經修飾的轉酮酶及其用途的製作方法

2023-06-20 18:19:21

專利名稱：：經修飾的轉酮酶及其用途的製作方法經修飾的轉酮酶及其用途本發明提供了經修飾的轉酮酶。合成經修飾的轉酮酶之一以代替野生型轉酮酶的微生物對胺基酸而言是原養型的(prototroph)並在使用碳源中受損，所述碳源通過戊糖磷酸(pentosephosphate)途徑被同化。經修飾的酶和編碼該酶的多核苷酸可以用於物質的發酵過程，該過程使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作為底物用於生物合成例如核黃素、核黃素前體、黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物。它們也可以用於生產磷酸吡哆醛(維生素B6)、尿苷和腺苷及這些核苷酸的衍生物。所有的植物和許多微生物可以合成核黃素(維生素B2)，但是高等動物不能產生核黃素。因為它是碳水化合物酶促氧化所必需的輔酶(例如黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸)的前體，所以核黃素對於基礎代謝是必需的。在高等動物中，核黃素不足可以引起脫髮、皮膚炎症、視覺衰退和生長不足。催化從三磷酸鳥苷(GTP)和5-磷酸核酮糖生物合成核黃素所需的酶由及(枯草芽孢桿菌)中的四個基因(n'6G,r/^g,n'M和r仏//)編碼。這些基因位於一個操縱子上，其基因順序與酶催化的酶反應的順序不同。例如，催化核黃素生物合成中第一步的GTP環水解酶II由操縱子中第三個基因WM編碼。n7^基因也編碼另一酶活性，即4-磷酸3，4-二羥基-2-丁酮合酶(DHBPS)，其催化5-磷酸核酮糖到四碳單元4-磷酸3，4-二羥基-2-丁酮(DHBP)的轉化。脫氨基酶和還原酶由操縱子的第一個基因n'M7編碼。核黃素生物合成中倒數第二個步驟由2,4-二氧四氫喋啶合酶催化，所述2，4-二氧四氫喋啶是最後一個rA基因hW/的產物。控制該途徑最後一歩的核黃素合酶由操縱子的第二個基因n'^^編碼。位於n》操縱子3'端的基因的功能目前尚不清楚；然而，其基因產物不是核黃素生物合成所需要的。從hW3/啟動子的核黃素操縱子的轉錄由衰減機制控制，所述機制涉及位於n'W37和n'6G之間的調節前導區。該前導區內WO突變導致核黃素操縱子的去調節的(deregulated)表達。r^C基因中含有錯義突變的株系中也觀察到去調節的表達。已經顯示h6C基因編碼及^Mfo的黃素激酶/FAD合酶(Mack，M.,etal.，J.Bacterio.，180:950-955，1998)。去調節的突變降低了n'Z)C基因產物的黃素激酶活性，導致降低的黃素單核苷酸(FMN)細胞內濃度，所述黃素單核苷酸是核黃素調節體系的效應分子。過去，已經以大量不同的方式完成了具有提高的核黃素生產率和產率的核黃素生產菌株的工程改造。例如，(l)使用經典的誘變產生所選生物基因組中具有隨機突變的變體，隨後選擇更高的嘌呤類似物抗性和/或篩選提高的核黃素生產。(2)或者，過表達核黃素生物合成的末端酶(即催化三磷酸鳥苷(GTP)和5-磷酸核酮糖轉化為核黃素的酶)，也得到朝向靶產物的更高通量。進入和通過生物合成途徑(例如核黃素生物合成途徑)的代謝通量由該具體途徑的限速酶和這些酶底物的細胞內濃度決定。只有在飽和底物濃度下或髙於飽和底物濃度時，酶才能夠以其最大活性運作。飽和底物濃度是每種酶的特徵性質。例如，可以通過將5-磷酸核酮糖的細胞內濃度保持在4-磷酸3，4-二羥基-2-丁酮合酶的飽和底物濃度之上或儘可能接近該濃度，來提高進入核黃素途徑的代謝通量或將其保持在高水平，所述4-磷酸3,4-二羥基-2-丁酮合酶是核黃素生物合成途徑的假定限速酶。可例如如下達到5-磷酸核酮糖的高細胞內濃度阻止或幹擾5-磷酸核酮糖通過戊糖磷酸途徑的非氧化部分進入中樞代謝的引流。