Cysdv抗性黃瓜植物的育種方法

2023-06-11 16:18:06 3

專利名稱：Cysdv抗性黃瓜植物的育種方法
技術領域：
本發明涉及植物標記，特別是用於植物育種的標記。本發明提供了利用標記輔助選擇進行抗CYSDV的黃瓜植物育種的方法。本發明進一步提供了用於檢測與黃瓜植物基因組中CYSDV抗性連鎖的標記的存在的核酸檢測方法、基於所述標記的存在與否來選擇黃瓜植物的方法，以及利用所述方法生產黃瓜植物的方法。本發明進一步提供了檢測黃瓜植物中CYSDV抗性的新標記。
背景技術：
標記輔助育種是對傳統育種的技術改進，其可以監測特定基因材料通過回交從供體親本漸滲到優良變種的基因背景或基因組中的過程。這可以顯著地加速育種過程。該技術利用與待漸滲的特定性狀連鎖的基因標記(genetic markers) 0基因標記是與精確界線 (preciseboundary)未知的感興趣遺傳間隔(genetic interval)或與身份未知的基因連鎖的、可遺傳且容易檢測的多態性遺傳特性。該標記可用於識別與它們連鎖的特定染色體上的位點處的等位基因。該等位基因通常具有表型效應，其比該標記的檢測更複雜。傳統的植物育種方法基於純粹的雜交(cross-fertilization)以及從後代中選擇具有期望性狀組合的植物。在雜交過程中，數千基因混合，需要與優良種系的多次回交來除去不想要的性狀。這需要花費數年的時間。標記輔助育種方法更精確、更可預測而且更快速。通過控制清楚界定(well-defined)的基因位點在植物中的漸滲或插入，可以使現有植物系(plant line)具有特定的新特徵，而不期望的性狀則基本上未轉移。已成功應用於植物育種的分子標記類型包括RFLP(限制性片段長度多態性)(W089/07647、W090/04651)、RAPD (隨機擴增多態性 DNA 分析)(WO95/!9697 ； W099/05903)、AFLP (擴增片段長度多態性)(ΕΡ0 534 858、W000/15852)、也稱為小衛星序列(minisatellite)的VNTR(可變數目串聯重複序列)(W098/42867)、也稱為SSR(簡單序列重複)或微衛星序列(microsatellite)的STR(短串聯重複序列)(W099/67421)、SNP (單核苷酸多態性)(US2007/039065)、SFP(單特徵多態性(single featurepolymorphism)) (Borevitz 等人，2003. Genome Res. 13 :513-523)、EST (表達序列標籤)(W005/17158)、 RDA(代表性差異分析)(W099/53100)、GMS(基因組錯配掃描)(美國專利5，376，526)、 SCAR (序列特徵化擴增區域，W098/56948)、同工酶(Tanksley&Rick，1980. Theor. Appl. Genet. 57 :161-170 ；Ammati 等人 I985Plant Disease69(2) :112-115) ,ASH(等位基因特異性雜交)(Coryell 等人，(1999)Theor. Appl. Genet. 98 :690-696)、3SR(自主序列複製)，和 RAD (限制位點關聯的 DNA)標記(Miller 等人，Genome Res 17 =240-248 (2007)) 挑選特定類型的標記，要考慮多種因素。RFLP和AFLP標記一般不是首選方案，因為它們需要大量DNA的繁瑣的限制酶消化，並且需要利用凝膠電泳分離來自並行的不同個體中的多種消化液(digest)。甚至在遺傳的、多等位基因和共顯性的物種和栽培種中，微衛星(也稱為簡單重複序列(SSR))標記也具有高度多態性的優點。然而，篩選多重微衛星所需的時間、努力(effort)和巨大花費是對微衛星在植物遺傳學中擴大應用的嚴重限制。據認為，RAPD的開發更快、成本更低，但它們通常表現出較低的多態性。ASH標記用作顯性標記，其中通過僅一個探針由雜交或缺少雜交只能確定一個等位基因存在與否。從缺少雜交可以推斷出交互等位基因。任何性狀的最終標記都是因果(causal) DNA多態性(或多種因果DNA多態性)或者直接引起期望表型的等位基因變體。原因是等位基因中的基因型和相關表型是直接聯繫的。然而，關於特定性狀遺傳基礎的認識並不是育種計劃所必需的，只要該標記的預測值允許以足夠的確定性選擇攜帶該性狀的後代植物即可。為此，該性狀位點和該標記位點在該染色體上必須足夠靠近，以便它們例如，優選在多於95%的減數分裂(meioses)中一起遺傳。因為遺傳基礎狹窄的植物物種如黃瓜(Di jWmizen等人，1996)的基因標記數目有限，所以發現與性狀關聯的其它基因標記將有利於基因分型應用，包括標記-性狀相關性研究、基因作圖、基因發掘、標記輔助選擇，和標記輔助育種。假定輪迴親本與包含待漸滲的一種或多種基因的供體親本雜交。使所得Fl與輪迴親本交配，從而形成第一回交(BCl)；使這一代與輪迴親本雜交產生第二回交(BC2)，等等。在每個回交世代中，待與輪迴親本雜交的植物以這樣的方式選擇，以便它們都具有存在於輪迴親本中的整套標記等位基因，以及與待漸滲基因(或多種基因)關聯的標記等位基因。這就對待使用的標記進行了限制它們必須是共顯性的，或者如果是顯性的，如在 RAPD的情況中，則該供體親本必須攜帶顯性等位基因。(Reyes-Vald6s，Crop Science 40: 91-98(2000))ο黃化病毒(yellowing viruses)可能會給黃瓜產量造成重大的經濟損失，其中物種CYSDV(長線形病毒科(黃化絲狀病毒科，closterovirus family))的威脅最大。該病毒通過粉蝨(whitefly)傳播，雖然需要應用殺蟲劑來加以控制，但優選通過利用抗病毒的栽培種加以控制。據信某些抗性黃瓜變種基因組中的至少兩個數量性狀位點或QTL與有價值的長線形病毒抗性性狀關聯(參見WO 02/22836) 0 一個實例是源自黃瓜地方品種 (Iandrace)Khira PI250147的QTL。可以通過選擇具有與這些QTL關聯的標記的植物，將與此種長線形病毒抗性關聯的基因物質適當地漸滲到後代植物中。

發明內容
本發明人已發現檢測源自黃瓜地方品種Khira PI250147的黃瓜植物中CYSDV抗性的新標記。這些標記位於與來自黃瓜登錄號PI250147的CYSDV-QTL-1抗性位點很接近的位置。本發明涉及利用基因標記表徵與CYSDV抗性有關的黃瓜種質的組合物和方法。被識別為具有高度遺傳性的CYSDV抗性性狀的植物和種系對開發具有有價值的農藝和/或種子質量性狀的黃瓜農作物商業栽培種有用。在第一方面，本發明提供了測試核酸樣品中存在選自SEQ IDN0:1、2和3中的至少一個(多態性)核酸序列的方法。在優選的實施方式中，所述方法包括檢測SEQ ID NO 1相對於SEQ ID NO 2的多態性中的至少一個的存在。在另一個優選實施方式中，所述核酸樣品是來自植物、植物種質或植物系的樣品。
在又一個優選實施方式中，所述植物是葫蘆科植物，最優選黃瓜。在另一個優選實施方式中，本發明的測試方法是在標記的基因標記位點處對植物或種質進行基因分型的方法的一部分，其中該標記具有選自與CYSDV抗性關聯的SEQ ID NO :1、2和3的核酸序列，所述方法包括a)通過將擴增引物或擴增引物對與核酸樣品混合而擴增該核酸序列或其部分的標記位點，其中該引物或引物對與該標記位點或所述核酸序列的至少一部分互補或部分互補，並且其中該引物或引物對能夠利用所述核酸作為模板，通過DNA聚合酶啟動DNA聚合， 和b)在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反應中延長引物或引物對，從而產生至少一個擴增子，以及可選地檢測所得的擴增標記擴增子中的所述核酸序列。在本發明測試方法的另一個優選實施方式中，該引物或引物對選自SEQ ID NO 4 和5構成的組中。在另一個方面，本發明提供了選擇植物或種質的方法，包括對來自植物、植物種質 (plant germplasm)或植物系(plant line)的核酸樣品執行本發明測試方法，和選擇具有選自SEQ ID NO :1和3的至少一個核酸序列的植物或種質，以及選擇所述植物或種質用於進一步育種目的。