呋喃唑酮代謝物半抗原、抗原及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-21 14:20:51

專利名稱：呋喃唑酮代謝物半抗原、抗原及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種呋喃唑酮代謝物半抗原、抗原及其製備方法和應用。
背景技術：
呋喃唑酮，又名痢特靈，屬於硝基呋喃類藥物，是一種人工合成的抗菌藥，藥 效穩定，能抑制或殺滅多種革蘭氏陽性和陰性細菌，並對某些原蟲、真菌有一定作 用，臨床上常應用於防治畜禽腸道感染。據資料報導，呋喃唑酮具有較強的致畸、
致癌、致突變等毒副作用，其在動物性食品中的殘留直接威脅到人類身體健康。1995 年，歐盟禁止呋喃唑酮用於食品動物，隨後美國、日本、澳大利亞、中國等均取消 呋喃唑酮在畜禽生產上的使用，但呋喃唑酮殘留超標事件時有發生，因此很有必要 建立一種快速篩選呋喃唑酮殘留的方法。
呋喃唑酮在動物體內很快代謝成3-氨基-2-惡唑烷基酮(A0Z)，與組織結合的 AOZ在體內滯留時間長，被視為殘留標示物。AOZ的分子式為C3HaNA，結構如式(II ) 所示formula see original document page 4目前檢測AOZ殘留的方法有LC-UV， LC-MS和LC-MS-MS，該類技術所需設備要求 較高，不適合高通量樣品篩選，儀器價格昂貴，對操作人員的要求較高，難於推廣。 免疫分析檢測技術是近年來在環境、食品安全監測領域逐漸廣泛應用的一種快速、 高通量、低成本的檢測技術，已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選監測的 主要方法之一，這為呋喃唑酮代謝物的檢測提供了新的途徑。

發明內容
本發明的目的是提供一種呋喃唑酮代謝物半抗原、抗原及其製備方法和應用。 本發明提供的呋喃唑酮代謝物半抗原，是式(I )所示化合物formula see original document page 5本發明還保護式(I )所示化合物的製備方法，包括如下步驟(1) 將3-氨基-2-惡唑烷基酮(AOZ)和5-羥基-2-硝基-苯甲醛20-3(TC反應 6-8小時，乾燥後得到粉末；(2) 將步驟(1)的產物與琥珀酸酐於有機溶劑中回流，得到式(I )化合物； 所述3-氨基-2-惡唑烷基酮(AOZ)、所述5-羥基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物質的量的比值可為(1-2) : (3-5) : (6-10)。所述3-氨基-2-惡唑垸基酮、所述5-羥基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物 質的量的比值具體可為l: 3.8: 8.3。步驟(1)中，所述反應可在有機溶劑或有機溶劑溶液中進行，常規有機溶劑 均可採用，如乙醇。實際操作中，可先將3-氨基-2-惡唑烷基酮和5-羥基-2-硝基-苯甲醛分別溶解，再把兩個溶液混合，從而避免產物中含有大量未反應完全的原料。步驟(2)中，常規有機溶劑均可採用，既可為單一成分的有機溶劑，也可為 幾種有機溶劑的混合物，如可為丙酮和吡啶的混合物。步驟(2)中，所述回流的溫度可為6(TC-8(TC、時間可為8-10小時；所述回 流的溫度優選為7(TC、時間優選為8小時。所述方法還可包括如下步驟將步驟(2)中回流後的產物在惰性氣體環境中吹 幹，然後將得到的粉末洗滌後烘乾，以去除未反應完全的物質，採用惰性氣體環境 是為了避免產物表面發生氧化。本發明提供的呋喃唑酮代謝物抗原，是將式(I )所示化合物與載體蛋白偶聯 得到的偶聯物。所述呋喃唑酮代謝物抗原的結構示意圖見圖3。