戊糖磷酸途徑的非氧化部分中一個關鍵酶是轉酮酶(transketolase)，其催化5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖可逆轉化為7-磷酸景天庚酮糖(seduheptulose-7-phosphate)禾n3-磷酸甘油醛。另外，轉酮酶還催化6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛轉化為5-磷酸木酮糖和4-磷酸赤蘚糖(Kochetov,G.A.1982，Transketolasefromyeast,ratliver,andpigliver,MethodsEnzymol.,90:209-23)。先前已經報導過轉酮糖編碼基因中帶有敲除突變的轉酮酶缺陷的5ad〃Mwte'fo菌株產生核糖，所述核糖在發酵液中累積(DeWulf，P.,andE.J.Vandamme.1997.ProductionofD-ribosebyfermentation,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:141-148;Sasajima,K.,禾口Yoneda,M.1984,Productionofpentosesbymicroorganisms.Biotechnol.andGenet.Eng.Rev.2:175-213)。顯然，在轉酮酶敲除突變體中提高的細胞內C5碳糖庫可以達到高達超出細菌生理需要的水平，並導致過量的核糖分泌。如上所述，還需要轉酮酶催化的反應來產生4-磷酸赤蘚糖，從所述糖衍生了三種蛋白質生成的芳香族胺基酸。因此，轉酮糖缺陷的微生物對於這些胺基酸是營養缺陷型的。只有當這些胺基酸或它們的生物合成前體(例如莽草酸)可以通過培養基被提供時它們才能生長。除了對芳香族胺基酸或莽草酸的不期望的營養缺陷型以外，轉酮酶缺陷的及swZ^'fc突變體顯示大量嚴重的多效作用(pleiotropiceffect),如在葡萄糖上非常緩慢的生長、受損的磷酸烯醇丙酮酸依賴性的磷酸轉移酶系統、去調節的碳分解代謝物阻遏和改變的細胞膜和細胞壁組成(DeWulf，P.,andE.J.Vandamme.1997)。另一轉酮酶缺陷的分泌核黃素的及w^'fc菌株由Gershanovichetal.描述(GershanovichVN,KukanovaAla,GalushkinaZM,StepanovAI(2000)Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol.3:3-7)。另外，US6,258,554Bl公開了過量生產核黃素的穀氨酸棒狀桿菌菌株(a0^ek7"er^mg/wtom/cwm)，其中缺乏轉酮酶活性。從US6,258,554Bl的公開內容可以注意到轉酮酶活性的缺乏和產生的胺基酸營養缺陷型對於經改善的核黃素生產力是必需的，因為原養型回復突變體以類似於具有野生型轉酮酶背景的穀氨酸棒狀桿菌菌株的量生產核黃素。這些缺點(即芳香族胺基酸營養缺陷型)和上文討論的多效作用使得轉酮酶缺陷的突變體成為穩定工業加工(例如在這類菌株內工業生產核黃素)較不優選的生產菌株。通常，提供轉酮酶突變體菌株是本發明的一個目的，所述轉酮酶突變體菌株以下述方式被修飾經修飾的轉酮酶的催化特性允許與未經修飾的轉酮酶相比更高的細胞內5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖濃度，但是其不具有上述轉酮酶缺陷型菌株的缺點。令人驚奇的是，目前已經發現通過遺傳改變微生物(例如Aw^/to)可以顯著地提高發酵產物例如核黃素的生產，而不丟失原養型特性，所述遺傳改變通過將野生型基因替換為突變基因進行，所述突變基因編碼經修飾的轉酮酶，所述經修飾的轉酮酶通過具有經調節的比活性而允許一些殘餘通量通過戊糖磷酸途徑。