在另一方面，本發明提供了植物育種方法，包括通過執行根據本發明的選擇植物或種質的方法來選擇植物或種質，和使所選植物或種質與優選來自優良植物系(elite plant line)的第二植物或種質雜交從而產生後代植物或種質。在植物育種方法的優選實施方式中，所述方法進一步包括以下步驟分析從一種或多種所述後代植物或種質中分離的DNA樣品中存在選自SEQ ID NO :1、2和3的至少一個 (多態性)核酸序列，其中所述分析識別出包含與CYSDV抗性連鎖的至少一種標記的植物。在植物育種方法的另一個優選實施方式中，所述後代植物或種質來自與所述至少一個核酸序列的存在有關和/或與CYSDV抗性有關的分離群體(segregating population)。在植物育種方法的另一個優選實施方式中，所述方法進一步包括回交、自交 (selfing)、異交(outcrossing)和植物選擇中的一個或多個步驟。在植物育種方法的又一個優選實施方式中，所述方法進一步包括從利用該方法產生的一種或多種植物中分離的DNA樣品的分子標記分析步驟，其中所述分析識別出至少包含與CYSDV抗性連鎖的SEQ ID NO :1或3的標記的植物。本發明植物可以可選地包含與長線形病毒抗性關聯的第二 QTL(如WO 02/22836 中描述的QTL-2，這篇文獻的說明書明確地提到了這種QTL的定位和特徵的詳細信息)。 其表明，這種QTL位於獨立染色體上。因此，除從利用該方法產生的一種或多種植物中分離的DNA樣品的分子標記分析步驟之外，本發明植物育種的方法還包括識別至少包含與 CYSDV抗性連鎖的SEQ ID NO :1或3的標記的植物的分析(步驟)，該標記可選地與在WO 02/22836中識別為QTL-2的數量性狀位點連鎖的標記相結合。適合於檢測QTL-2的標記包括TO02/2^36中描述的那些。在植物育種方法的又一個優選實施方式中，當與第二黃瓜植物或種質相比，所述已識別的植物表現出對CYSDV的抗性增強。
在又一個方面，本發明提供了分離的核酸分子，其選自以下構成的組a)具有SEQ ID NO :1、2和3中任何一個的序列的核酸分子；b)具有10 50個核苷酸長度並且與SEQ ID NO :1、2和3中任何一個具有至少 80%的序列同一性的核酸分子；c)能夠在嚴格雜交條件下與具有SEQ ID NO :1、2和3中任何一個序列的核酸分子雜交的核酸分子；d)與a)至C)中任何一個核酸分子互補的核酸分子。在又一個方面，本發明提供了本發明分離的核酸分子作為雜交探針或擴增引物的用途。


圖1示出從實施例2描述的抗性和易感的近交育種系擴增的不同的DNA片段。通過電泳和溴化乙錠染色使片段可視化。(R)表示抗性表型，( 表示易感性。圖2示出在本文稱為CYSDV-QTL-1的CYSDV抗性位點的位置。示出本文識別的標記，以及先前在WO 02/22836和W02007/053015中描述的一些其它標記的各個標記位點。 QTL的不同表示法(「CYSDV-QTL-1」和「QTL-1」)並不是要指出該兩個QTL之間存在任何差異，這兩種標識在本文可以交互地使用。然而，出於作圖的目的，稱為「QTL-1」的區域表示側面有本發明識別的緊密連鎖的標記的區域。圖3示出本文所述標記的分值，並表明新識別的標記可以準確地預測近交系的表型。
具體實施例方式定義本文使用的術語「葫蘆科植物」是指葫蘆(Cucurbitaceae)科植物，通常稱為甜瓜 (melon)、南瓜(瓜類，gourds)或葫蘆(cucurbits)的植物家族，並包括此類農作物，如黃瓜、南瓜屬植物(squashes)(包括南瓜(pumpkins))、絲瓜(Iuffas)、甜瓜和西瓜。特別地， 葫蘆科植物是指黃瓜。本文使用的術語「黃瓜」是指黃瓜(Cucumis sativus)物種的植物或其部分， 包括但不局限於通常稱為黃瓜(Cucumber)、美國醋漬黃瓜(American gherkin)、香蕉瓜 (Cassabanana)、黃瓜(Cuke)、醋淸黃瓜(Gherkin)、溫室黃瓜(Hothouse cucumber)、梓樣黃瓜(Lemoncucumber)、Mandera 黃瓜、脆制黃瓜(Pickling cucumber)、蛇黃瓜(Serpent cucumber)、切片黃瓜(Slicing cucumber)、蛇黃瓜(Snakecucumber)禾口西印度黃瓜(West Indian gherkin)的植物。本文使用的術語「植物系」是指共享有共同的遺傳衍化關係(遺傳來源，genetic derivation)的遺傳異質性(genetically heterogeneous)植物集合。本文使用的術語「植物部分」表示植物的部分，包括單個細胞和細胞組織例如植物中的完整的植物細胞、從中可以再生植物的細胞團和組織培養物。植物部分的實例包括但不限於，來自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花葯、花、果實、莖、芽(苗，Shoots)和種子的單個細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花葯、花、果實、莖、芽、接穗(幼枝，scions)、根莖、種子、原生質體、愈傷組織(calli)等。本文使用的術語「葫蘆科植物黃色矮化失調病毒(Cucurbit yellowstunting disorder virus)」及其縮寫「CYSDV」是指通常稱為長線形病毒的長線形病毒科 (Closteriviridae)的特定物種。該病毒首先於1982年在阿聯檢測到，此後在整個地中海地區以及德州南部和墨西哥北部裡奧格蘭德山谷的北美蔓延。CYSDV通過粉蝨以半持續的、非循環方式傳播。該病毒具有二分基因組(bipartite genome)，其由兩個單獨包裝 (encapsulated)的單鏈加有義RNA節段組成。本文使用的術語「核酸」包括提及的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，S卩，單鏈或雙鏈形式的多核苷酸，並且除非另有限定，否則都包括具有天然核苷酸本質特徵的已知類似物，因為它們以類似於天然存在的核苷酸(例如，肽核酸)方式與單鏈核酸雜交。多核苷酸可以是全長，或者天然或異種的結構或調控基因的子序列。除非另有限定，否則該術語包括提及的具體指定的序列及其互補序列。因而，帶有因穩定性或其它原因而修飾的骨架的DNA或RNA是「多核苷酸」，如同本文預期的該術語。而且，包含稀有鹼基(unusual bases)如肌苷，或者修飾鹼基如三苯甲基化鹼基的DNA或RNA是多核苷酸，如同本文使用的該術語，其中該稀有鹼基或修飾鹼基僅是兩個實例。應當理解，為了本領域技術人員已知的許多有用目的，可以對DNA和RNA作出各種修飾。本文採用的術語多核苷酸包括此種化學修飾形式、酶修飾形式或代謝修飾形式的多核苷酸，以及化學形式的DNA和RNA特性的病毒和細胞。如果是雙鏈，則DNA分子一般具有編碼或有義鏈，以及非編碼或反義鏈。如本文使用的術語「連鎖群」是指位於同一染色體上的所有基因或基因性狀。在連鎖群內，足夠靠近在一起的那些位點將表現出遺傳雜交(genetic crosses)的連鎖。因為交換的可能性隨著染色體上基因之間的物理距離而增大，所以在直接的基因測試中，連鎖群內位置彼此遠離的基因沒有表現出任何可檢測的連鎖。該術語「連鎖群」主要用於指在還未進行染色體定位(chromosomal assignments)的遺傳系統中表現出連鎖行為的遺傳位點。因而，在本發明上下文中，術語「連鎖群」與染色體(的物理實體)同義。本文使用的術語「基因」是指核酸序列，特別是由轉錄區域以及可選的一個或多個調控序列組成的DNA節段，該調控序列使得轉錄能夠實現並且包含核酸聚合酶(在真核細胞中，RNA聚合酶II)的模板。當被表達時，基因轉錄為mRNA，mRNA然後翻譯為蛋白質。「基因」在本文也被定義為由DNA序列組成的遺傳單位，其在染色體上佔據特定位置並包含有機體的特殊特徵或性狀的遺傳指令。術語「性狀」是指特徵或表型。本文使用的術語「等位基因(或多個等位基因)，，是指基因的一種或多種可替換形式中的任一種，所有等位基因涉及至少一種性狀或特徵。在二倍體細胞中，所給基因的兩個等位基因佔據一對同源染色體上的相應位點。等位基因長度可以像1個核苷酸鹼基一樣小，但通常比它大。等位基因序列可以是胺基酸序列或核酸序列。