本發明還保護所述呋喃唑酮代謝物抗原的製備方法，包括如下步驟 (1)將式(I )所示化合物、N，N' -二環己基碳化二亞胺和N-羥基琥珀醯亞5胺在N，N-二甲基甲醯胺中20°C-3(TC反應8-10小時；式(I )所示化合物、N,N， -二環己基碳化二亞胺(DCC)、 N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和N，N-二甲基甲醯胺(DMF)的物質的量的比值為1: 1: 1: (3-5);(2)將步驟(1)的反應產物的上清液與載體蛋白溶液混合，2(TC-30'C反應4-6小時，得到所述呋喃唑酮代謝物抗原。常用載體蛋白均可採用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)等。 步驟(2)中，所述載體蛋白溶液可為含有載體蛋白的磷酸鹽緩衝液。 所述呋喃唑酮代謝物抗原可以作為免疫原製備呋喃唑酮代謝物特異性抗體。利用所述呋喃唑酮代謝物抗原作為免疫原免疫動物可獲得高特異性的抗體，其抗血清效價可達到h 51200。應用所述呋喃唑酮代謝物抗原製備得到的抗體也屬於本發明的保護範圍。 所述抗體具體可為單克隆抗體。式(I )所示化合物、所述呋喃唑酮代謝物抗原、所述抗體均可應用於檢測呋 喃唑酮代謝物。將所得抗體用於ELISA方法檢測呋喃唑酮代謝物，檢測靈敏度高，最低檢測限 可達0.2ng/mL。所得抗體的特異性極好，呋喃唑酮代謝物人工抗原與硝基呋喃類其 它藥物及常用抗菌藥，如呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、四環素、磺胺二甲嘧啶、 阿莫西林、恩諾沙星、土黴素無交叉反應，交叉反應率都小於O. 01%。本發明提供的製備化合物的方法，操作簡單，純度和產率都很高。將本發明的 化合物免疫動物後產生對呋喃唑酮代謝物高親和力的特異性抗體，用該抗體建立的 酶聯免疫吸附分析法可用於快速、靈敏、簡便地檢測動物源性食品呋喃唑酮代謝物 的殘留量。本發明具有重大經濟價值和社會意義。


圖1為呋喃唑酮代謝物半抗原負離子質譜圖。 圖2為呋喃唑酮代謝物人工抗原的紫外光譜圖。 圖3為所述呋喃唑酮代謝物抗原的結構示意圖。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實 驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特 殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。產率^實際得到的產物的質量/理論上得到產物的質量X 100%。實施例1、呋喃唑酮代謝物半抗原的製備和鑑定一、 呋喃唑酮代謝物半抗原的製備3-氨基-2-惡唑烷基酮5-羥基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐二l: 3.8: 8.3 (摩 爾比)。1、 溶液A和溶液B的製備溶液A: 25mg 3-氨基-2-惡唑烷基酮溶解於lmL蒸餾水中，備用。 溶液B: 155mg 5-羥基-2-硝基-苯甲醛，溶解於4mL乙醇中，備用。2、 在室溫(20-30°C)條件下，以不斷攪拌的方式，把溶液A逐漸加到溶液B 中，反應7小時，得到溶液C。3、 溶液C5000rpm離心10min，取出沉澱，用少量無水乙醇洗滌兩次，置乾燥 箱中6(TC烘乾，得到黃色粉末。4、 將步驟3的產物轉移至20mL圓底燒瓶內，加入200mg琥珀酸酐，溶解於5mL 丙酮和lmL吡啶混合溶液中，7(TC回流8小時。5、 將反應產物4CTC氮氣吹乾，得到固體粉末，用10mL蒸餾水洗滌兩次，5000rpm 離心5min，沉澱置乾燥箱中6(TC烘乾。得到反應產物(呋喃唑酮代謝物半抗原) 41mg，產率為48. 9%。二、 呋喃唑酮代謝物半抗原的鑑定將步驟一製備得到的呋喃唑酮代謝物半抗原進行質譜鑑定和元素分析。 質譜圖見圖1。呋喃唑酮代謝物半抗原具有分子離子峰366 (M-l)。 半抗原化合物的元素分析結果(％) : C， 45.78; H; 3.57; N， 11.44; 0， 39.21。