼基因發生突變，再做互補實驗驗證就可以克隆到抽穗期基因。本發明通過T-DNA標籤技術克隆到了控制水稻抽穗期的基因OsCM2。水稻抽穗期遺傳基礎的揭示最終依賴於所有抽穗期基因的克隆及功能分析。對擬南芥的成花基因研究發現，至少存在生物鐘、光周期、春化作用及自主促進開花等路徑。另外，Cerdan和Chory發現還存在一個光質調控植物開花的路徑(CerdanP.D.，andChoryJ.，Regulationoffloweringtimebylightquality，Nature，2003，423881-885)。水稻與擬南芥在誘導開花的基因上具有保守性，水稻作為短日模式植物將與長日模式植物擬南芥一起，在最終揭開植物成花的機理的研究中將發揮不可替代的作用。(嶽兵，邢永忠，水稻抽穗期分子遺傳研究進展。分子植物育種，2005，3(2)222-228)
發明內容本發明的目的在於提供一種控制水稻抽穗期基因OsCM2，該基因從T-DNA插入突變體中鑑定並分離克隆，具有如SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列，或至少50％同源性的序列。以及上述DNA片段編碼的蛋白或經過改造修飾的具有相同功能的蛋白。本發明的另一個目的是提供OsCM2基因在控制水稻抽穗期中的應用，通過OsCM2基因，SEQ.ID.NO1或與其功能等同的同源基因在水稻植株中超量表達或抑制表達，一種分離的蛋白質，其具有SEQIDNO2所示胺基酸序列至少50％同源性的序列，來達到控制水稻抽穗期的目的，從而提高水稻品種的地區與季節適應性。實現本發明的技術如下創建水稻T-DNA插入突變體庫T0代(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35418-27.)。從T0代突變體庫中選出3000份種子(T1代)，正常大田條件下種植，每份種20株(稱為1個家系)。觀察突變體抽穗期變化，共觀察到約72個家系有抽穗期突變。用PCR(polymerasechainreaction)方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，72個突變家系中有35個為PCR陽性共分離。並對每個共分離家系所種的20個單株做PCR陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數，根據孟德爾遺傳規律單位點基因會出現3∶1分離，當陽性∶陰性＝3∶1為單拷貝，檢測結果約有30％家係為單拷貝。對35個T-DNA共分離家系做Tail-PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR)(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離側翼序列。有12個家系分離到側翼序列，分析側翼序列發現6個家系的側翼序列能很好的定位在水稻基因組上。接著設計引物做進一步共分離驗證，如圖2，A表示在插入位點上遊設計的引物，B表示在插入位點下遊設計的引物，C表示根據T-DNA邊界序列設計的引物。在T1代植株中，T-DNA位點純合植株只有A和C配對可以擴增出電泳帶，因為有T-DNA插入A與B配對的產物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由於沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產物。結果6個家系中只有一個家系證明突變表型與T-DNA插入共分離。該突變體比正常植株抽穗遲20天。為了驗證該突變體的遺傳穩定性及進一步驗證共分離情況，又繁殖了一代，結果T2代仍然表現出穩定的突變表型，且表型與基因型完全符合。該突變體T-DNA插入在水稻第2染色體上，為單拷貝，GenBank核苷酸資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中對應的克隆號AP004087，插入該克隆第22640位鹼基旁，分析插入位點附近序列發現，T-DNA插入一個假定的分枝酸變位酶基因中。由於T-DNA上含有EnhancerTrap(SpringerPS.GeneTrapsToolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020)，其上的報告基因帶有一個剪切過的小啟動子，僅含TATAbox和轉錄起始點，不足以啟動報告基因β-glucuronidaseA(GUS)表達，而只有藉助鄰近的增強子元件才能表達。通過檢測報告基因的表達模式，可以判斷該增強子元件所控制基因的表達模式。對突變體GUS染色結果發現在根、莖、葉中全部有GUS表達，這與該基因在擬南芥中的表達模式相同(JennyEberhardetal.，Cloningandexpressioninyeastofahigherplantchorismatemutasemolecularcloning，sequencingofthecDNAandcharacterizationoftheArabidopsisthalianaenzymeexpressedinyeast.PlantJournal，1996，334(2)233-236)。對正常水稻做RNAi(RNAinterference)實驗，結果發現約有1/5的轉化子抽穗時間推遲約17-22天，其它抽穗時間介於突變與正常之間。同時做互補實驗驗證OsCM2基因功能，用限制性內切酶BamHI和PstI(Takara公司)酶切日本晴BAC克隆OSJNBa0037D03(http://www.genome.arizona.edu)可以切出含有OsCM2基因的約11.5KB的片段，連接到載體pCAMBIA2301上(pCAMBIA2301由澳大利亞CAMBIA實驗室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoIntemationalAgriculture)惠贈，採用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法將構建好的互補載體導入抽穗遲突變體。最後獲得互補轉化的組培苗100株，作為對照的由突變體愈傷不經過轉化直接分化得到的30株苗子，以及野生型粳稻品種中花11號愈傷分化苗子30株，都種於大田，結果沒經過互補的突變苗全部表現抽穗遲，野生型粳稻品種中花11號愈傷分化苗抽穗正常，30株互補的轉化苗有50％恢復正常。說明OsCM2基因具有控制抽穗期的功能。本發明的優點1.採用T-DNA標籤法克隆基因速度快，效率高。2.