因為本發明涉及可以包含一個或多個基因的基因組區域，或者調控序列，所以，在某些實例中更準確地稱之為「單體型(haplotype)，，(即染色體節段的等位基因)而不是「等位基因」，然而，在那些實例中， 術語「等位基因」應被理解為包括術語「單體型」。本文使用的術語「單體型」是指單倍體配子中多個位點或基因標記的基因型。一般地，該單體型是作為單位被遺傳的一套等位基因或一組緊密連鎖的基因，因而，它們的位點或與其連鎖的標記存在於相對較小的限定的染色體區域中。而且，該術語是指一系列具有特定表型的個體之間的共同標記分值。優選的單體型包含與抗性顯著關聯的信息 (informative)標記周圍的IOcM區域或5cM區域或2cM區域。「位點」在本文定義為所給基因或調控序列佔據給定物種染色體的位置。本文使用的術語「漸滲」、「被漸滲的」和「漸滲的」表示天然的和人為的過程，其中通過雜交這些物種將一種物種、變種或栽培種的基因組區域轉移到另一種物種、變種或栽培種的基因組中。可選地通過與輪迴親本回交完成該過程。本文使用的術語「抗」和「抗性」包括對感染的部分和完全抗性。易感植物可以對感染無抗性或者對感染有低水平的抗性。該術語用於包括可單獨識別的抗性形式，如「完全抗性」、「免疫性」、「中等抗性」、「部分抗性」、「超敏性」和「耐受性」。本文使用的術語「完全抗性」是指在感染之後疾病完全無法進展，這可能是由於疾病未能進入細胞(無初始感染)引起的，或者是由於該藥劑(agent)未能在細胞內繁殖並感染後繼細胞(無潛在感染，未蔓延)引起的。本文使用的術語「易感」是指植物對疾病無抗性，導致該植物受到疾病影響，產生疾病症狀。術語「易感」因而與「無抗性」等同。本文使用的術語「位於……的側面」是指位於(並包括)基因組標記之間。「基因型」是指在個體有機體內一個或多個位點處等位基因組合的具體化。在二倍體有機體的情況下，每個位點處都有兩個等位基因；當該等位基因相同時，該二倍體基因型被稱為是純合的，而當該等位基因不同時，該二倍體基因型被稱為是雜合的。「表型」是指細胞或有機體的可檢測特徵，其是基因表達的表現。「連鎖」是指在雜交中產生多種類型的配子的相對頻率。例如，如果位點A具有等位基因「A」或「a」，位點B具有等位基因「B」或「b」，則帶有AABB的親本I與帶有aabb的親本II雜交將產生四個可能的配子，其中單倍體基因型分離為(segregated into)AB、Ab、 aB和ab。空期望(null expectation)是獨立而等同地分離為四個可能的基因型中的每個， 即沒有連鎖，1/4配子將是每種基因型。配子分離為不同於1/4的基因型則歸因於連鎖。當兩個位點顯示與預期的1/4相同頻率相偏離時，該兩個位點被稱為是「基因連鎖的」。「連鎖不平衡」定義在單一代中的許多個體群中的配子類型相對頻率的情境中。如果等位基因A的頻率是p，a是P』，B是q，b是q』，則基因型AB的預期頻率(在無連鎖不平衡的情況下)是pq，Ab是pq』，aB是p』 q，ab是p』 q』。與預期頻率的任何偏離都稱為連鎖不平衡。本文使用的術語「連鎖」是指標記位點和第二位點在染色體上足夠靠近，以至於它們在多於50%的減數分裂中一起遺傳，即，不是隨機的。這個定義包括其中標記位點和第二位點形成相同基因的一部分的情況。此外，這個定義包括其中該標記位點包含負責感興趣性狀的多態性(換言之，該標記位點與該表型直接「連鎖」)的情況。當兩個位點在多於 50%的減數分裂中一起遺傳時，在每代位點之間觀察到的重組百分比(釐摩(cM))將小於 50。在本發明特定實施方式中，基因連鎖位點可以在染色體上相距45、35、25、15、10、5、4、3、 2或1或更小cM。優選地，該標記相距小於5cM，最優選相距約OcM。本文使用的術語「cM」是指釐摩，並表示染色體或其基因連鎖圖譜上兩個位點或標記之間的距離。位點之間的距離通常通過同一染色體上位點之間的交換頻率測量。兩個位點離得越遠，則它們之間發生交換的可能性就越大。相反地，如果兩個位點非常接近，則(它們之間)發生交換的可能性就會較小。通常，1釐摩(Kosambi作圖函數(cM))大約等於位點(標記)之間的重組。本文使用的術語「標記」或與其等效的「基因組標記」，是指連鎖到感興趣基因或 QTL上的可遺傳且容易檢測的多態性DNA序列。「多態性」是序列，特別是DNA序列中個體之間的變化。有用的多態性包括單核苷酸多態性(SNP)和DNA序列的插入或缺失(INDEL)。 標記可以是基因，並可以是無已知功能的DNA部分，其在視覺上區分核酸序列特徵的方法中用作指徵(indicator)。此種指徵的實例是限制性片段長度多態性(RFLP)標記、擴增片段長度多態性(AFLP)標記、單核苷酸多態性(SNP)、插入突變、微衛星標記(SSR)、序列特徵性擴增區(SCAR)、裂解型擴增多態性序列(CAPQ標記或同工酶標記或本文所述的限定特異遺傳和染色體位置的標記的組合。當標記和與供體和接受漸滲的受體植物二者中感興趣性狀連鎖的等位基因物理關聯時，該標記被表示為「順式」-連鎖的。顯性性狀容易利用順式標記評估，因為該等位基因的存在與該表型呈正相關。因此，對於顯性性狀的標記輔助育種而言，順式標記是最重要的標記。當標記與相反等位基因物理關聯，即該等位基因沒有賦予供體植物的感興趣性狀時，該標記被表示為「反式」基因連鎖。技術人員應理解，具有漸滲的植物中不存在的反式標記對於檢測後代植物中成功漸滲的測定法也是有用的，但測試標記的不存在從而檢測特異性漸滲的存在是間接的。然而，反式標記與隱性性狀的標記輔助育種有關，因為當該標記不再存在於群體中時，純合(表達的表型)形式的感興趣等位基因的存在最佳地被顯示。標記可以是顯性或共顯性的。「標記測定法」是指利用特定方法，例如表型(如，種子顏色、花色或其它可視覺檢測的性狀)、限制性片段長度多態性(RFLP)、單鹼基延伸、電泳、序列比對、等位基因特異性雜交(ASH)、RAPID等，檢測特定位點處的多態性的方法。優選的標記測定法包括 US6, 013，431中公開的單鹼基延伸，和US 5，538，848中公開的，其中核酸內切酶活性使報告基因染料從雜交探針中釋放出來的等位基因鑑別，該兩篇專利的公開內容都通過引用合併在此。「數量性狀位點(QTL) 」是指在一定程度上控制通常連續分布的可用數字表示的性狀的位點。在核酸上下文中的術語「雜種」是指由互補核苷酸鹼基之間的氫鍵形成的雙鏈核酸分子，或雙鏈體(二重體，duplex) 0術語「雜交」或「退火」是指通過互補鹼基之間的氫鍵使單鏈核酸序列形成雙螺旋節段的過程。「雜交」是指兩個核酸分子或其片段形成反平行的雙鏈核苷酸結構的能力。本發明核酸分子在某些情況下能夠與其它核酸分子雜交。如果核酸分子表現出「完全互補性(completecomplementarity) 」，即，一個序列中的每個核苷酸與另一個序列中的其鹼基配對的伴侶核苷酸(partner nucleotide)互補，則該核酸分子被稱為是另一種核酸分子的「互補體」。如果兩個分子可以足夠的穩定性彼此雜交從而使得它們仍然可以在至少傳統「低嚴格(lowstringency) 」條件下被彼此退火，則該兩個分子被稱為是「最低限度的互補的」。類似地，如果該分子可以足夠的穩定性彼此雜交從而使得它們仍然可以在傳統「高嚴格」條件下被彼此退火，則該兩個分子被稱為是「互補的」。 例如至少在低嚴格條件下與其它核酸分子雜交的核酸分子被稱為是其它核酸分子的「可雜交同源物(cognate)」。傳統的嚴格條件描述在以下文獻中=Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N. Y. (1989) \)XR Haymes 等人，Nucleic Acid Hybridization, APractical Approach, IRL Press, Washington, D. C. (1985)，其中的每篇文獻通過引用合併在此。因此，允許偏離完全互補性，只要此種偏離沒有完全阻止該分子形成雙鏈結構的能力即可。因而，為了使核酸分子用作引物或探針，只需要它在序列上足夠互補從而可以在採用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩定的雙鏈結構即可。促進DNA雜交的適當的嚴格條件，例如，在約45°C下的6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(550，接著在501下的2.