分析結果表明呋喃唑酮代謝物半抗原的結構如式(I )所示，分子量為367。實施例2、呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備和鑑定 一、呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備1、將實施例1製備的呋喃唑酮代謝物半抗原(式(I )所示化合物)溶解於 N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，然後加入N，N' -二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫(20-3(TC)攪拌9小時，4'C過夜，離心分出上清 液；呋喃唑酮代謝物半抗原DCC: NHS: DMF 二l: 1: 1: 4 (摩爾比)。72、 將上清液加入到溶有載體蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液中(O.Olmol凡，pH 7.4)，繼續攪拌5小時，得到呋喃唑酮代謝物人工抗原。3、 將步驟2的溶液裝入透析袋，在4。C用磷酸鹽緩衝液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小時，換水10次。4、 將透析液在無菌條件下通過0.2um的濾膜，分裝於安培瓶中，-2(TC保存。 二、呋喃唑酮代謝物人工抗原的鑑定將步驟一製備的呋喃唑酮代謝物人工抗原溶液用PBS溶液稀釋，然後進行紫外 (200-400 nm)光譜掃描，以300 u g/mL的BSA作為對照。產物的紫外圖譜與BSA 相比發生了明顯變化，說明呋喃唑酮代謝物半抗原與載體蛋白BSA成功偶聯。呋喃 唑酮代謝物半抗原分子與載體蛋白分子的結合比為14: 1。實施例3、抗血清的製備和特異性鑑定一、 免疫動物製備抗血清採用5隻紐西蘭大白兔為免疫動物，以呋喃唑酮代謝物人工抗原(實施例2製備 的)為免疫原，每次免疫的免疫劑量為lmg/kg。免疫方法如下首免時將免疫原與 等體積弗氏完全佐劑充分乳化，頸背部皮下多點注射，間隔3-4周取將免疫原與弗 氏不完全佐劑混合製成乳化劑，加強免疫一次，共免疫7次，最後一次不加佐劑。從加強免疫第二次開始，在每次免疫後第8天於兔子耳緣靜脈採血，採血後4。C 冰箱放置5-6小時，然後以5000 rpm離心10min，分離血清，血清經適當稀釋後用間 接ELISA測定效價。第7次免疫時，兔子獲得了高效價的抗體，抗血清的滴度為l: 51200。二、 抗血清最低檢測限(LOD值)和半數抑制量(IC5。)的檢測3-氨基-2-惡唑垸酮標準品購自Sigma Chemical Co. (St. Louis， M0).; CAS 編號80-65-9。用方陣滴定法確定呋喃唑酮代謝物包被抗原(A0Z-0VA，把載體蛋白換成卵清 蛋白，製備方法同呋喃唑酮代謝物人工抗原)和步驟一製備的抗血清的工作濃度， 呋喃唑酮代謝物包被抗原的工作濃度為500ng/mL，抗血清的工作濃度為1/8X 104。用不同濃度的3-氨基-2-惡唑烷酮標準品溶液做實驗溶液，其濃度如下(單位 ng/mL): 0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128、 256。採用8組平行試驗(n=8)。間接競爭性ELISA方法用上述工作濃度的抗原包被酶標板，將實驗溶液與抗體溶液同時加入酶標板小孔中，同時設置空白孔(將添加的抗體溶液換成高純水，其它一致)和陰性對照孔(將添加的實驗溶液用高純水代替，其它一致)，37'C溫 育lh，倒出孔內液體，用洗滌液(10XPBST)洗滌3-5次，將酶標板倒置在吸水紙上 拍打；加入酶標二抗溶液於酶標板小孔中，37'C溫育lh，用洗滌液重複洗3-5次， 吸乾；加入底物顯色溶液到酶標板小孔中，室溫下反應10-15min，用酶標儀在波長 450nm處測定吸光度值A。