雖然在低等生物和擬南芥中克隆到了分枝酸變位酶基因(chorismatemutase，CM)，但只是對其做酶學特性和生化途徑中的作用進行分析，甚至對CM-2在生化途徑中的作用也很模糊，更不知其具體的生物學功能，目前在水稻中還沒有對CM-2具體研究的報導，本發明克隆的OsCM2基因對水稻抽穗期有顯著的影響，這對闡明分枝酸變位酶基因的生物學功能有重要意義。3.該突變體使抽穗期推遲20天，說明OsCM2基因對改變抽穗期效果很明顯，通過基因工程技術提高或減弱OsCM2基因的表達量能夠控制植物抽穗期。4.水稻抽穗期決定了品種的地區與季節適應性，一個品種能否適應特定地區生態環境、栽培耕作制度，主要取決於該品種在當地的生育期。通過基因工程技術提高或減弱OsCM2基因的表達量能夠達到控制植物抽穗期的目的，OsCM2基因的克隆將有助於提高水稻品種的地區與季節適應性。5.選育早熟高產的水稻品種一直為水稻育種家所重視，水稻早熟基因的發現和利用將有助於解決早熟與豐產難以兼顧的矛盾，通過超量表達OsCM2基因可以達到早熟的目的，從而解決早熟與豐產的矛盾。6.水稻秈粳亞種間雜種具有強大的雜種優勢，但目前亞種間強優組合的廣泛選配和實際利用仍受到諸多限制，其中生育期超親就是最主要的制約因素之一。OsCM2基因的克隆有利於克服秈粳亞種間F1超親遲熟的障礙。7.越來越頻繁的自然災害使選育合適生育期以及抽穗期受環境影響較小的品種在避災利用中顯得尤其重要。OsCM2基因的克隆將有助於培育更適合的品種。8.抽穗期遺傳研究對指導育種實踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義，因此發掘和鑑定水稻抽穗期基因，並深入探討水稻抽穗期基因的分子作用機理，具有重要的理論意義和應用價值。同時水稻作為單子葉模式植物，這方面研究也對同類植物特別是禾本科糧食作物的抽穗期基因研究具有指導意義。水稻抽穗期遺傳基礎的揭示最終依賴於所有抽穗期基因的克隆及功能分析。對擬南芥的成花基因研究發現，至少存在生物鐘、光周期、春化作用及自主促進開花等路徑。水稻與擬南芥在誘導開花的基因上具有保守性，水稻作為短日模式植物將與長日模式植物擬南芥一起，在最終揭開植物成花的機理的研究中將發揮不可替代的作用。圖1.創建突變體庫所用載體圖pSMR-J18R(http://rmd.ncpgr.cn/)。圖2.根據插入位點設計引物驗證共分離示意圖。A表示在插入位點上遊設計的引物，B表示在插入位點下遊設計的引物，C表示根據T-DNA邊界序列設計的引物。在T1代植株中，T-DNA插入位點純合突變體只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由於沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產物，T-DNA插入位點雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產物。圖3.T1代單株根據插入位點設計引物PCR擴增的結果。上一行引物A+B，下一行引物C+B，M表示2KBMaker，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，為T-DNA插入位點純合植株DNA樣品；4，12，13，14，15為T-DNA插入位點雜合植株DNA樣品；6，8，10，17，18為該位點不含T-DNA插入的DNA樣品。PCR擴增結果與該植株田間表型對應發現，T-DNA插入位點純合植株均表現為遲抽穗；T-DNA插入位點雜合與T-DNA陰性植株均表現為抽穗正常。圖4.遲抽穗突變體Oscm2的照片。圖5.T2代驗證共分離的PCR結果。上一行引物A與B配對，下一行引物C與B配對，M表示2KBMaker，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37為T-DNA插入位點純合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40為T-DNA插入位點雜合單株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。圖6.OsCM2基因結構圖。圖7.莽草酸途徑。(LarsM.Voll，TheArabidopsisphenylalanineinsensitivegrowthMutantExhibitsaDeregulatedAminoAcidMetabolism.PlantPhysiology，2004，136，3058-3069)。圖8.抽穗遲Oscm2突變體GUS染色結果。圖9.pHellsgate8載體圖(http://www.pi.csiro.au/tech_licensing_biol/MapsProtocol.htm)。圖10.粳稻品種中花11號RNAi幹涉基因OsCM2後的表型。具體實施例方式實施例1OsCM2基因的分離克隆1.創建突變體庫(T0代)所用載體pSMR-J18R由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈，如圖1，以農桿菌EHA105介導方式在粳稻水稻品種中花11號(OryzasativaL.subsp.japonicacv.Znonghua11)基因組中隨機插入T-DNA(含EnhancerTrap)(SpringerPS.GeneTrapsToolsforplantdevelopmentandgenomics.PlantCell，2000，121007-1020)創建突變體庫，突變體庫的構建是按照Wu等所描述的方法構建而成(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ，2003，35418-427)。目前約得到10萬株獨立轉化子。2.T1代分櫱性狀大田篩選從T0代突變體庫中選出3000份T1代種子，先在秧田劃5×8寸的格子播種，20天後再移栽至大田篩選。每份材料種2行，每行10株，共20株(為1家系)，行與行間間距8寸，株與株間間距5寸。從開始抽穗起，每隔一天下田觀察登記抽穗日期。共觀察到約72個家系有抽穗期突變(與正常中花11抽穗期相比早或遲7天以上)。3.突變株系與T-DNA共分離檢測及T-DNA拷貝數初步分析。用PCR方法檢測突變家系與T-DNA是否共分離，即突變株必需是T-DNA陽性。所用引物GAL4-L5』AGACCGGCAACAGGATTCAATC3』，GAL4-R5』TTCGTCCAGGACAACGTGAACA3』，反應體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3UTaq酶，加ddH2O(無菌去離子水)至20μl。反應程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。擴出的片段為T-DNA上的一個片段，大小為611bp。