本發明涉及經修飾的轉酮酶、多核苷酸序列(其包含編碼具有上述特性的經修飾的轉酮酶的基因)、用這類多核苷酸序列轉化的宿主細胞，和以宿主細胞(其中野生型轉酮酶基因已經被編碼突變的轉酮酶的多核苷酸替代)為基礎用生物技術生產發酵產物(例如核黃素、核黃素前體、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一種或多種衍生物)的方法。作為分離突變體(其中野生型轉酮酶被這類修飾的轉酮酶之一替換)的第一個步驟，可以產生缺失突變體，其對於產蛋白質的芳香族胺基酸而言是營養缺陷型，並且在通過戊糖磷酸途徑同化的碳源(例如葡萄糖酸鹽)上不能生長。然後可以用編碼多種轉酮酶突變體的DNA片段的混合物轉化轉酮酶缺失突變體。可以分離原養型的轉化體，從中選擇在葡萄糖酸鹽上顯示減緩的生長率的轉化體。根據該方法分離的突變體可以合成經修飾的轉酮酶，所述酶允許足夠的4-磷酸赤蘚糖生物合成以阻止營養缺陷型生長，但是起到葡萄糖酸鹽同化的瓶頸作用。另外，可以預防在A^Mfo轉酮糖缺失突變體中典型地觀察到的不希望有的多效作用。US6,258,554Bl指出伴隨著營養缺陷型到原養型生長的回覆，分泌核黃素的C.g/wtom/c"m轉酮酶突變體喪失了它們生產比類似菌株(其含有野生型轉酮酶基因)更多的核黃素的能力。如本發明的實施例中所示，如上所述分離的原養型&犯/^fc轉酮酶突變體出人意料地生產比轉酮酶野生型親本菌株更多的核黃素，但是轉酮酶缺失突變體部分地喪失它們的核黃素生產能力。用於向DNA片段中引入突變的方法是本領域公知的。轉酮酶突變體可以例如通過蛋白質工程或通過隨機誘變產生，所述蛋白質工程使用例如酵母轉酮酶的可用的3D結構(Lindqvist，Y.，G.Schneider,U.Ermler,andM.Sundstrom.1992.Three-dimensionalstructureoftransketolase,athiaminediphosphatedependentenzyme,at2.5Aresolution.Embo.J.11:2373-9)用於選擇胺基酸序列的合適位置。在兩種情況下選擇過程均可以如上所述完成。當用於取代野生型轉酮酶時，經修飾的轉酮酶顯示催化特性，即經調節的比活性，所述活性允許宿主細胞在只能由戊糖磷酸途徑代謝的碳源(例如葡萄糖酸鹽)上生長時，與含有野生型轉酮酶的宿主細胞相比生長率降低。這些特性導致更高的細胞內5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖濃度和經由戊糖磷酸途徑的殘餘通量，從而能夠產生足夠的4-磷酸赤蘚糖以防止營養缺陷型生長。可用於本發明的"野生型酶"或"野生型轉酮酶"可包括上文定義的任何轉酮酶，其被用作設計本發明突變體的起點。野生型轉酮酶可以是真核的或原核來源的，優選真菌或細菌(特別是選自￡力"化/〃."、^z"7/m、Go/jwe^acfen'wm、5^cc/wromycey、5yemc^/zec/w附、CWt//'(2，1'尤—選地來自五.co/z'(大腸桿菌)、及raMfo(枯草芽孢桿菌)、S."cAem/drmk5./fl/c^wra/is、S.cere由'"e(酉良酒酵母)、gos觀"、C.y/aren.或爿.gow，7)來源的，或是具有下述胺基酸序列的任何轉酮酶，所述胺基酸序列與圖1所示胺基酸序列同源。最優選轉酮酶來自Sa"7/mwZ7rifo。"同源的"是指與圖1所示一個或多個胺基酸序列至少約50%相同、優選地至少約600%相同、更優選地至少約70。％、80%、85%、90%、95%相同、最優選地至少約98%相同的轉酮糖。在本發明上下文中"野生型"可包括可來自天然的轉酮酶序列以及合成轉酮酶的變體(只要它們與圖1所示任----序列同源即可)。術語"野生型轉酮酶"和"未經修飾的轉酮酶"在本文可互換使用。如本領域所已知的，術語"％相同"表示(根據情況的)多肽或多核苷酸序列之間的相關性程度，其通過這類序列字符串之間的匹配決定。"