以吸光度值A為縱坐標，以3-氨基-2-惡唑烷酮實驗溶液濃 度的loglO值為橫坐標，繪製半對數標準曲線圖。標準曲線具有完整的反S形狀，並 具有上平臺和下平臺，標準曲線的平行測定次數8次，實驗重複性良好，相對標準 偏差(變異係數)均在15%以內。根據標準曲線得出10%抑制量和半數抑制量(IC5。)，比較檢測靈敏度。抑制率用以下式計算抑制率(%)= (OD隨-OD咖HODx-OD隱) 。(ODmax畫ODmin)式中ODmax為不加標準品時的吸光值(即陰性對照)，ODx為標準品x時的吸 光值，ODmin為空白對照孔的吸光值。由ELISA方法的標準曲線可見，半數抑制量(IC5。)為l.O ng/mL，最低檢測限 (LOD)為0.2ng/mL，在O. 2-4. lng/mL範圍內，抑制率與藥物濃度的對數值呈顯著 的線性關係，相關係數為ri.9982。三、抗血清特異性測定抗血清的特異性就是指它同特異性抗原結合的能力與同該抗原類似物結合能 力的比較。常用交叉反應率作為評價的重要標準。交叉反應越小，抗血清的特異性 越好。檢測呋喃唑酮代謝物人工抗原與如下幾種物質的交叉反應率呋喃唑酮、AOZ、 3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑垸酮(NP-AOZ)、呋喃唑酮代謝物半抗原、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、四環素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩諾沙星、土黴素。用樣品稀釋液將以上幾種物質分別稀釋成如下濃度Ong/ml、 0.5ng/ml、lng/ml、 2ng/ml、 4ng/ml、 8ng/ml、 16ng/ml、 32ng/ml、 128ng/ml。(請指明) 按照步驟二中所述方法，各自建立標準曲線，測定抑制中濃度IC5。。 交叉反應率(％)=(引起50%抑制的呋喃唑酮代謝物人工抗原的濃度/引起50%抑制的其它物質的濃度)xioo%。實驗設3次重複，結果取平均數。所得特異性抗體與呋喃唑酮、NP-A0Z (呋喃 唑酮殘留標識物)、呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃唑酮代謝物半抗原的交叉反應 率分別為5.24%、 100.0%、 3.72%、 113.65%;呋喃唑酮代謝物人工抗原與呋喃它酮、 呋喃妥因、呋喃西林、四環素、磺胺二甲嘧啶、阿莫西林、恩諾沙星、土黴素交叉 反應率都小於0.01%。結果表明說明抗血清的特異性非常好。實施例4、呋喃唑酮代謝物半抗原的製備和鑑定一、 呋喃唑酮代謝物半抗原的製備3-氨基-2-惡唑垸基酮5-羥基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐=1: 3: 6 (摩爾比)。1、 溶液A和溶液B的製備溶液A: 3-氨基-2-惡唑烷基酮溶解於lmL蒸餾水中，備用。 溶液B: 5-羥基-2-硝基-苯甲醛，溶解於4mL乙醇中，備用。2、 在室溫(20-30°C)條件下，以不斷攪拌的方式，把溶液A逐漸加到溶液B 中，反應6小時，得到溶液C。3、 溶液C 5000rpm離心10min，取出沉澱，用少量無水乙醇洗滌兩次，置乾燥 箱中6(TC烘乾，得到黃色粉末。4、 將步驟3的產物轉移至20mL圓底燒瓶內，加入琥珀酸酐，溶解於5mL丙酮 和lmL吡啶混合溶液中，6(TC回流10小時。5、 將反應產物4(TC氮氣吹乾，得到固體粉末，用10mL蒸餾水洗滌兩次，5000rpm 離心5min，沉澱置乾燥箱中60'C烘乾。得到反應產物(呋喃唑酮代謝物半抗原)， 產率為50. 8%。二、 呋喃唑酮代謝物半抗原的鑑定將歩驟一製備得到的呋喃唑酮代謝物半抗原進行質譜鑑定和元素分析。 結果表明，同樣得到了式(I )所示化合物。