72個突變家系中有35個為PCR陽性共分離。並對每個共分離家系所種的20個單株做陽性檢測，大致估算T-DNA拷貝數，根據孟德爾遺傳規律單位點基因會出現3∶1分離，當陽性∶陰性＝3∶1時為單拷貝。檢測結果約有30％家係為單拷貝。4.分離側翼序列對35個T-DNA共分離家系按Liu等的Tail-PCR方法(LiuYG，WhittierRF.ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics，1995，25674-681)分離側翼序列。利用CTAB法抽提突變體總DNA，方法如SAGHAI-MAROOF等(SAGHAI-MAROOFetal.，RibosomalDNAspacer-lengthpolymorphismsinbarleyMendelianinheritance，chromosomallocation，andpopulationdynamics.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，818014-8018)。根據轉化載體pSMR-J18R的T-DNA左側末端設計的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對應的位置如下引物LSP25』-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3』6701-6677；LBT2引物5』-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3』6550-6524；LBT3引物5』-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3』6447-6420。用於分離側翼序列的簡併引物及其序列為引物AD2a5』-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3』。反應體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；10μM特異性引物0.2μ1；100μM簡併引物0.2μl；Taq酶lu；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2MmdNTP2.0μl；25MmMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡併引物0.2μl；Taq酶lu；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×buffer2.0μl；2mMdNTP1.5μl；25mMMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μM特異性引物0.2μl；100μM簡併引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH20至20μl。反應程序按照Liu等的方法進行。反應完成後，取第三輪反應產物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上檢測。採用低熔點瓊脂糖挖膠回收的方法純化PCR反應產物。純化方法為將第三輪PCR反應產物在1％的低熔點瓊脂糖上電泳，把擴增產物條帶從膠上切下放入1.5mlEppendoff離心管中，65℃水浴15min，加入等體積PH7.9苯酚，顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入等體積氯仿異戊醇(體積比24∶1)顛倒搖勻5min，13000r/min離心8min，取上清，加入1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，2倍體積預冷的95％乙醇，混勻後置-20℃冰箱中20min以上，13000r/min離心15min，倒掉95％乙醇後再用75％乙醇浸洗沉澱，自然風乾，DNA沉澱溶於20μl無菌去離子水。把回收產物測序，測序引物序列及在載體上位置為引物NTLB55』-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3』6437-6418，有12個家系分離到側翼序列，分析側翼序列發現有6個家系的側翼序列能很好的定位在水稻基因組上。5.根據側翼序列設計引物進一步做共分離檢測根據側翼序列與水稻基因組的匹配情況，確定插入位點，在插入位點的兩邊設計一對引物A和B，及T-DNA上設計一條引物C，如圖2，A表示在插入位點上遊設計的引物，B表示在插入位點下遊設計的引物，C表示根據T-DNA內部序列設計的引物。在T1代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由於沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產物。如果突變性狀是隱性的，那所有突變株用A和B配對擴不出的為共分離。如果突變性狀是顯性的，那所有突變單株用C和B配對都擴出，正常單株用C和B配對都擴不出的為共分離。結果6個家系中只有一個家系是共分離。該家系突變表型，如圖4，該突變體比正常植株抽穗遲20天。其分離的側翼序列全長520bp如下atgctcttattagtaattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcttaccagctgtggcttattgcttggccgaatggtgctgcaaagtgacattctgaccgccatcctgactctttcgccaaaatattttcagctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtggcatgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtactgtatcttggatctttcttcatctctctcgaccatctcgtaccggattttggttttaggaattagaaattttattgatatatttatttaagaaatgcaaatacatagtaagggtttcttatacgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaacatttttgcccttatctgggaaacttcctcccacatattttatggaaaacctcaatttttcccaataaaaaaatcccctggcggaaatctgccttttttttttttt採用BLAST分析方法(AltschulSFetal.，Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.，1990，215403-410)發現側翼序列16-54與載體左末端匹配，93-110，125-285分別和GenBank核苷酸資料庫中的克隆AP004087的22640-22657，22492-22332匹配，同源性高達100％。根據插入位點設計的引物序列為A(引物)5』CCACTAATCCGTGCAAAGGT3』。B(引物)5』CCCTCAGTATCAGCCACCAC3』。C(引物)5』AATCCAGATCCCCCGAATTA3』，PCR反應體系的總體積為20μl，DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶，加ddH2O至20μl。反應程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。PCR結果，如圖3，其中泳道1，2，3，5，7，9，11，16，19，20，為T-DNA純合；4，12，13，14，15為T-DNA雜合；6，8，10，17，18為T-DNA陰性。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。其中突變株偏多，可能是群體偏小，或者是插秧時不完全隨機造成。而到T2代就是3∶1分離。說明該突變表型確實是T-DNA插入造成的。6.T2代進一步做共分離驗證為了驗證該突變體的遺傳穩定性及進一步驗證共分離情況，又繁殖了一代即T2代(將T1代收穫的種子播種得到T2代)，分別種了突變體，雜合子及正常3種類型，突變單株(即T-DNA純合)下一代不再分離，表型一致都是抽穗遲；雜合單株下一代出現3∶1的表型分離，即正常∶抽穗遲＝3∶1；正常植株下一代沒有出現分離，全部正常。同時PCR檢測也表明基因型與表現型吻合，如圖5，泳道1，5，8，12，15，17，21，29，31，36，37為T-DNA純合植株；2，4，7，11，13，14，16，19，20，22，25，27，28，30，33，34，35，40為T-DNA雜合單株；3，6，9，10，18，23，24，26，32，38，39為T-DNA陰性單株。與田間表型對照，T-DNA純合植株表型為抽穗遲；T-DNA雜合與T-DNA陰性植株表型為抽穗正常。由此證明，這個突變體是由於T-DNA插入造成的單位點隱性突變。7.確定突變位點，獲得候選基因，並進行功能分析。採用BLAST分析發現，該突變體T-DNA插入水稻第2染色體，對應GenBank核苷酸資料庫中的克隆號為AP004087，插入該克隆第22640位鹼基旁，分析插入位點附近序列發現，T-DNA插入一個假定的分枝酸變位酶基因CM-2(putativechorismatemutase2)的外顯子中，該基因有全長cDNA，在KOME網站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)對應的克隆號AK101220，全長cDNA序列如下cgtgtggaggatcagcagcagcagctttcccttagctcgcgagctcatcagtcatcacagggcggatcgagagatcatcgatgggcgaggcggagctgagcctggcggcggtgcgcgacgcgctggtgcgggaggaggactccatcgtcttcgccctcatcgagcgcgccaggcgcccgcgcaacgcgccggcatacgcggccgccgccgccgccggcggccgatccctcgccgagttcttcgtccgggaagccgaggttctgcacgccaaggccggacaataccaaaagccagaagatgttccattctttccccaagatctcccttcacctctatttcctaccaaagattacccaaaggttttgcactcttttgcatcatcagtcagtgtgaatgatgcaatatggaagatgtatttcaacgagttgcttccactattcactgtggatggagatgatggtaactatgcagaaacagttgcattagattttgcatgtctgaaggccctgtcaagaagaattcatattggtaaatatgttgctgaggtgaagttcaaagatgcttcccaagattatagtccactaatccgtgcaaaggataccaaggctctgatgaatctgctaacattcaaggcggttgaagagaaggtgaaaaggagagtagagaagaaggccaggatatttggtcagaatgtcactttggaggacaatgctgacaagcaagaaggcaatgcaggtgacagtgagtgcaaagttaatcctgaagtgctatctaagctatatgatctgtgggtaatgcctttgacgaaggatgttgaagttgagtatcttctccgccgtcttgactgattcgccaaaatattttcagctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtggcatgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtactgtatcttggatctttcttcatctccgttttcggagctgagacatatagggcctgtttggtacagctctaactcctaaatttagctccaagagttgggtctggagtggagttgtggagctgcctaaacccagctccacaactctagttcattttgtgagagagctccacccagctccactcccagttttggtggagctgaaactgtttggctgagctccagctccaggaggggtagagctggagctggagctgtgccaaaacaggcccatagattgatggcaatgatctgcaacccaaaaggttcatcctacctaactgtggtggctgatactgagggcctggtgaattcccagcaaagatgctgcaactccagtttctgtaacaatctgtaactcctgttattatatcaccatagttttgtgctacttcttggtagtagcatttctgttc。該基因結構如圖6。其編碼的蛋白與擬南芥的CM-2有50％同源性。分枝酸變位酶CM(Chorismatemutase，EC5.4.99.5)是莽草酸途徑中分枝部位的第一個酶，當代謝終產物苯丙氨酸，酪氨酸過量時會抑制分枝酸變位酶活性，同時另一分枝代謝產物色氨酸過量時會激活分枝酸變位酶活性，如圖7。生物體中許多物質都含有苯環，它們主要來自莽草酸途徑。