(^ SSC洗滌是本領域技術人員已知的，或可以在 Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6 中的現行規程(Current Protocols)中找到，該文獻通過引用合併在此。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選自50°C 下約2. Ox SSC的低嚴格條件至50°C下約2. Ox SSC的高嚴格條件。另外，洗滌步驟的溫度可以從室溫，約22°C下的低嚴格條件提高到約65°C下的高嚴格條件。溫度和鹽二者都可以變化，或者該溫度或鹽濃度可以保持恆定，而其它變量是變化的。「序列同一性(sequence identity) 」是指在成分如核苷酸或胺基酸的整個比對窗口中，兩個最佳比對的多核苷酸或肽序列的不變程度。測試序列和參考序列比對節段的 「同一性分數」是這兩個比對序列共享的相同成分的數目除以參考序列節段，即，整個參考序列或該參考序列的較小限定部分中成分的總數目。「同一性百分比」等於同一性分數乘以 100。比對比較窗口的序列最佳比對是本領域技術人員已知的，並可以通過這些工具進行， 如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比對算法、Pearson 和Lipman的相似法搜尋，優選通過計算機執行這些算法，如GAP、BESTFIT、FASTA，以及作為 GCG Wisconsin Package 的部分獲得的 TFASTA (Accelrys Inc. Burlington, Mass)。作為本文提供的多核苷酸變體的本發明多核苷酸一般與本文提供的多核苷酸具有顯著的同一性。特別感興趣的是這樣的多核苷酸同系物(同源物，homologs)，其與本文所述的多核苷酸序列具有至少約70%的序列同一性、至少約80%的序列同一性、至少約90%的序列同一性，更優選甚至更大，如98%或99%的序列同一性。術語「探針」是指將與靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補序列形成氫鍵鍵合雙鏈體的單鏈寡核苷酸序列。本文使用的術語「引物」是指能夠退火至擴增靶標以允許DNA聚合酶附著的寡核苷酸，由此當其被置於引物延伸產物的合成被誘導的條件下，即，存在核苷酸和諸如DNA聚合酶的聚合試劑以及合適的溫度和PH條件下時，起到DNA合成初始點的作用。(擴增)引物優選為單鏈化的以便擴增具有最大效率。優選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長才能在聚合試劑存在下啟動延伸產物的合成。引物的確切長度將取決於許多因素，包括溫度和引物的組成(A/T和G/C含量)。一對雙向引物由一個正向引物和一個反向引物組成， 如通常在DNA擴增技術領域如PCR擴增中所使用的那些。應該理解，本文中使用的「引物」 可以是指多於一種引物，特別是在有關被擴增靶區域的末端序列(或多個序列)的信息中存在一些錯讀(ambiguity)的情況下更是如此。因此，「引物」包括含有表示在序列中可能變化的序列的引物寡核苷酸的集合(collection)或包括容許典型鹼基配對的核苷酸。寡核苷酸引物可以通過任何合適的方法製備。製備具有特異性序列的寡核苷酸的方法是本領域已知的，包括例如合適序列的克隆和限制(限制性酶切)，以及直接化學合成。化學合成法可以包括，例如，磷酸二酯法或磷酸三酯法、二乙基氨基磷酸酯(diethylphosphoramidate) 法和公開於例如美國專利第4，458，066中的固相載體(solid support)法。需要時，引物可以通過引入以例如光譜、螢光、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式可檢測的裝置 (means)來進行標記。寡核苷酸引物(或多個寡核苷酸引物)的模板依賴性延伸是在足量的四種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯(dATP、dGTP、dCTP和dTTP，即dNTP)或類似物的存在下， 在由合適的鹽、金屬陽離子和PH緩衝系統組成的反應介質中由聚合試劑催化的。合適的聚合試劑是已知催化引物-和模板-依賴性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶。用這些DNA聚合酶催化DNA合成的反應條件是本領域中已知的。合成產物是由模板鏈和引物延伸鏈組成的雙鏈體分子，其包括靶序列。這些產物又作為另一輪複製的模板。在第二輪複製中，使第一次循環的引物延伸鏈與其互補引物退火；合成產生「短」產物，其通過引物序列或它們的互補體結合於5'-端和3'-端。變性、引物退火和延伸的重複循環導致由引物限定的靶區域呈指數累積。執行足夠次數的循環而達到所需數量的含有核酸靶區域的多核苷酸。所需數量可以是不同的，這由產物多核苷酸將要起到的功能決定。在手冊中已經詳細地描述了 PCR方法，這是技術人員已知的。通過PCR擴增後，可以通過用探針多核苷酸雜交來檢測該靶多核苷酸，該探針多核苷酸在嚴格到中等嚴格的雜交和洗滌條件下與靶序列的多核苷酸形成穩定雜交體。如果預期探針將基本上與靶序列完全互補(即約99%或更大)，則採用嚴格條件。如果預期會發生一些錯配，例如，如果變種株(variant strains)預期具有探針將不會完全互補的結果，則雜交的嚴格性就會降低。然而，條件的選擇會排除非特異性/偶然性結合。影響雜交的條件，以及排除非特異性結合的條件的選擇在本領域中是已知的，並描述在例如Sambrook和Russell (2001)中。一般而言，較低的鹽濃度和較高的溫度會使雜交條件的嚴格性提高。術語「嚴格的雜交條件」是指使多核苷酸與典型地在核酸複雜混合物中的其靶序列雜交，而基本上不與其它序列雜交的條件。嚴格條件是序列依賴性的，並且在不同的環境下是不同的。較長序列的特異性地雜交要在較高的溫度下進行。在TijSSen，1993中發現核酸雜交的廣泛指南(extensive guide)。一般而言，嚴格條件選擇為比特異性序列的熱熔點(Tm)低約5 10°C的溫度、確定的離子強度和pH。Tm是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下的)這樣的溫度，在該溫度下50%的靶互補探針雜交到處於平衡(因為在、下存在的靶序列過量，50%的探針處於平衡)的靶序列上。嚴格條件為這樣的條件，其中在pH 7.0 至8. 3下鹽濃度低於約1. OM鈉離子，典型地為約0. 01 1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，而對於短探針(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，對於長探針(例如，超過50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以採用加入去穩定劑如甲醯胺來實現。對於選擇性或特異性雜交，正信號至少是背景的2倍，優選為背景雜交的10倍。示例的嚴格雜交條件通常是50%甲醯胺、5xSSC，和SDS，在42°C下孵化，或者5xSSC、l% SDS，在65°C下孵化，在65°C下用0. 2xSSC和0. 1% SDS洗滌。對於PCR，約36°C的溫度典型地用於低嚴格擴增，但退火溫度可以在約32°C和48°C之間變化，這取決於引物長度。確定雜交參數的其它指導原則在許多參考文獻中提供(例如，Ausubel等人，1999)中。本文使用的術語「繁殖材料」是指植物的任何部分，包括來自花粉、胚珠、葉、胚芽、 根、根尖、花葯、花、果實、莖、芽和種子的單個細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花葯、花、果實、莖、芽、接穗、根莖、種子、原生質體和愈傷組織，該部分能夠再生成新植物。