實施例5、呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備和鑑定 一、呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備1、將實施例4製備的呋喃唑酮代謝物半抗原(式(I )所示化合物)溶解於 N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，然後加入N,N， -二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-10羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫(20-30°C)攪拌8小時，4匸過夜，離心分出上清 液；呋喃唑酮代謝物半抗原DCC: NHS: DMF =1: 1: 1: 3 (摩爾比)。2、 將上清液加入到溶有載體蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液中(0.01mol/L， pH 7.4)，繼續攪拌4小時，得到呋喃唑酮代謝物人工抗原。3、 將步驟2的溶液裝入透析袋，在4。C用磷酸鹽緩衝液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小時，換水10次。4、 將透析液在無菌條件下通過0.2um的濾膜，分裝於安培瓶中，-2(TC保存。 二、呋喃唑酮代謝物人工抗原的鑑定將步驟一製備的呋喃唑酮代謝物人工抗原溶液用PBS溶液稀釋，然後進行紫外 (200-400 nm)光譜掃描，以300 u g/mL的BSA作為對照。結果表明，得到了呋喃 唑酮代謝物人工抗原。實施例6、呋喃唑酮代謝物半抗原的製備和鑑定一、 呋喃唑酮代謝物半抗原的製備3-氨基-2-惡唑烷基酮5-羥基-2-硝基-苯甲醛琥珀酸酐=2: 5: IO(摩爾比)。1、 溶液A和溶液B的製備溶液A: 3-氨基-2-惡唑烷基酮溶解於lmL蒸餾水中，備用。 溶液B: 5-羥基-2-硝基-苯甲醛，溶解於4mL乙醇中，備用。2、 在室溫(20-3(TC)條件下，以不斷攪拌的方式，把溶液A逐漸加到溶液B 中，反應8小時，得到溶液C。3、 溶液C5000rpm離心10min，取出沉澱，用少量無水乙醇洗滌兩次，置乾燥 箱中6(TC烘乾，得到黃色粉末。4、 將步驟3的產物轉移至20mL圓底燒瓶內，加入琥珀酸酐，溶解於5mL丙酮 和lmL吡啶混合溶液中，80'C回流8小時。5、 將反應產物40。C氮氣吹乾，得到固體粉末，用10mL蒸餾水洗滌兩次，5000rpm 離心5min，沉澱置乾燥箱中60'C烘乾。得到反應產物(呋喃唑酮代謝物半抗原)， 產率為49. 2%。二、 呋喃唑酮代謝物半抗原的鑑定將步驟一製備得到的呋喃唑酮代謝物半抗原進行質譜鑑定和元素分析。 結果表明，同樣得到了式(I )所示化合物。實施例7、呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備和鑑定一、 呋喃唑酮代謝物人工抗原的製備1、 將實施例1製備的呋喃唑酮代謝物半抗原(式(I )所示化合物)溶解於 N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中，然後加入N，N， -二環己基碳化二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，室溫(20-30°C)攪拌10小時，4"C過夜，離心分出上清液；呋喃唑酮代謝物半抗原DCC: NHS: DMF =1: 1: 1: 5 (摩爾比)。2、 將上清液加入到溶有載體蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝液中(0.01mol/L， pH 7.4)，繼續攪拌6小時，得到呋喃唑酮代謝物人工抗原。3、 將步驟2的溶液裝入透析袋，在4。C用磷酸鹽緩衝液(0.01mol/L， pH7.4) 透析72小時，換水10次。4、 將透析液在無菌條件下通過0.2nm的濾膜，分裝於安培瓶中，-2(TC保存。二、 呋喃唑酮代謝物人工抗原的鑑定將步驟一製備的呋喃唑酮代謝物人工抗原溶液用PBS溶液稀釋，然後進行紫外 (200-400 nm)光譜掃描，以300 u g/mL的BSA作為對照。結果表明，得到了呋喃 唑酮代謝物人工抗原。1權利要求