相同"可容易地通過已知方法確定，例如用程序BESTFIT(GCGWisconsinPackage,version10.2，AccelrysInc.,9685ScrantonRoad,SanDiego,CA92121-3752,USA)使用以下參數缺口建立罰分8，缺口延伸罰分2(默認參數)。本文使用"突變體"、"突變體酶"、"突變的酶"或"突變體轉酮酶"或"經修飾的轉酮酶"表示根據本發明的教導可來自給定的野生型酶/轉酮酶(根據上述定義)的任何變體，其用於替換宿主生物/細胞的野生型基因時應當對例如葡萄糖酸鹽和/或核糖的生產具有作用。就本發明的範圍而言，如何獲得突變體是無關的；可以例如通過定向誘變、飽和誘變、隨機誘變/定向進化(directedevolution)、化學或UV誘變整個細胞/生物等等獲得這類突變體。這些突變體也可以例如通過設計合成基因產生，和/或通過體外(無細胞)翻譯產生。為了測試比活性，可以通過本領域技術人員已知的方法(過)表達突變體。術語"突變體轉酮酶"、"經修飾的轉酮酶"或"突變的轉酮酶"在本文可互換使用。"宿主細胞"是下述細胞，所述細胞能夠生產給定的發酵產物，並含有野生型轉酮酶或編碼本發明的經修飾的核酸。合適的宿主細胞包括微生物細胞。本文使用的術語"比活性"表示野生型和突變體轉酮酶在適當地確定的反應條件下的反應速率，所述反應條件描述於Kochetov(Kochetov，G.A.1982.Transketolasefromyeast,ratliver,andpigliver.MethodsEnzymol90:209-23)。"比活性"定義了在給定溫度下，在給定的時間段和每確定量的蛋白質所消耗的底物和/或生產的產物的量。典型地，"比活性"表示為每分鐘每mg蛋白質消耗的ymol底物或形成的Atmol產物。典型地，/miol/分鐘被縮寫為11(=單位)。因此，/miol/分鐘/(mg蛋白質)或U/(mg蛋白質)的比活性單位定義在本說明書書全文可互換使用。應當理解在本發明的上下文中，比活性可以以相似的或優選相同的多肽鏈長度為基礎進行比較。許多突變可以以下述方式改變野生型轉酮酶在葡萄糖酸鹽上的生長如上所述被影響。提供具有上述特性的經修飾的轉酮酶是本發明的一個目的，其中經修飾的轉酮酶的胺基酸序列與對應的未經修飾的轉酮酶的胺基酸序列相比，含有至少一個突變。所述至少一個突變可以是添加、缺失和/或取代。優選地，所述至少一個突變是至少一個胺基酸取代，其中存在於未經修飾的轉酮酶胺基酸序列中的給定胺基酸被本發明的經修飾的轉酮酶胺基酸序列中的不同胺基酸替換。經修飾的轉酮酶的胺基酸序列與相應的未經修飾的轉酮酶胺基酸序列相比，可含有至少一個胺基酸取代。特別地，本發明的經修飾的轉酮酶在對應於SEQIDNO:2所示的5fl"〃"轉酮酶胺基酸序列位置357的胺基酸位置上，含有至少一個突變。在其它實施方案中，經修飾的轉酮酶與相應的轉酮酶胺基酸序列相比，含有至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個取代。例如，經修飾的轉酮酶與相應的未經修飾的轉酮酶胺基酸序列相比，含有一個到十個、一個到七個、一個到五個、一個到四個、兩個到十個、兩個到七個、兩個到五個、兩個到四個、三個到十個、三個到七個、三個到五個或三個到四個胺基酸取代。在本發明優選的實施方案中，未經修飾的轉酮酶可從(優選腸7/w"由.fo)中獲得，如SEQIDN0:2所示。相應的DNA序列顯示於SEQIDN0:1中。經修飾的轉酮酶在SEQIDN0:2的位置357上含有至少一個突變，產生具有上述特性的經修飾的轉酮酶。未經修飾的轉酮酶中，位於對應於SEQIDN0:2中所示胺基酸357的位置上的至少一個胺基酸取代可以選自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。