本文使用的術語「選擇」是指評估標記或性狀在植物或植物部分中的存在，以及給所述植物或植物部分指定所選的迄今為止具有期望性狀或標記的狀態，從而提供植物或植物部分用於將來育種目的。「純化的」和「分離的」是指從與其天然狀態正常關聯的基本上所有的其它分子中分離出的核酸分子或多肽。更優選地，基本純化的分子是在配製品(preparation)中佔優勢的物質。基本純化的分子可以有多於60 %或75 %或90 %或95 %不含天然混合物中存在的其它分子(溶劑除外)。術語「分離和純化的」和「基本純化的」並不是要包括以其天然狀態存在的分子。 本文使用的術語「標記輔助選擇」是指現代植物育種過程，其中通過檢測那些植物中存在性狀關聯的標記，例如，限定QTL或與期望性狀關聯的基因組區域的標記，而選擇具有有利等位基因的後代植物用於將來的育種目的。本文使用的術語「後代植物」是指由一種或多種親本植物或其後代通過無性生殖或有性生殖獲得的子代的任何植物。例如，後代植物可以通過親本植物的克隆或自交，或通過兩種親本植物雜交獲得，並且包括自交體(selfings)以及Fl或F2或更進一步的世代。 Fl是由其中至少一個第一次作為性狀供體使用的親本產生的第一代後代，而第二代後代 (F2)或後續世代(F3、F4等)都是從F1、F2等的自交產生的樣本。因此，Fl可以是(通常是)來自兩個純育(true-breeding)親本(實際育種是性狀純合子)之間的雜交產生的雜種，而F2可以是(通常是)由所述Fl雜種自體受精產生的後代。本文使用的術語「超親分離子(transgressive segregant) 」是指具有顯著地不同於其親本的性狀/表型的後代(例如，在育種計劃中產生的)。此種後代是等位基因對在減數分裂期間(彼此)分離，以及隨後分配到不同生殖細胞中的結果。本文使用的術語「近交」是指基本純合的個體或種系。本文使用的術語「純合子」是指相同等位基因位於同源染色體上的相應位點上時存在的遺傳情況，其與術語「雜合子」相反，雜合子是指不同等位基因位於同源染色體上的相應位點上時存在的遺傳情況。本文使用的植物育種上下文中的術語「雜種」是指這樣的植物，其是通過不同種系或品種或物種植物雜交產生的遺傳學上不同的親本的後代，包括但不局限於兩個近交系之間的雜交。優選實施方式的描述在第一方面，本發明提供了測試核酸樣品中存在選自SEQ IDN0:1、2和3的至少一個(多態性)核酸序列的方法。所述方法適宜地包括通過執行核酸分析方法，特別是識別 DNA分子中獨特核苷酸(通常是多態性)序列的分析方法，檢測核酸樣品(優選分離的核酸樣品)中存在選自SEQ ID NO :1、2和3的至少一個核酸序列的步驟。本發明測試方法可能涉及本領域中已知的任何形式的核酸分析。適宜地，該方法包括擴增懷疑包含感興趣的核酸序列的DNA區域的步驟，該區域或位置可以適宜地稱為具有所述核酸序列的標記的標記位點，該方法還包括檢測所得擴增的標記擴增子中的多態性核酸序列的步驟。而且，可以擴增標記位點部分，並且可以在此後檢測所得擴增的標記擴增子中的多態性核酸序列。可替換地，該(多態性)序列可以通過利用與多態性標記序列特異性雜交的擴增引物由該核酸樣品直接擴增。然後，擴增子的產生指示存在感興趣的核酸序列。一般地，擴增步驟包括使擴增引物或擴增引物對與核酸，適宜地與從黃瓜植物或種質中分離的核酸混合，其中該引物或引物對與標記位點或所述核酸序列的至少一部分互補或部分互補，並且其中該引物或引物對能夠利用所述核酸作為模板通過DNA聚合酶啟動 DNA聚合。擴增步驟然後進一步包括在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應中延伸引物或引物對，從而產生至少一個擴增子。在根據本發明的測試方法中有用的核酸擴增方法在本領域中是熟知的。原則上，本發明方法可以採用任何核酸擴增方法，如聚合酶鏈反應(PCR;Mullis 1987、美國專利4，683，195、4，683，202和4，800，159)，或者使用擴增反應如連接酶鏈反應(LCR ； Barany 1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 189-193、歐洲專利申請 320，308)、自主序列複製(3SR ;Guatelli 等人，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 1874-1878)、鏈置換擴增 (SDA ；美國專利 5,270，184 和 5,455，166)、轉錄擴增系統(TAS ；Kwoh 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :1173-1177), Q-β 複製酶(Lizardi 等人，1988，Bio/technology6 1197)、滾環擴增(RCA ；美國專利5，871，921)、基於核酸序列的擴增(NASBA)、裂解酶片段長度多態性(美國專利5，719，028)、等溫和嵌合引物起始的核酸擴增(Isothermal and Chimeric Primer-initiatedAmplification of Nucleic Acid) (ICAN)、分枝-延伸擴增法(Ramification-extension Amplification Method) (RAM ；美國專利 5，719，028 和 5，942，391)，或者任何其它適合用於擴增DNA的方法。為了將帶有少量錯配的DNA擴增到一種或多種擴增引物上，可在降低的嚴格條件下進行擴增反應(例如，利用38°C的退火溫度，或在3. 5mM MgCl2的存在下進行PCR擴增)。 本領域技術人員將能夠選擇適宜的嚴格條件。本文引物選擇為與存在於每個待擴增特異性序列不同鏈上的它們的靶區域「基本」互補(即，至少65%、更優選至少80%的完全互補)的引物。可以使用含有例如肌醇殘基或多義鹼基(ambiguous base)的引物序列，或甚至當與靶序列相比時含有一個或多個錯配的引物。一般地，認為表現出與靶DNA寡核苷酸序列至少65%，更優選至少80%同源性的序列適宜用在本發明方法中。當使用低嚴格的雜交條件時，序列錯配也不是關鍵的。擴增產物的檢測原則上可以通過本領域中已知的任何適宜的方法完成。該擴增子可以用放射性標籤、抗體、發光染料、螢光染料、酶試劑直接或間接地染色或標記，或者利用作為報告分子而被標記的寡核苷酸可視化。直接的DNA染色包括，例如，嵌入染料如吖啶橙、溴化乙錠、疊氮溴乙錠(ethidium monoazidehHoechst染料。適宜的螢光標籤包括，但不局限於螢光素、羅丹明(FAM、R6G、TAMRA和R0X)、德克薩斯紅(Texas red)、B0DIPY、香豆素(coumarins)、花青染料(噻唑橙[T0]、噁唑黃[Y0]、Τ0Τ0、Υ0Υ0 ；Cy3, Cy5)和 Alexa 染料(Alexa dyes)。報告分子包括，但不局限於用螢光染料(Fluorochromes)如FAM、R0X、德克薩斯紅、ΤΕΤ、TAMRA, JOE、HEX、CAL紅和VIC標記的寡核苷酸。可替換地，可以通過將標記的dNTP鹼基併入到所合成的DNA片段中來檢測該DNA 片段。可與併入到擴增子中的核苷酸鹼基關聯的檢測標籤包括，例如，螢光素、花青染料或 BrdUrcL測試核酸樣品中存在選自SEQ ID NO :1、2和3的至少一個(多態性)核酸序列的方法也可以通過利用基於探針的檢測系統進行，可選地與核酸擴增相結合。適合於本發明使用的檢測方法可以包含例如，酶免疫測定(EIA)法(Jacobs等人，1997， J.Clin. Microbiol. 35，791-795)。在EIA方法中，用在擴增反應中的正向或反向引物包含捕獲基團，如生物素基團(biotin group)，其用於將擴增子固定在例如鏈黴親和素 (streptavidin)塗覆的微量滴定板上以便隨後對擴增子進行EIA檢測。對檢測本文公開的標記序列有用的探針優選只結合到通過DNA擴增方法擴增的標記序列區域的至少一部分上。本領域技術人員可以製備適合於基於標記序列的核苷酸序列進行檢測而無需進行本文列出的不適當的實驗的探針。該標記序列的互補序列也同樣地適合用作本發明方法中的檢測探針，條件是此種互補鏈在所採用的擴增反應中被擴增。在又一些其它可替換的實施方式中，核酸樣品可通過Southern印跡法測試，其中使該核酸樣品和與標記核酸序列的至少一部分互補或部分互補的探針接觸，其中當結合到過濾材料(filter material)上時，該探針能夠在嚴格雜交條件下與該標記核酸序列的至少一部分雜交。適宜的方法因而可以包含固定擴增子和用探針探測其DNA序列。為了方便對結合的檢測，該特異性擴增子檢測探針可以包含標籤部分如螢光團、發色團、酶或放射性標籤，以便使該探針與該擴增反應的反應產物的結合容易被監測。