包括488c＞t突變的cyp2c9基因片段、所編碼的蛋白質片段及其應用的製作方法
2023-06-23 02:21:01 1
專利名稱：包括488c＞t突變的cyp2c9基因片段、所編碼的蛋白質片段及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物學領域，涉及單鹼基突變。更具體地，本發明涉及CYP2C9基因相對於SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點，包含該突變位點的核酸片段及其相應編碼的蛋白質片段。本發明還涉及鑑定所述突變位點的試劑和檢測方法，以及鑑定該位點在指導用藥中的應用。
背景技術：
CYP2C9是細胞色素P450酶大家族CYP2C亞家族中最重要的一員，約佔人肝微粒體CYP酶總量的20%。有大約10 16%臨床常用藥物經由CYP2C9氧化代謝，其中主要包括甲苯磺丁脲、S-華法林、苯妥英、格列吡嗪、格列苯脲、託拉噻咪、氯沙坦、厄貝沙坦和許多非甾體類抗炎藥物(如布洛芬、氯諾昔康、雙氯芬酸和萘普生)等藥物(參見參考文獻1-5)。CYP2C9基因具有高度多態性。目前為止，國際上已命名的等位基因共有35種(http://www. cypalleles. k1. se),除去野生型(CYP2C9*1)外，共有34種突變類型可引起CYP2C9蛋白胺基酸組成發生改變，另外還有多種新發現的突變尚未被命名。研究較多且臨床意義較大的突變類型主要包括以下10種:CYP2C9*2、*3、*5、*6、*8、*11、*12、*13、*14、*16，其中人種分布最廣、研究最多、中國人群研究資料相對最豐富的突變型是CYP2C9*2(430C
>T)、CYP2C9*3 (1075A > C)(參見參考文獻 6-17,20)。 根據目前的臨床研究顯示，CYP2C9基因的這種多態性是造成CYP2C9酶活性在個體之間極大不同的主要原因，因此在攜帶不同CYP2C9基因型的個體間可引起藥物療效的極大差異，甚至產生嚴重的藥物毒副作用或治療不充分。因此，研究CYP2C9基因多態性對藥物療效的影響將對臨床合理用藥提供重要的科學依據(參見參考文獻18、19、21、22)。
發明內容
本發明的目的是提供CYP2C9基因的新的單鹼基突變位點，包含該突變位點的核酸片段、其編碼的蛋白質片段及鑑定該突變位點在用藥指導中的應用。本發明的第一個方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQ IDN0.1的第1001位的突變位點，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1001位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第488位的核苷酸是T ;或者為上述核酸片段的互補序列。本發明的第二個方面是提供與含有對應於SEQ ID NO.1的第1001位或對應於SEQID NO. 2的第488位的突變位點的等位基因片段或其互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點的核苷酸是T ;所述等位基因片段是SEQID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其互補序列。
本發明的第三個方面是提供用於檢測和/或分析單鹼基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含SEQ IDN0. 8和/或SEQ IDNO. 9和/或SEQ ID NO. 18所示的序列片段。本發明的第四個方面是提供本發明的核酸片段或寡核苷酸在檢測CYP2C9基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。本發明的第五個方面是提供一種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2C9基因的對應於SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的單鹼基突變；根據檢測到的突變，調整由CYP2C9代謝的藥物的給藥量。 本發明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中對應於第1001位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對應於第488位的核苷酸。
本發明的第七個方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID NO. 3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID NO. 3的第163位的亮氨酸，並且為SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列的至少10個連續胺基酸。本發明提供了包含新的單鹼基突變的CYP2C9基因和編碼序列。該基因在對應於SEQ ID NO. 2的第488位核苷酸由C突變為T (488C>T)，從而引起其編碼的胺基酸由脯氨酸突變為亮氨酸，即對應於SEQ ID NO. 3的第163位的亮氨酸。該突變的CYP2C9蛋白(命名為P163L)對藥物的代謝活性比野生型低。該單鹼基突變對攜帶此突變位點的個體的用藥具有指導意義。