構成蛋白質的3種芳香族胺基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，都是莽草酸途徑的初級代謝產物，同時這3種芳香族胺基酸還是各種含苯環的次級代謝物的前體，通過次級代謝可生成如生長素，生物鹼，類黃酮等。有些次級代謝產物還是防禦反映的信號分子，如創傷，輻射，病源感染等會造成芳香族胺基酸及次級代謝產物的增強(EvelynM.Mobleyetal.，Identification，characterizationandcomparativeanalysisofanovelchorismatemutasegeneinArabidopsisthalianaGene，1999，240(1999)115-123)。在許多真菌和細菌中都鑑定到分枝酸變位酶活性，但各自在結構和活性上都有很大差異，對應的一些基因也已被克隆。在擬南芥中已分離到3種分枝酸變位酶基因CM-1，CM-2，CM-3，它們在結構和活性上有一定的差異(JennyEberhardetal.，CloningandexpressioninyeastofahigherplantchorismatemutaseMolecularcloning，sequencingofthecDNAandcharacterizationoftheArabidopsisthalianaenzymeexpressedinyeast.FEBS，1993，334(2)233-236；JennyEberhardetal.，CytosolicandplastidicchorismatemutaseisozymesfromArabidopsisthalianamolecularcharacterizationandenzymaticproperties.PlantJournal，1996，10(5)815-821；EvelynM.Mobleyetal.，Identification，characterizationandcomparativeanalysisofanovelchorismatemutasegeneinArabidopsisthalianaGene，1999，240(1999)115-123)，之前的這些研究只是集中在對分枝酸變位酶酶學特性和生化途徑中的作用進行分析，甚至對CM-2在生化途徑中的作用也很模糊，更不知其具體的生物學功能，目前在水稻中還沒有對CM-2具體研究的報導。實施例2基因表達分析本發明所得的突變體是由T-DNA隨機插入水稻基因組造成的，該T-DNA上含有EnhancerTrap，其上的報告基因帶有一個剪切過的小啟動子，僅含TATAbox和轉錄起始點，不足以啟動報告基因表達，而只有藉助鄰近的增強子元件才能表達。同過檢測報告基因的表達模式可以，可以判斷該增強子元件所控制基因的表達模式。對突變體GUS染色結果，如圖8，在根、莖、葉中全部表達，這與該基因在擬南芥中的表達模式相同(JennyEberhardetal.，CytosolicandplastidicchorismatemutaseisozymesfromArabidopsisthaliahamolecularcharacterizationandenzymaticproperties.PlantJournal，1996，10(5)815-821)。這也從另一角度證明了T-DNA是插在該基因上。實施例3RNAi(RNAinterference)轉化驗證基因功能在OsCM2基因的第一個外顯子和最後一個外顯子設計RNAi片段。引物序列1588Si15』ggggaccactttgtacaagaaagctgggtAAACGGAGATGAAGAAAGATCC3』，1588Ai15』ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctGTCACTTTGGAGGACAATGCTG3』，1588Si25』ggggaccactttgtacaagaaagctgggtCTTACCTTGGCGTGCAGAAC3』，1588Ai25』ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctGAGCTGTGGAGGATCAGCAG3』。PCR反應體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反應程序為94℃變性3min，94℃50s、55℃80s、72℃90s35cycles，72℃延伸5min，2個片段各擴增10管，分別收集PCR產物於2個1.5ml離心管純化，加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心20分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾乾，每管加10ulddH2O溶解。把純化的2個DNA片段分別連接到RNAi載體pHellsgate8上，如圖9，連接體系為gatwayBPclonase1ul，pHellsgate8載體0.5ul，BPreactionbuffer1ul，PCR純化產物2.5ul，25℃反應10小時，反應結束加0.5ulproteinaseK，37℃，10分鐘。取1ul電轉大腸桿菌DH10B，挑單克隆，擴大培養抽質粒，PCR驗證是否含有目標片段，把構建好的載體電轉農桿菌EHA105，構建好的載體分別命名為pH1588i1，pH1588i2，採用農桿菌EHA105介導的遺傳轉化方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，PlantJournal1994，6271-282)，轉到正常的中花11水稻品種中。RNAi結果發現約有1/5的轉化子抽穗遲約17-22天，其它抽穗時間介於突變體與野生型植株之間，具體統計結果見表1、表2。表型照片如圖10。說明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能。表1RNAi轉化植株的抽穗期統計表表2RNAi轉化植株遲抽穗的天數實施例4互補驗證1.互補載體的構建所用載體是pCAMBIA2301。日本晴BAC克隆0SJNBa0037D03用BamH1和Pst1可以酶切出含有OsCM2基因的約11.5KB的片段，接種BAC克隆0SJNBa0037D03於含氯黴素的250ml的LB，37℃，210轉/分鐘搖床，過夜。用1.5ml離心管收集菌液2次，約83管，抽質粒。最後每管加20ulddH2O溶解。收集質粒溶液，分3管純化加等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃冷凍30分鐘，再12000rpm離心20分鐘，棄上清，75％乙醇浸洗，涼幹，每管加25ulddH2O溶解。