此種標籤是本領域技術人員熟知的並包括，例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、鏈黴親和素(sti^ptavidin)、生物素、地高辛(digoxigenin)、35S或125I、3H，以及上文所述的那些。其它實例對本領域技術人員是明顯的。檢測也可以通過例如Van den Brule 等人 0002，J. Clin. Microbiol. 40，779-787) 描述的所謂的反向線點(RLB，reverse line blot)測定法執行。為了這個目的，優選合成帶有用於隨後固定在例如羧基塗覆的尼龍膜上的5』氨基的RLB探針。可替換地，該方法可以包括原位雜交試驗，其中使靶核酸和與所述核酸序列的至少一部分互補或部分互補並能夠在嚴格條件下雜交到其上的探針原位接觸。此種檢測探針可以用可檢測標籤適當地標記。核酸探針在檢測DNA片段中的用途是本領域熟知的。這些方法主要包括使靶DNA 與探針雜交，接著進行雜交後洗滌。特異性典型地為雜交後洗滌的功能(function)，關鍵因素是離子強度和最後洗滌溶液的溫度。對於DNA-DNA雜交，該Tm可以由Meinkoth和 Wahl，Anal. Biochem.，138 :267-284(1984)的等式:Tm = 81. 5 °C +16. 6 (log Μ)+0.41(% GC)-0. 61 (% form)-500/L估算；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％ GC是該DNA中鳥嘌呤核苷和胞嘧啶的百分比，％ form是該雜交溶液中甲醯胺的百分比，並且L是鹼基對中雜種(hybrid)的長度。該1是(在限定的離子強度和pH下的)溫度，在該溫度下50%的互補靶序列雜交到最優匹配的探針上。對於每錯配，Tm降低約1°C;因而，該雜交和/或洗滌條件可被調節從而與期望同一性的序列雜交。例如，如果搜尋同一性> 90%的序列，則可以使Tm降低10°C。一般而言，嚴格條件選擇為在限定的離子強度和pH下比特異序列及其互補體熱熔點低5°C的溫度。然而，嚴重嚴格條件可以利用在比熱熔點(Tm)低1、2、3或4°C 的溫度下的雜交和/或洗滌；中等嚴格條件可以利用在比熱熔點(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以利用比熱熔點(Tffl)低11、12、13、14、15或20°C 的溫度下的雜交和/或洗滌。利用該等式，雜交和洗滌組合物，以及期望的Tm，技術人員將理解，雜交嚴格度和/或洗滌溶液的變化是固有的描述(inherently described) 0如果期望的錯配程度導致Tm低於45°C (水溶液)或32°C (甲醯胺溶液)，則優選增大SSC濃度以便可以採用較高的溫度。SEQ ID NO :1、2和3的核酸序列代表與QTL連鎖的標記，該QTL與連鎖群4上葫蘆科植物中的CYSDV抗性關聯。這些標記與抗性位點緊密連鎖，因而對於葫蘆科植物和種質中存在CYSDV抗性表現出非常高的預測值。根據本發明的測試方法因而可以適宜地用作對植物、種質，以及葫蘆科植物系如黃瓜植物、黃瓜植物群體和/或黃瓜系進行基因分型以便確定存在與CYSDV關聯的目標 (subject)基因標記的方法。實質上，本發明提供了對從一種或多種植物分離的DNA樣品進行分子標記分析的方法。本文提及的分子標記指示存在至少一個具有與CYSDV抗性連鎖的多態性序列的
等位基因。SEQ ID NO :1是與抗性關聯的INDEL標記，其表示相對於易感植物或種質相應位點中的序列，基因組DNA序列中插入了 18個核苷酸。SEQ ID N0:1和2對應於本文所指CYSDV-QTL-1的標記位點E16/M55-F-112/130。這個位點是雙等位基因。該抗性位點(由SEQ IDNO :1表示)包含相對於易感位點(SEQ ID NO 2表示的)的多核苷酸插入 5，-CTGTGTTTATAATCCCAT-3，。因而，本文所述的本發明方法可以包含檢測存在SEQ ID NO: 1相對於SEQ ID NO 2的多態性中的至少一個。對於減小包含源於黃瓜登錄號Khira PI250147的連鎖群IV上的CYSDV抗性等位基因的漸滲尺寸(the size of the introgression)的目的，有利地採用根據本發明的測試方法。利用緊密連鎖的標記的漸滲的減少使得這個位點周圍的重組體容易被識別。示出這種應用的實例是早期專利申請W02007/053015中描述的，CYSDV和PM抗性位點之間的重組。小基因組區域的精確漸滲是插入一種性狀而不喪失另一種性狀所必需的。另一個實例是除去與CYSDV關聯的連鎖累贅(linkage drag)，其可以包括諸如壞疽和/或大果頂 (large blossom end)的陰性性狀(negative trait)。連鎖群IV由RFLP標記(括號中為以cM計的圖位(圖譜位置，map position)) CsC477H3(16.3)、CsC032a/El(30.2)、CsP357/H3 (36.9)、CsC588/H3(39.7)、CsP046/ El (43. 1)、CsC694/E5 (44. 6)、CsP347/H3 (44. 6)、CsC365/El (53. 3)、CsC386/El (53. 3)和 CsC230/El(54. 8)表示。本發明方法中使用的核酸樣品因而可以適宜地為來自植物或植物種質(例如，種子)的核酸樣品。這裡無需詳細描述從植物或種質中分離核酸的方法，因為它們是本領域熟知的(參見，例如，Kang等人，1998. Plant Molecular Biology Reporter 16 1-9 ；W0/2004/056984)。本發明方面中使用的植物優選為葫蘆科植物，還更優選為黃瓜。考慮在內的是， 該標記不僅可以在PI250147Khira抗性漸滲到黃瓜中的情況中有實用性，而且在基於 Khira-地方品種的CYSDV抗性越過物種界線，即，漸滲到其它葫蘆科植物中後，該方法可以有更廣的適用性。據認為，可通過本發明方法檢測的CYSDV-QTL-1可以提供對黃瓜植物中的CYSDV 的至少部分抗性。當需要植物中的完全抗性時，除了確定存在CYSDV-QTL-1之外，還確定存在冊02/2觀36中識別的CYSDV-QTL-2作為本發明方法中另外步驟的一部分。W002/2^36 說明書明確提及了與QTL-2連鎖的標記和可用作本發明檢測方法中靶和引物序列的序列。植物育種的目的是將各種期望的性狀結合到單個變種或雜種中。對於商業農作物，這些期望的性狀可以包括抗病和蟲害；耐熱和乾旱；縮短農作物成熟時間；植物特徵的一致性如出芽和起身期(standestablishment)、生長速率、成熟期和植物高度；以及改進的農藝學品質如更大產率、開花、植物生長和/或植物結構。通常，期望性狀的育種以育種系或優良系的建立而告終，該育種系和優良系通常為生產商業雜交種子的母體。因而，本發明的優選方面涉及將在本文後面詳細描述的優良系。當前育種計劃涉及廣泛的基因分型工作。實際上，當對植物執行本發明方法時，該方法有利地作為在具有選自SEQ ID NO :1、2和3的核酸序列的標記的基因標記位點處對植物或種質進行基因分型的方法的一部分，因為已發現這些標記位點與CYSDV抗性相結合， 特別是基於源自與此種抗性關聯的黃瓜登錄號Khira PI250147的基因組漸滲。根據本發明的基因分型方法包括第一步驟將擴增引物或擴增引物對與核酸樣品混合而擴增該核酸序列或其部分的標記位點，其中該引物或引物對與標記位點或所述核酸序列的至少一部分互補或部分互補，並且其中該引物或引物對能夠利用所述核酸作為模板通過DNA聚合酶啟動DNA聚合。根據本發明的基因分型方法包括第二步驟在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的 NDA聚合反應中延伸該引物或引物對從而產生至少一個擴增子，以及可選地檢測所得所擴增的標記擴增子中的所述核酸序列。當使用非特異性引物擴增標記(的部分)時，檢測標記擴增子中的核酸序列是特別有益的。當使用僅退火至SEQ ID NO 1、2或3的多態性序列或SEQ ID NO 1相對於SEQ ID NO 2的多態性核苷酸的特異性引物時，標記擴增子的產生指示存在SEQ ID NO 1、2和/ 或3的核酸序列。僅擴增特異性標記序列的引物的實例是SEQ ID NO :4和5的引物。