1、式(I)所示化合物 top= "34" left = "43"/>式(I)。
2、 式(I )所示化合物的製備方法，包括如下步驟(1) 將3-氨基-2-惡唑垸基酮和5-羥基-2-硝基-苯甲醛20-3(TC反應6-8小時， 乾燥後得到粉末；(2) 將步驟(1)的產物與琥珀酸酐於有機溶劑中回流，得到式(I )化合物； 所述3-氨基-2-惡唑烷基酮、所述5-羥基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物質的量的比值為(1-2) : (3-5) : (6-10)。
3、 如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述3-氨基-2-惡唑垸基酮、所述 5-羥基-2-硝基-苯甲醛和所述琥珀酸酐的物質的量的比值為1: 3.8: 8.3。
4、 如權利要求2或3所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述反應是在有 機溶劑或有機溶劑溶液中進行的；步驟(2)中，所述回流的溫度為60'C-8(TC、時間 為8-10小時。
5、 如權利要求2至4中任一所述的方法，其特徵在於所述方法還包括如下步 驟將步驟(2)中回流後的產物在惰性氣體環境中吹乾，將得到的粉末洗滌後烘乾。
6、 一種呋喃唑酮代謝物抗原，是將式(I )所示化合物與載體蛋白偶聯得到的 偶聯物。
7、 權利要求6所述呋喃唑酮代謝物抗原的製備方法，包括如下步驟(1) 將權利要求l所述化合物、N，N' -二環己基碳化二亞胺和N-羥基琥珀醯亞 胺在N, N-二甲基甲醯胺中20。C-3(TC反應8-10小時；權利要求l所述化合物、N,N' -二環己基碳化二亞胺、N-羥基琥珀醯亞胺和N，N-二甲基甲醯胺的物質的量的比值為1: 1: 1:(3-5);(2) 將步驟(1)的反應產物的上清液與載體蛋白溶液混合，20°C-3(TC反應4-6小時，得到所述呋喃唑酮代謝物抗原。
8、 權利要求6所述呋喃唑酮代謝物抗原在製備呋喃唑酮代謝物特異性抗體中的 應用。
9、 應用權利要求6所述呋喃唑酮代謝物抗原製備得到的抗體。
10、 權利要求l所述化合物、權利要求6所述呋喃唑酮代謝物抗原、權利要求9 所述抗體在檢測呋喃唑酮代謝物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種呋喃唑酮代謝物半抗原、抗原及其製備方法和應用。本發明提供的呋喃唑酮代謝物半抗原是式(I)所示化合物，用式(I)所示化合物與載體蛋白連接可以得到呋喃唑酮代謝物抗原。所述呋喃唑酮代謝物抗原可應用於在製備呋喃唑酮代謝物特異性抗體。本發明提供的製備化合物的方法，操作簡單，純度和產率都很高。將本發明的化合物免疫動物後產生對呋喃唑酮代謝物高親和力的特異性抗體，用該抗體建立的酶聯免疫吸附分析法可用於快速、靈敏、簡便地檢測動物源性食品呋喃唑酮代謝物的殘留量。本發明具有重大經濟價值和社會意義。
文檔編號C07D263/00GK101643455SQ20091008564
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月27日 優先權日2009年5月27日
發明者吳小平, 靜 張, 飛 徐, 江海洋, 王亞輝, 王戰輝, 阮永磊, 黃思揚 申請人:北京維德維康生物技術有限公司