收集質粒溶液酶切，體系總體積100ul，質粒75ul，BamH130U，Pst130U，10XKbuffer10ul，ddH2O11ul，37℃酶切5小時。1％瓊脂糖TAE膠電泳，電壓40V，24小時。挖膠，透析袋回收，步驟見科學出版社《分子克隆實驗指南》，第二版，321-322頁。回收液加等體積24∶1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃冷凍30分鐘，再12000rpm離心20分鐘，棄上清，75％乙醇浸洗，晾乾，加10ulddH2O溶解。取1ul測濃度，剩下9ul全部用於連接反應，載體0.5ul，2UT4ligase，5Xbuffer3ul，總15ul體積，連接24小時。取0.5ul連接產物，電壓18000V，電轉到大腸桿菌DH10B，加800ulLB，復甦45分鐘，取200ul塗於含卡那黴素、X-gal、IPTG的LA平板，37℃，過夜。挑單克隆做細菌PCR，先在0.2mlPCR離心管加10ulddH2O，用20ul槍頭挑菌斑，在離心管中攪拌，取出槍頭在加有卡那黴素的LA平板上畫線作為備份。引物A5』CCACTAATCCGTGCAAAGGT3』，引物B5』CCCTCAGTATCAGCCACCAC3』，PCR反應體系的總體積為20μl，1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3UTaq酶。反應程序為94℃變性5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min30cycles，72℃延伸5min。跑膠觀察，挑陽性克隆，擴大培養，抽質粒，再做PCR和酶切驗證。把構建好的載體(命名為pC1588c)電轉農桿菌EHA105，抽質粒，PCR驗證，取750ul農桿菌菌液加等體積的50％甘油混勻，-70℃保存。2.遺傳轉化採用農桿菌介導的遺傳轉化方法將互補載體導入抽穗遲突變體。農桿菌介導的遺傳轉化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青黴素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；G418(卡拉黴素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)組織培養的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然後20-25℃下定容至1000ml。2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g20-25℃下下溶解並定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水並加熱至70℃，然後加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解後混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g20-25℃下溶解並定容至1000ml。6)MSmix母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g20-25℃下溶解並定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌後4℃保存備用。12)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內，4℃保存備用。13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，20-25℃下保存備用。14)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。4)共培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調節pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。7)預分化培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的抗生素G-418(Sulfate)和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養基(LB培養基不含瓊脂粉)蛋白腖2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝於500ml三角瓶，滅菌後20-25℃保存備用。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟4.1愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置於黑暗處培養4周，溫度24-26℃。4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度24-26℃。4.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養2周，溫度24-26℃。4.4農桿菌培養(1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基上預培養農桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。4.5農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。4.6愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青黴素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(G418篩選濃度為50μm)4.7分化(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7周；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養(20001x)，溫度26℃。4.8生根(1)拔出分化好的幼苗，剪掉分化時產生的根；(2)然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。4.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。