圖1是本發明的SEQ ID NO.1的第1001位核苷酸測序圖譜。
具體實施例方式通過下述具體實施方式
說明本發明，但本發明內容不限於此。如無其它說明，本發明的「核酸片段」由核苷酸或其類似物組成，可以是DNA、RNA或其類似物的片段；可以是單鏈或雙鏈；可以是天然的(如基因組的)或合成的。本發明中，「突變」指在檢測的基因，即CYP2C9基因中存在與野生型CYP2C9基因序列不同的核苷酸位點。「突變位點」指鹼基發生突變的位置。在本發明中，所述突變位點是對應於SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ ID NO. 2所示序列中的第488位。在本發明中，「等位基因特異性」指特異地與等位基因雜交，如在嚴謹條件下進行雜交，使得鑑定對應於SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ IDN0. 2所示序列的第488位核苷酸為T。本發明內容涉及CYP2C9基因的非同義突變。由於該突變位點位於基因的編碼序列中，因此，本領域技術人員可知，所述突變位點既可以在基因組DNA中表現，也可以在編碼序列(即CDS，對應於mRNA序列)中表現。本領域技術人員根據待檢測樣品，可以在基因組DNA或mRNA水平上對該突變位點進行檢測。本申請中，SEQ ID NO.1是以本申請的突變位點為中心、前後各Ikb的基因組DNA序列，即SEQ ID NO.1的第1001位是本發明涉及的突變位點。SEQ ID NO. 2是具有所述突變位點的CYP2C9基因的編碼序列，其中第488位是本發明涉及的突變位點。本領域技術人員可知，在本文中，對應於SEQID NO. 2的第488位位點和對應於SEQ ID NO.1的第1001位位點同義互用。本發明中，核苷酸和胺基酸的縮寫採用本領域公知的縮寫方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鳥嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。胺基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬醯胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示穀氨醯胺，E表示穀氨酸，G表示甘氨酸，H表示組氨酸，I表示異亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示賴氨酸，M表示蛋氨酸，F表不苯丙氨酸,P表不脯氨酸，S表不絲氨酸,T表不蘇氨酸，W表不色氨酸，Y表不酪氨酸，V表示纈氨酸。本發明的內容是基於CYP2C9基因的新的單鹼基突變位點。所述突變位點是位於CYP2C9基因的編碼區內，對應於SEQ ID NO. 2的第488位，該位點由野生型的C突變為T(488C>T);此外，由該突變的CYP2C9基因編碼的蛋白的第163位由脯氨酸突變為亮氨酸(P163L)。在第一個方面，本發明提供核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQ IDN0.1的第1001位的突變位點，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1001位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第488位的核苷酸是T ;或者為上述核酸片段的互補序列。在一種實施方式中，所述核酸片段的長度可以是如10-100、100-200、200-500、500-1000個核苷酸。優選地，所述核酸片段的長度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300個核苷酸。所述突變位點可以位於所述核酸片段的任何位置。在另一種實施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。在另一種實施方式中 ，所述核酸片段是SEQ ID NO. 2所示的序列。在其它實施方式中，所示核酸片段可以是SEQ ID NO. 24-31所示的序列。本發明的第二個方面是提供與含有對應於SEQ ID NO.1的第1001位或對應於SEQID NO. 2的第488位的突變位點的等位基因片段或其互補序列全部或部分雜交的等位基因特異性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點的核苷酸是T ;所述等位基因片段是SEQID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其互補序列。