在特別優選的實施方案中，突變的轉酮酶由一個取代組成，所述取代影響對應於SEQIDNO:2所示胺基酸序列的胺基酸位置357的胺基酸位置，並可選自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。在另一優選的實施方案中，經修飾的轉酮酶與相應的未經修飾的轉酮酶胺基酸序列相比，含有至少兩個胺基酸取代，其中至少一個突變對應於SEQIDNO:2所示胺基酸序列的胺基酸位置357，並可選自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。存在於未經修飾的轉酮酶中位置357的胺基酸優選地為精氨酸。未經修飾的轉酮酶序列中的胺基酸可以被改變為位置357的組氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬醯胺、賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸或纈氨酸。優選地，對應於SEQIDNO:2所示序列位置357的胺基酸位置上的取代由精氨酸與組氨酸、精氨酸與丙氨酸、精氨酸與絲氨酸、精氨酸與亮氨酸、精氨酸與賴氨酸、精氨酸與天冬醯胺、精氨酸與蘇氨酸、精氨酸與甘氨酸、精氨酸與異亮氨酸、精氨酸與纈氨酸的替換組成。本發明的經修飾的轉酮酶可包含(特別是在其N端或C端)外源胺基酸。"外源胺基酸"表示不存在於天然(天然發生的)轉酮酶中的胺基酸，優選至少約3個、至少約5個或至少約7個不存在於天然轉酮酶中的-一段連續胺基酸。優選的外源胺基酸片段包括但不僅限於"標籤"，所述標籤有助於重組產生的經修飾的轉酮酶的純化。這類標籤的例子包括但不限於"His6"標籤、FLAG標籤、myc標籤等等。為了計算比活性，數值需要針對這些額外的胺基酸進行校正(也參閱上文)。在另一實施方案中，經修飾的轉酮酶與相應的未經修飾的轉酮酶相比，可含有一個或多個(例如兩個)缺失。優選地，缺失影響相應的未經修飾的轉酮酶的N端或C端胺基酸，並且不顯著地降低酶的功能特性例如比活性。本發明還涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼本發明的經修飾的轉酮酶。本文使用"多核苷酸"是指多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未經修飾的RNA或DNA或經修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限於單鏈的和雙鏈的DNA、屬於單鏈區域和雙鏈區域混合物的DNA、單鏈和雙鏈的RNA，和屬於單鏈區域和雙鏈區域混合物的RNA、可以是單鏈的或(更典型地)雙鏈的或單鏈區域和雙鏈區域混合物的包含DNA和RNA的雜種分子。術語"多核苷酸"包括含有一個或多個異常鹼基(例如肌苷)或一個或多個經修飾的鹼基(例如三苯甲基化的鹼基)的DNA或RNA。本發明的多核苷酸可以通過修飾編碼未經修飾的轉酮酶的多核苷酸序列容易地獲得。這類編碼未經修飾的轉酮酶的多核苷酸序列的例子包括但不限於圖1的胺基酸序列。優選地，未經修飾的轉酮酶來源於萬ad//^，特別是5"6"fc，更優選的是編碼SEQIDNO:2所示未經修飾的轉酮酶的多核苷酸。向編碼未經修飾的轉酮酶的核苷酸序列中引入突變(例如添加、缺失和/或取代)的方法包括但不限於定向誘變和基於PCR的方法。本發明的DNA序列可以通過體外誘變的方法[參閱例如Sambrooketal.,M.o!,ecularCioning，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork]從本領域已知編碼轉酮酶的下述基因組或cDNA序列開始構建，所述序列可得自例如Genbank(Intelligenetics，California,USA)、EuropeanBioinformatksInstitute(HinstonHall,Cambridge,GB)、NBRF(GeorgetownUniversity,MedicalCentre,WashingtonDC,USA)禾口Vecbase(UniversityofWisconsin,BiotechnologyCentre,Madison,Wisconsin,USA)或來自圖1公開的序列信息。