使用這些引物可以產生這樣的擴增子，其具有的尺寸為抗性等位基因的109個鹼基對和易感等位基因的 91個鹼基對，如以下更詳細描述的。在另一方面，本發明提供了選擇植物或種質的方法。該選擇方法涉及執行以下方法測試核苷酸樣品中存在選自本文所述SEQ IDNO 1、2和3的至少一個(多態性)核酸序列，接著選擇具有選自SEQ ID NO 1和3的至少一個核酸序列的植物或種質用於進一步育種目的。SEQ ID NO 1和3指示包含抗性等位基因的植物。如此選擇的植物在與CYSDV抗性關聯的至少一個所選基因標記位點處具有期望的基因型。此種植物可以用作創建育種群體的親本。例如，選擇植物的方法可以提供黃瓜植物或黃瓜系，基於它們的基因型，預測它們可以產生具有CYSDV抗性的超親分離子 (transgressive segregants)0在另一方面，本發明提供了植物育種方法。本發明中考慮的育種方法實質上是標記輔助方法。該方法包括利用上述選擇方法選擇植物或種質，以及使如此選擇的植物或種質與優選來自優良植物系的第二植物或種質雜交從而生產後代植物或種質。對於生產包含所述核酸序列和/或表現出CYSDV抗性的黃瓜植物，這種植物育種方法是有利的。特別地， 此種方法利用至少一種基因標記從通過標記輔助選擇的黃瓜育種群體中選擇黃瓜植物，並使所選黃瓜植物與第二黃瓜植物雜交，其中該雜交的後代黃瓜植物產生關於CYSDV抗性的超親分離子，該超親分離子表現出對CYSDV的抗性。
可以再次測試該後代植物中存在以SEQ ID NO :1、2和3為特徵的標記，或與期望性狀關聯的任何其它標記。特別地，該測試可以識別包含與CYSDV抗性連鎖的至少一種標記的植物。在又一些其它可替換的實施方式中，可以利用生物測定法測試該後代植物是否表現出期望性狀，包括CYSDV抗性。雖然本發明方法並沒有局限於此，但其有利地對來自與本文限定的CYSDA標記相關和/或與CYSDV抗性相關的分離群體的後代種子或後代植物執行該方法。在本發明育種方法中識別並選擇了合適的後代植物或種質後，可將它用於進一步的育種目的。本文限定的進一步育種目的可以包含回交、自交、異交和植物選擇中的一個或多個步驟。優選地，回交和選擇進行約4 約9代或循環，合適地約7代或循環，以便提供基本純合的育種親本。可以再次分析由上述方法產生的植物或種質中存在與CYSDV抗性連鎖的SEQ ID NO :1或3標記。優選地，當與在第一雜交中用作原始親本的第二黃瓜植物或種質相比時， 如此識別的植物表現出增強的CYSDV抗性。本發明也涉及新穎性和創造性的分離的核酸分子。此種分子包含例如具有SEQ ID NO :1、2和3中任何一個序列的核酸分子；10 50個核苷酸長度並與SEQ ID NO :1、2或3 具有至少80%，優選至少85、88、91、93、95、96、97、98或99%序列同一性的核酸分子；能夠在嚴格雜交條件下與具有SEQ ID NO :1、2或3序列的核酸分子雜交的核酸分子；以及與前面核酸分子中任何一種互補的核酸分子。這裡描述的核酸分子可以適宜地用作本發明方法中的雜交探針或擴增引物。在另一方面，本發明提供了檢測與本文所述CYSDV抗性連鎖的標記的寡核苷酸探針或引物。本文的檢測探針和引物選擇為與通過本發明擴增反應產生的雙鏈DNA擴增子的其中一個鏈「基本」互補。允許本發明檢測探針和引物包含與它們靶序列的一個或多個錯配。一般而言，表現出與靶DNA寡核苷酸序列至少65%，更優選至少80%同源性的序列被認為適合用在本發明方法中。現通過下列非限制性實施例描述本發明。實施例 實施例1.發現與對黃瓜中CYSDV有抗性的QTLl緊密連鎖的標記標記對黃瓜中CYSDV有抗性的QTLl的位置先前已通過AFLP連鎖作圖研究，如 TO02/2^36中描述的。通過對帶有相反表型(抗性和易感性)的多重F2池執行分群分析法(分組分析法，bulked segregantanalysis(BSA))，從而精細地定位(Fine-mapping)對黃瓜中CYSDV有抗性的QTL1。這導致另外的AFLP標記。通過BSA識別的標記定位在F2個體和QTL異基因重組體(QIR)上。解釋了 CYSDV抗性水平的表型值，如此識別出比1002/^2^36中描述的那些更緊密連鎖的三個標記 QTLl :E23/M60-F-187-P1、E16/M55-F-130-P1 和 E16/M55-F-112-P2。 定位在QTL-I內的標記位點和CYSDV抗性似乎如此緊密地連鎖在染色體上，以至於它們在多於95 %，優選多於97 %的減數分裂中一起遺傳(標記E23/M60-F-187-P1和E16/ M55-F-112/130-P1 之間的距離為 1. 5cM)。本文考慮了，標記 E23/M60-F-187-P1 和 E16/M55-F-130-P1之一甚至更緊密地連鎖到在多於99%的減數分裂中與其一起遺傳的抗性位點上。因而，在每代的標記位點和抗性之間觀察到的重組率(釐摩，cM)將小於5。在本發明的特定實施方式中，基因連鎖的位點在染色體上可以相距2，或1，或更小的cM。標記序列確定了最緊密排列(lined)的AFLP標記的鹼基對序列。標記E16/M55-F-130-P1 似乎是E16/M55-F-112-P2的等位基因，因為這兩個片段是相同的，除了 18個鹼基對序列的插入 / 缺失(INDEL)差異之外。確定 AFLP 標記 E16/M55-F-130-P1 和 E16/M55-F-112-P2 的序列如下抗性等位基因E16/M55-F-130(5，到3，)GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCATCTGTGTTTA TAATCCCATC TGTGTTTATA ATCCCATTTT GAATAAGGTCGTTAA易感等位基因E16/M55_F112(5，到3，)GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCATCTGTGTTTA TAATCCCATT TTGAATAAGG TCGTTAA未識別到標記E23/M60-F-187-P1的多態性。確定的AFLP標記E23/M60-F-187-P1 序列如下抗性等位基因E23/M60-187(5，到3，)GAATTCTAAA ATTTAGAATA TAATTCGATA TTTCTCTAAA AAAGACAAAATAAAAAGAAT GAGTAGAAAA CTATAGAAAG AGGCAGAATC GTGTGAATGAAAGATAAAAG AGAATAGTAA CGAAGAATTT TCCAGACGTG TTCAAATGGTTGATATGAGT TAA預測倌 性狀和標記之間的遺傳連鎖確定了間接選擇的預測值標記。所有AFLP標記的預測值都通過篩選源自不同育種計劃的一系列38個近交系確定(圖幻。然後，將該基因型與相應的表型進行比較。標記E23/M60-F-187-P1和雙等位基因標記E16/M55-F-112/130的基因型總是與所測試近交系表型相對應。這與以下結論一致標記E23/M60-F-187-P1和雙等位基因標記E16/M55-F-112/130與CYSDVQTL1緊密連鎖。此外，標記E23/M60-F-187-P1 和雙等位基因標記E16/M55-F-112/130具有100%的預測值。因而，標記E23/M60-F-187-P1 和E16/M55-F-112/130對標記輔助育種計劃中的間接選擇特別有用。實施例2. SCAR標記開發將標記E16/M55-F-130/112轉化成SCAR(序列特徵的擴增區域)標記，其可以通過聚合酶鏈反應測定法檢測。設計引物，並開發熱循環條件。PCR 引物針對AFLP 標記 E16/M55-F-130/112 設計以下 PCR 引物正向引物5' -AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGACACACT GGTACGAACCCAATTCAATT CCCTTTTC-3』反向引物5， -AACGACCTTATTCAAAATGGGAT-3，