在一種實施方式中，所述的寡核苷酸用作探針。所述探針能夠在嚴謹條件下與包含突變位點的靶序列特異性雜交。本領域技術人員已知，所述探針不需要與靶序列完全互補，只要能與靶序列特異雜交即可。在優選的實施方案中，所述雜交條件可以滿足使探針僅與靶序列特異性雜交。所述探針的長度可以是5-100個核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸。所述突變位點可以出現在探針的任何位置。在優選的實施方式中，是突變位點出現在探針序列的中心或大約中心處。在另一種實施方式中，所述寡核苷酸用作指導DNA合成的引物，如本領域公知的測序引物或合成引物等。所述引物不需要與模板完全互補，但應當與模板互補雜交以指導DNA合成。所述引物的長度可以是15-40個核苷酸長度，優選地為18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。所述突變位點可以出現在所述引物的任何位置；優選地，所述突變位點出現在所述引物的3』末端。在一些優選的實施方式中，所示寡核苷酸是如SEQ ID NO. 32-38所示的序列。基於此，本發明的第三個方面是提供用於檢測和/或分析單鹼基突變的試劑盒，所述試劑盒包含本發明的核酸片段或等位基因特異性寡核苷酸，或包含SEQ ID N0.8和/或SEQ ID NO. 9和/或SEQ ID NO. 18所示的序列片段。本發明的第四個方面是提供本發明的核酸片段或寡核苷酸用於檢測CYP2C9基因突變的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。 本發明的第五個方面是提供用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2C9基因的對應於SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的單鹼基突變。當檢測到的CYP2C9基因在對應於SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的位點為T時，相對應地調整經CYP2C9代謝的藥物的給藥量。在具體的實施例中，當CYP2C9基因在SEQ ID NO. 2的第488位的位點為T吋，該基因編碼的CYP2C9蛋白酶活性下降，故需要減少經CYP2C9代謝的藥物的給藥量。本發明中所述的經CYP2C9代謝的藥物包括抗癌藥物，如環磷醯胺、異環磷醯胺或紫杉醇；抗凝血藥，如華法林、醋硝香豆素、抗驚厥藥或美芬妥英；降糖藥，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或羅格列酮；抗癲癇藥，如苯妥英或唑尼沙胺；抗瘧藥/抗寄生蟲藥，如阿莫地喹、鹽酸氯胍或奎寧；抗精神病藥，如阿米替林、西酞普蘭、丙咪嗪、哌羅匹隆、舍曲林、硫利達嗪或文拉法辛；降壓藥，如氯沙坦、厄貝沙坦或纈沙坦；非類固醇性抗炎藥，如雙氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞來昔布、氟比洛芬、布洛芬、n引哚美辛、氯諾昔康、甲芬那酸、萘普生、吡羅昔康或替諾昔康；鎮痛藥，如、洛哌丁胺、美沙酮或嗎啡；質子泵抑制劑，如蘭索拉唑或奧美拉唑；鎮靜藥，如、氯巴佔、甲苯比妥或佐匹克隆。本發明的第六個方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中對應於第1001位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對應於第488位的核苷酸。在一種實施方式中，所述方法可以是測序法，包括分離並測定來自基因組DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中的對應於第1001位的核苷酸或包含對應於SEQ ID NO. 2的序列的核酸中的對應於第488位的核苷酸是否為T。測序法可以是本領域已知的任何可用的測序方法。測序引物可以根據本領域技術人員的常識進行設計，如在待檢測位點的上下遊適當位置處設計引物，以擴展包含該待測位點的片段，從而判斷該位點的核苷酸。也可以採用本發明的寡核苷酸作為引物序列。在另ー種實施方式中，所述方法是利用探針雜交的方法，特異性地鑑定檢測樣品中包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中的對應於第1001位的核苷酸或包含對應於SEQID NO. 2的序列的核酸中對應於第488位的核苷酸是否為T ;所述方法中採用的探針是本發明的寡核苷酸。例如，從待測樣品中分離出核酸，在允許探針與核酸中可能存在的特異性靶序列雜交的條件下使探針與核酸接觸；可被檢測的雜交可以通過使用由可檢測的試劑標記過的探針來實現；例如，用放射性同位素、螢光染料或能催化形成可檢測產物的酶來標記探針。標記探針、用標記探針檢測樣品中是否存在靶序列的方法都是本領域技術人員所熟知的。