也適用於實現本發明的突變給定DNA序列的另一可能方法是通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)誘變。作為起始材料的DNA可以通過本領域已知並描述於例如Sambrooketal.(MolecularCloning)中的方法從各自的菌株/生物中分離。然而應當理解，根據本發明要構建/突變的編碼轉酮酶的DNA序列也可以以已知DNA序列為基礎通過本領域已知方法(例如描述於EP747483中的)例如通過構建合成基因來製備。—旦獲得了完整的本發明DNA序列，可以通過本領域已知並描述於例如Sambrooketal.(s.a.)中的方法將它們整合進載體中或直接引入宿主生物基因組中，以在合適的宿主系統中(過)表達所編碼的多肽。然而，本領域技術人員知道DNA序列自身也可以被用於轉化本發明的合適的宿主系統以獲得所編碼的多肽的(過)表達。在優選的實施方案中，本發明提供了(i)編碼經修飾的轉酮酶的DNA序列，其帶有上文定義的至少一個突變，並在標準條件下與特異修飾的轉酮酶的任何DNA序列雜交，例如與根據SEQIDNO:1的DNA序列雜交的DNA序列，或(ii)編碼經修飾的轉酮酶的DNA序列，其帶有上文定義的至少一個突變，但是因為遺傳密碼子的簡併性而不雜交，但是其編碼與下述DNA序列具有完全相同胺基酸序列的多肽，所述DNA序列在標準條件下與本發明的經特異修飾的轉酮酶的任何DNA序列雜交，或(iii)DNA序列，其屬於這類經修飾的DNA序列的片段並保留其多肽活性特性。雜交的"標準條件"在本發明的上下文中表示下述條件，所述條件通常由本領域技術人員用於檢測特異的雜交信號並描述於例如Sambrooketal.,"MolecularConing"，secondedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,NewYork中，或優選地是所謂的嚴格雜交和非嚴格洗滌條件，或更優選地是所謂的嚴格雜交和嚴格洗滌條件，所述雜交和洗滌條件是本領域技術人員熟悉的並描述於例如Sambrooketal.(s.a.)中。嚴格雜交條件的一個特異例子是在下述溶液中於42t:下過夜孵育(例如15個小時)後在O.lxSSC中於約65T:下洗滌雜交支持物，所述溶液含有50%甲醯胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt's溶液、10%硫酸葡聚糠和20/zg/ml經變性、剪切的鮭精DNA。在另一優選的實施方案中，本發明還提供了可以通過所謂的聚合酶鏈式反應方法("PCR")通過圖2所示PCR引物獲得的DNA序列，所述PGR引物以具體描述的DNA序列為基礎設計。本發明的多肽和多核苷酸優選地以經分離的形式提供，並優選地被純化為均質。術語"經分離的"表示材料從其初始環境(例如，如果其為天然存在時的天然環境)取出。例如，存在於活的微生物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是經分離的，但是從天然體系中的一些或所有共存材料中分離的相同多核苷酸或多肽是經分離的。這類多核苷酸可以是載體的一部分和/或這類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分並且仍然是分離的，因為這類載體或組合物不是其天然環境的一部分。本文使用的經分離的多核苷酸或核酸可以是與下述兩個編碼序列均不緊鄰的DNA或RNA，所述編碼序列在所述DNA或RNA來源的生物的天然存在的基因組中與所述DNA或RNA緊鄰(一個在5'端一個在3'端)。