最後獲得互補轉化的組培苗100株，作為對照的由突變體愈傷不經過轉化直接分化得到30株苗子，以及正常中花11愈傷分化苗子30株，都種於大田，結果沒經過互補的突變苗全部表現抽穗遲，互補的轉化苗約有50％恢復正常，抽穗期統計結果見表3。說明OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通過基因工程技術提高或減弱OsCM2基因的表達量能夠控制植物抽穗期，從而提高品種的地區與季節適應性。表3互補轉化植株的抽穗期統計結果SEQ.ID.No.1110華中農業大學120一種控制水稻抽穗期基因及應用130Patent14011412005-10-251602170Patentlnversion3.121012112881212DNA213Oryzasativa220221CDS222(81)..(272)223220221CDS222(1144)..(1230)223220221CDS222(1318)..(1461)223220221CDS222(1668)..(1760)223220221CDS222(2044)..(2292)2234001cgtgtggaggatcagcagcagcagctttcccttagctcgcgagctcatcagtcatcacag60ggcggatcgagagatcatcgatgggcgaggcggagctgagcctggcggcggtg113MetGlyGluAlaGluLeuSerLeuAlaAlaVal1510cgcgacgcgctggtgcgggaggaggactccatcgtcttcgccctcatc161ArgAspAlaLeuValArgGluGluAspSerIleValPheAlaLeuIle152025gagcgcgccaggcgcccgcgcaacgcgccggcatacgcggccgccgcc209GluArgAlaArgArgProArgAsnAlaProAlaTyrAlaAlaAlaAla303540gccgccggcggccgatccctcgccgagttcttcgtccgggaagccgag257AlaAlaGlyGlyArgSerLeuAlaGluPhePheValArgGluAlaGlu455055gttctgcacgccaaggtaagcccgccacctctcgttgttcttgagtcttgactcc312ValLeuHisAlaLys60ccattgattcatgattcagtatcctgcccaactagatccccttacgttttctttaccaaa372atcgatcctttttataccatgttgtagtgtagcatagccatgatgaacttgtacaggaag432atttttttttgcctggtgaaatttctgaggccaatctttctattcagtcaccttagtgat492tagtaaactcatggctgaggaattcgtatgtgaaattcagtcacacagatcttacaggct552aggcttgtatttcgttaccacattgtttttttggcagtagtttatctaccttggtctcca612ctgtaccatgatgaattgaaagatagcatcggagggtaagatgctgatatgtccattctg672gtaatcatgcggcattgcggcttatgttggcttgacgaattcattttgagtacctcgaac732ggacacacagtatcggatgagatttatattaacaaaagaatggctatgctacatgtgtag792gtaaatcatgtgttttaaaggcacttccatttacggatcattcaacaagtgaaagtgatc852agaagggaaaaatagtgacgatggagaaaaaaagtttgaaccgtaccatcccctattaat912aatagaaaacataaatgatttactattatttttcttgtactttactaaatgggaaatttt972gttatgctatttttcaacttgtatatcttatccagcatcctattaaaactgtcaaaatca1032atcaacataaaatacagcattggtatagctatgttgacagtcagatattagcatattacc1092atttccaagcatccctctacagaatctaattacatctgtgaaatctgataggccgga1149AlaGly65caataccaaaagccagaagatgttccattctttccccaagatctccct1197GlnTyrGlnLysProGluAspValProPhePheProGlnAspLeuPro707580tcacctctatttcctaccaaagattacccaaaggtaaatactaagctttacaa1250SerProLeuPheProThrLysAspTyrProLys8590tattagttacaatgaactgatgactaatgattgttgaggttctgagtttttattgctttg1310ttgttaggttttgcactcttttgcatcatcagtcagtgtgaatgatgca1359ValLeuHisSerPheAlaSerSerValSerValAsnAspAla95100105atatggaagatgtatttcaacgagttgcttccactattcactgtggat1407IleTrpLysMetTyrPheAsnGluLeuLeuProLeuPheThrValAsp110115120ggagatgatggtaactatgcagaaacagttgcattagattttgcatgt1455GlyAspAspGlyAsnTyrAlaGluThrValAlaLeuAspPheAlaCys125130135ctgaaggtacatgttctgtgtttattgtttcttttagatattccatcaatttggtc1511LeuLys140gttctttaaaaaaaacataaatctagttgctactaggatatgttctttcaatctttcagc1571acgcgaaagcaaaatttgcacaaattattgcaaattaatggtaaattgtttccaatcagt1631gtatatctgtgaaatgtattgatcatttctttgtaggccctgtcaagaagaatt1685AlaLeuSerArgArgIle145catattggtaaatatgttgctgaggtgaagttcaaagatgcttcccaa1733HisIleGlyLysTyrValAlaGluValLysPheLysAspAlaSerGln150155160gattatagtccactaatccgtgcaaaggttgtttttagttaacatct