在ー種具體的實施方式中，提供以Taqman探針SNP檢測法檢測對應於SEQ IDNO.1的第1001位的核苷酸的方法，包括I)設計引物用於特異性擴增包含對應於SEQ ID NO.1的第1001位的PCR產物，同時設計兩條Taqman-MGB探針，分別針對對應於SEQ ID NO.1的第1001位的C和T (如SEQID NO. 37所示序列)等位基因。引物設計原則為(I)序列選取應在基因的保守區段；(2)避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構；(3)引物長度在18到24個核苷酸；(4) Tm 值在 55_65°C，GC 含量在 40% -60% ；(5)引物之間的Tm值相差避免超過2 V ；(6)引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的喊基；(7) PCR 擴增片段長度在 50bp_150bp ；(8)引物末端最後5個核苷酸不能有超過2個的G和C。Taqman MGB探針設計原則為(I)探針的5』端避免出現G ；(2) Tm 值應為 65_67°C ;(3)儘量縮短Taqman MGB探針,但探針長度不少於13bp ；(4)儘量避免出現重複的鹼基，尤其是G鹼基，避免出現4個或4個以上的G重複出現；(5)將探針的突變位點儘量放在中間1/3的地方。螢光基團可以採用FAM、VIC等來標記兩個等位基因。2)利用上述引物和探針，對待測樣本進行實時定量PCR。PCR條件95°C預變性10分鐘後進入30個擴增循環92°C變性12秒，60°C退火及延伸I分鐘(此階段檢測螢光信號)。3)數據分析。分析實驗結果，根據樣本兩種螢光的強弱判定待測樣本CYP2C9基因是否存在488C > T 突變。本發明中，所述樣品可以是任何包含核酸的樣品，如血液；優選所述樣品來自於人。所述核酸可以是DNA或編碼RNA，優選為基因組DNA。本發明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA為目標物。本領域技術人員可知，當以DNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中對應於第1001位的核苷酸，所使用的探針或引物根據SEQ ID NO.1的序列設計；當以RNA為檢測目標物時，分析待測樣品中的包含對應於SEQID NO. 2的序列的核酸中對應於第488位的核苷酸，所使用的探針或引物根據SEQ IDNO. 2的序列設計。本發明的第七個方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQID NO. 3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID NO. 3的第163位的亮氨酸，且為SEQ ID NO. 3所示的胺基酸序列的至少10個連續胺基酸，如10-20、20-50或50-100個
胺基酸。下面將通過具體的實施例進ー步說明本發明，但以下具體的實施例僅出於示例性的目的。實施例實施例1 :人CYP2C9基因新的突變位點的鑑定本實施例中，採集2127份血液樣本，提取血液中的基因組DNA，設計測序引物對CYP2C9基因的9個外顯子進行序列擴增、測序，篩選CYP2C9基因的突變位點I)提取 DNA 從每位被測者採取5ml靜脈EDTA抗凝血液樣本；然後按照普通鹽析法和/或採用專門的DNA提取試劑盒(購自美國Omega公司的DNA提取試劑盒)提取待測血樣的基因組DNA。2) PCR 擴增設計擴增引物，對獲得的基因組DNA樣品中的CYP2C9基因的9個外顯子序列進行擴增。所述擴增引物對序列見表I。採用50iil 0 反應體系，包括1父？0 緩衝液、1.5!1111%(12、100 1501^的基因組DNA、上下遊引物均為0. 2 ii M、dNTP為0. 4mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1. 5U。PCR擴增循環參數如下94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，退火30秒，72°C延伸2分30秒，30個循環後再延伸5分鐘。退火溫度與引物長度相關，具體溫度見表I。使用美國ABI公司的GeneAmp PCR System 9700擴增儀擴增。表1:測序引物對及退火溫度
權利要求
1.核酸片段，所述核酸片段包含對應於SEQID NO.1的第1001位的突變位點，且是SEQID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第1001位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段包含對應於SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點，且是SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸，其中第488位的核苷酸是T ;或者為所述核酸片段的互補序列。