PCR熱循環該PCR反應混合物由1. 5μ 1 5. ΟμΜ正向引物、1. 5μ 1 5. O μ M反向引物、0. 20 μ 1 20. OmM(每種)dNTP 混合物、2. Ομ 1 IOx Taq PCR 緩衝液、1.2μ1 25. OmM MgCl2、0. 1 μ 1 5.0 單位/μ 1 Taq DNA 聚合酶(例如，New England Biolabs，MA，USA) IOpg-I μ g 模板 DNA 以及無菌去離子水組成從而使該混合物體積為20 μ 1。該PCR反應由94°C的變性(3.0分鐘)，此後是94°C變性(0. 5分鐘)、54°C退火(1. 0分鐘)和72°C延伸(1. 0分鐘)的35次循環，以及72°C最後延伸(5分鐘)組成，接著儲存在4°C下。MM測試了 25個近交系的SCAR標記(圖1)。結果與AFLP基因分型一致。AFLP分值 (A)證實抗性等位基因的存在，通過109個鹼基對的擴增DNA片段證明。AFLP分值(B)與有 18個鹼基對缺失的91個鹼基對的易感等位基因的存在關聯。因而，利用SCAR和AFLPE16/ M55-F-112/130標記的基因分型總是給出相同的結果。因此，SCAR標記可以與AFLP E16/ M55-F-112/130類似的方式應用於標記輔助育種。序列表De Ruiter Seeds R&D B. V.CYSDV抗性黃瓜植物的育種方法P86308EP005PatentIn version 3.31105DNAAFLP 標記 E16/M55-F-1301GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA TCTGTGTTTA 60TAATCCCATC TGTGTTTATA ATCCCATTTT GAATAAGGTC GTTAA287DNAAFLP 標記 E16/M55-F-1122GAATTCCCAA TGAACCCAAT TCAATTCCCT TTTCTTCTAC AGGAATCCCA TCTGTGTTTA 60TAATCCCATT TTGAATAAGG TCGTTAA3105DNAAFLP 標記 E23/M60-F-187
3GAATTCTAAA ATTTAGAATA TAATTCGATA TTTCTCTAAA AAAGACAAAA TAAAAAGAAT 60GAGTAGAAAA CTATAGAAAG AGGCAGAATC GTGTGAATGA AAGATAAAAG AGAATAGTAA 120CGAAGAATTT TCCAGACGTG TTCAAATGGT TGATATGAGT TAA458DNA設計用於雙等位基因AFLP標記E16/M55-F-130/112的SCAR標記的正向引物4AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGACACACT GGTACGAACC CAATTCAATT CCCTTTTC523DNA設計用於雙等位基因AFLP標記E16/M55-F-130/112的SCAR標記的反向引物5AACGACCTTA TTCAAAATGG GAT618DNA多態性多核苷酸雙等位基因AFLP標記E16/M55-F-130/1126CTGTGTTTAT AATCCCAT
權利要求
1.一種測試核酸樣品中存在選自SEQ ID NO :1、2和3中的至少一種核酸序列的方法， 包括確定所述核酸樣品中存在包含選自SEQ IDNO :1、2和3中的核酸序列的核酸的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，所述方法包括檢測SEQID NO 1相對於SEQ ID NO 2 的多態性中的至少一種。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸樣品是來自植物、植物種質或植物系的樣品。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述植物是葫蘆科植物。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述葫蘆科植物是黃瓜。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，所述方法是在與CYSDV抗性關聯的至少一個基因標記位點處對植物或種質進行基因分型的方法的一部分，所述CYSDV抗性具有含有選自SEQ IDNO :1、2和3中的核酸序列的標記。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述方法包括a)通過將擴增引物或擴增引物對與所述核酸樣品混合，擴增所述核酸序列或其部分的標記位點，其中，所述引物或引物對與所述標記位點或所述標記核酸序列的至少一部分互補或部分互補，並且其中，所述引物或引物對能夠利用所述樣品核酸作為模板核酸、通過 DNA聚合酶啟動DNA聚合，以及b)在包含DNA聚合酶和所述模板核酸的DNA聚合反應中延伸所述引物或引物對，以產生至少一個擴增子，以及可選地檢測所得的經擴增的標記擴增子中的所述核酸序列。
8.根據權利要求6所述的方法，其中，所述方法包括以下步驟a)可選地，通過將擴增引物或擴增引物對與所述核酸樣品混合，擴增所述核酸序列或其部分的標記位點，其中，所述引物或引物對與所述標記位點或所述標記核酸序列的至少一部分互補或部分互補，並且其中，所述引物或引物對能夠利用所述樣品核酸作為模板核酸、通過DNA聚合酶啟動DNA聚合，以及b)通過確定所述植物或種質的基因組核酸、或可選地經擴增的標記位點的熔融曲線， 以及在所述熔融曲線指示存在所述多態性的情況下確立所述標記位點中所述標記核酸序列的存在，從而確定在所述植物或種質的基因組中、或可選地在經擴增的標記位點中存在所述標記核酸序列。
9.根據權利要求6-8中任一項所述的方法，其中，所述引物或引物對選自SEQID NO 4和5構成的組。
10.一種選擇植物或種質的方法，包括執行根據權利要求3-9中任一項所述的方法和選擇具有選自SEQ ID NO :1和3中的至少一種核酸序列的植物或種質用於進一步育種目的。
11.一種植物育種方法，包括通過根據權利要求10所述的方法選擇植物或種質，和使所述選擇的植物或種質與第二植物或種質雜交從而產生後代植物或種質，所述第二植物優選來自優良植物系。
12.根據權利要求11所述的方法，進一步包括以下步驟分析從一種或多種所述後代植物或種質中分離的DNA樣品中存在選自SEQ IDNO :1、2和3中的至少一種核酸序列，其中，所述分析識別出包含與CYSDV抗性連鎖的至少一種標記的植物。
13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述後代植物或種質來自與所述至少一種核酸序列的存在有關、和/或與CYSDV抗性有關的分離群體。
14.根據權利要求11-13中任一項所述的方法，進一步包括回交、自交、異交和植物選擇中的一個或多個步驟。
15.根據權利要求11-14中任一項所述的方法，進一步包括對從利用所述方法產生的一種或多種植物中分離的DNA樣品進行分子標記分析的步驟，其中，所述分析識別出包含與CYSDV抗性連鎖的SEQ IDNO 1或3中的至少一種標記的植物，所述標記可選地與連鎖至 W002/22836中被識別為QTL-2的數量性狀位點的標記相結合。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，當與所述第二黃瓜植物或種質相比時，所述被識別出的植物表現為對CYSDV的抗性增強。
17.一種分離的核酸分子，選自以下構成的組a)具有SEQID NO :1、2和3中任何一個的序列的核酸分子；b)具有10至50個核苷酸長度並且與SEQID NO :1、2和3中任何一個具有至少80% 的序列同一性的核酸分子；c)能夠在嚴格雜交條件下與具有SEQID NO :1、2和3中任何一個的序列的核酸分子雜交的核酸分子；d)與a)至c)中任何一個的核酸分子互補的核酸分子。
18.根據權利要求17所述的核酸分子作為雜交探針或擴增引物的用途。
全文摘要
本發明涉及測試核酸樣品中存在選自SEQ ID NO1、2和3中的至少一種核酸序列的方法，包括確定所述樣品中存在包含選自SEQ ID NO1、2和3中的核酸序列的核酸的步驟。
文檔編號C12N15/82GK102325900SQ200980157127
公開日2012年1月18日 申請日期2009年12月18日 優先權日2008年12月19日
發明者蘿拉·奧拉拉·桑切斯, 南尼·馬希爾·法貝爾, 路易斯·穆洛爾·託雷斯 申請人:安莎種子控股有限公司