1780AspTyrSerProLeuIleArgAlaLys165170catactcactacaccaaattttcttaaacatcttgcaataaacggttgatttatagaaat1840tgtgaatactccttggtcttattctgattagcttcattcttatctagcttctacttagtt1900tcatgtgttagatgtttaactcctgcatacactccatttcttggtaggaactgcctgcta1960ggctgctagcattgggcctttaaatctttaatttattttttgaagctgatctttaattta2020ttatatccctctcttttcaacaggataccaaggctctgatgaatctgctaaca2073AspThrLysAlaLeuMetAsnLeuLeuThr175180ttcaaggcggttgaagagaaggtgaaaaggagagtagagaagaaggcc2121PheLysAlaValGluGluLysValLysArgArgValGluLysLysAla185190195aggatatttggtcagaatgtcactttggaggacaatgctgacaagcaa2169ArgIlePheGlyGlnAsnValThrLeuGluAspAsnAlaAspLysGln200205210gaaggcaatgcaggtgacagtgagtgcaaagttaatcctgaagtgcta2217GluGlyAsnAlaGlyAspSerGluCysLysValAsnProGluValLeu215220225230tctaagctatatgatctgtgggtaatgcctttgacgaaggatgttgaa2265SerLysLeuTyrAspLeuTrpValMetProLeuThrLysAspValGlu235240245gttgagtatcttctccgccgtcttgactgattcgccaaaatattttc2312ValGluTyrLeuLeuArgArgLeuAsp250255agctgcaaatatgatgaacacaattatgtaagcacatataaatagacttattgaatgtgg2372catgaggaaatccatcaagaacagctaacagcggtgacttgctgtagaatttccggtact2432gtatcttggatctttcttcatctccgttttcggagctgagacatatagggcctgtttggt2492acagctctaactcctaaatttagctccaagagttgggtctggagtggagttgtggagctg2552cctaaacccagctccacaactctagttcattttgtgagagagctccacccagctccactc2612ccagttttggtggagctgaaactgtttggctgagctccagctccaggaggggtagagctg2672gagctggagctgtgccaaacaggcccatagattgatggcaatgatctgcaacccaaaagg2732ttcatcctacctaactgtggtggctgatactgagggcctggtgaattcccagcaaagatg2792ctgcaactccagtttctgtaacaatctgtaactcctgttattatatcaccatagttttgt2852gctacttcttggtagtagcatttctgttc2881SEQIDNo.2110華中農業大學120一種控制水稻抽穗期基因及應用130Patent1412005-10-25170Patentlnversion3.12102211255212PRT213Oryzasativa4002MetGlyGluAlaGluLeuSerLeuAlaAlaValArgAspAlaLeuVal151015ArgGluGluAspSerIleValPheAlaLeuIleGluArgAlaArgArg202530ProArgAsnAlaProAlaTyrAlaAlaAlaAlaAlaAlaGlyGlyArg354045SerLeuAlaGluPhePheValArgGluAlaGluValLeuHisAlaLys505560AlaGlyGlnTyrGlnLysProGluAspValProPhePheProGlnAsp65707580LeuProSerProLeuPheProThrLysAspTyrProLysValLeuHis859095SerPheAlaSerSerValSerValAsnAspAlaIleTrpLysMetTyr100105110PheAsnGluLeuLeuProLeuPheThrValAspGlyAspAspGlyAsn115120125TyrAlaGluThrValAlaLeuAspPheAlaCysLeuLysAlaLeuSer130135140ArgArgIleHisIleGlyLysTyrValAlaGluValLysPheLysAsp145150155160AlaSerGlnAspTyrSerProLeuIleArgAlaLysAspThrLysAla165170175LeuMetAsnLeuLeuThrPheLysAlaValGluGluLysValLysArg180185190ArgValGluLysLysAlaArgIlePheGlyGlnAsnValThrLeuGlu195200205AspAsnAlaAspLysGlnGluGlyAsnAlaGlyAspSerGluCysLys210215220ValAsnProGluValLeuSerLysLeuTyrAspLeuTrpValMetPro225230235240LeuThrLysAspValGluValGluTyrLeuLeuArgArgLeuAsp24525025權利要求1.一種分離的基因，其具有SEQIDNo.1所示核苷酸序列至少50％同源性的序列。2.一種分離的蛋白質，其具有與SEQIDNo.2所示胺基酸序列至少50％同源性的序列。3.一種控制水稻抽穗期基因在控制水稻抽穗期中的應用。全文摘要本發明公開了一種控制水稻抽穗期基因及應用，涉及一種從水稻突變體中鑑定的控制抽穗期的基因OsCM2的分離克隆、功能驗證和應用。OsCM2基因編碼的蛋白與擬南芥CM－2基因編碼的蛋白有50％的同源性，OsCM2基因具有控制水稻抽穗期的功能，通過基因工程技術提高或減弱OsCM2基因的表達量能夠控制植物抽穗期，從而提高品種的地區與季節適應性。文檔編號C07K14/415GK1995357SQ20061001810公開日2007年7月11日申請日期2006年1月5日優先權日2006年1月5日發明者張啟發,陳志輝,吳昌銀申請人:華中農業大學