2.根據權利要求1所述的核酸片段，其特徵在幹，所述核酸片段的長度是10-100、100-200,200-500或500-1000個核苷酸；優選地，所述核酸片段的長度是10-20、20_30、30-40,40-50,50-60,60-100或100-300個核苷酸；進一步優選地，所述核酸片段是SEQ IDNO.1、2、24-31所示的序列。
3.等位基因特異性寡核苷酸，所述寡核苷酸與含有對應於SEQID NO.1的第1001位或對應於SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點的等位基因片段或其互補序列全部或部分雜交，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的突變位點的核苷酸是T ；所述等位基因片段是SEQ ID NO.1或SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列中的至少10個連續核苷酸或其互補序列。
4.根據權利要求3所述的等位基因特異性寡核苷酸，其特徵在幹，所述寡核苷酸是探針或引物；優選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述寡核苷酸的長度是5-100個核苷酸；當所述寡核苷酸是引物時，所述寡核苷酸的長度是15-40個核苷酸；優選地，當所述寡核苷酸是探針時，所述突變位點位於探針序列的中心或大約中心處；當所述寡核苷酸是引物時，所述突變位點位於引物的3』末端。
5.根據權利要求4所示的等位基因特異性寡核苷酸，其特徵在幹，所述寡核苷酸是如SEQ ID NO. 32-38所示的序列。
6.用於檢測和/或分析單鹼基突變的試劑盒，包括權利要求1或2所述的核酸片段和/或權利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸；或者包含SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO. 9和/或SEQ ID NO. 18所示的序列片段。
7.權利要求1或2所述的核酸片段和/或權利要求3-5任一項所述的等位基因特異性寡核苷酸在檢測CYP2C9基因突變中的應用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探針或引物。
8.ー種用藥指導，包括檢測待測樣品中CYP2C9基因的對應於SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO. 2的第488位的單鹼基突變；根據檢測到的突變，調整經CYP2C9代謝的藥物的給藥量；優選地，所述藥物是環磷醯胺、異環磷醯胺、紫杉醇、華法林、醋硝香豆素、美芬妥英、甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮、羅格列酮、苯妥英、唑尼沙胺、阿莫地喹、鹽酸氯胍、奎寧、阿米替林、西酞普蘭、丙咪嗪、哌羅匹隆、舍曲林、硫利達嗪、文拉法辛、氯沙坦、厄貝沙坦、纈沙坦、雙氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞來昔布、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、氯諾昔康、甲芬那酸、萘普生、吡羅昔康、替諾昔康、洛哌丁胺、美沙酮、嗎啡、蘭索拉唑、奧美拉唑、氯巴佔、甲苯比妥或佐匹克隆。
9.ー種分析核酸的方法，包括分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO.1的序列的核酸中對應於第1001位的核苷酸或分析待測樣品中的包含對應於SEQ ID NO. 2的序列的核酸中對應於第488位的核苷酸；優選地，所述方法是測序法或探針雜交法。
10.CYP2C9蛋白或其片段或變異體，所述蛋白序列為SEQ ID NO. 3所示的序列；所述片段或變異體包含對應於SEQ ID NO. 3的第163位的亮氨酸，並且為SEQ ID NO. 3所示的氨 基酸序列的至少10個連續胺基酸。
全文摘要
本發明屬於生物學領域，涉及單鹼基突變。更具體地，本發明涉及CYP2C9基因對應於SEQ ID NO.2的第488位的突變位點，所述位點由野生型的C突變為T，包含該突變位點的核酸片段、其編碼的蛋白質片段及其應用。本發明還提供了檢測所述突變位點的等位基因特異性寡核苷酸、試劑盒和檢測方法。
文檔編號C12N15/11GK103031312SQ201110425260
公開日2013年4月10日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者蔡劍平, 戴大鵬, 徐仁愛, 胡國新, 楊麗萍 申請人:蔡劍平