因此，在一個實施方案中，核酸包括與編碼序列緊鄰的一些或所有5'非編碼(例如啟動子)序列。因此術語"經分離的多核苷酸"包括例如被整合進載體中、自主複製的質粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或作為獨立於其它序列的獨立分子存在的重組DNA(例如通過PCR或限制性內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)。其還包括屬於雜種基因一部分的重組DNA，所述雜種基因編碼額外的多肽，所述重組DNA基本不含細胞材料、病毒材料或培養基(當通過重組DNA技術產生時)或化學前體或其它化學品(當化學合成時)。另外，"經分離的核酸片段"是不作為片段天然存在並且不會在天然狀態下發現的核酸片段。本文使用術語經分離的多肽是指基本不含其它多肽的多肽。經分離的多肽優選地大於80%純淨，更優選地大於90%純淨，進一歩更優選地大於95%純淨，最優選地大於99%純淨。純度可以根據本領域已知方法測定，例如通過SDS-PAGE和隨後的蛋白質染色。然後可以通過密度測定法定量蛋白質條帶。用於測定純度的其它方法屬於現有常規技術。如上所述，本發明的經修飾的轉酮酶和相應的多核苷酸可以用於合適宿主細胞的基因工程，使得其在下述物質的發酵過程中更好和更有效力，所述物質使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作為底物用於生物合成。合適宿主細胞中所述經修飾的轉酮酶的存在可以導致更高的細胞內5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖濃度和所述重組宿主中通過戊糖磷酸途徑的殘餘通量，使得能夠生產足夠的4-磷酸赤蘚糖來預防營養缺陷型生長。適當的宿主細胞為例如真菌，如J^ergz'肌例如j^wg/〃Mm'ger或Js/e^gz7/t^oo^ae,或如TWc/zocfenwa例如7WcAcxiem2areese/，或y^/z^ya例如爿Wiyagos57/〃，或五remoAecz'wm例如五remW/jec/wmas/b"'i;或酉孝母，如Sacc/^ramyc&s例如Sacc/zaramjKc&s1cerev/w'ae，或如Ca"力'(ia_/7a/m'，或屍/c/w'a如屍/c/n'a/oston^，或//araeww/flpo/ymorp/za例如//./w(ymor/Aa(DSM5215)。可以使用的細菌為例如5a"7//例如Sfld〃wraZri/^，或5Vreptom^yce51例如》SVre/tom_yc"//Wtiara。可以使用的￡^/zm'c/n'aco//為例如co/ZK12菌株，例如M15或HB101。因此，本發明涉及微生物，其中轉酮酶的活性被修飾使得微生物能夠在只通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源(例如葡萄糖酸鹽)上生長，與含有野生型轉酮酶的宿主細胞相比生長率降低。通常可以在相同的生物中再次引入來自某生物(例如的獲得的轉酮酶突變體並立刻用作宿主細胞，或將任何獲得的突變體引入任何其它相關的宿主細胞。本文使用術語"生長率"表示下文細菌細胞通過一分為二複製。如果生長不受限制，倍增以恆定速率持續，從而細胞數量和種群速率在每個連續的時間段倍增。對於該指數增長類型，將細胞數的自然對數針對時間(優選以小時計)作圖得到直線。該直線的斜率是生物的比生長速率，其為每單位時間每個細胞的分裂數。在食物中，細菌不能持續生長，因為可獲得的營養是有限的，且廢物會累積。在這些條件下，生長曲線趨向於S形。提供下述重組宿主細胞是本發明的一個目的，其中根據本發明的所述帶有經修飾的轉酮酶的重組宿主細胞(例如微生物)在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源(特別是葡萄糖酸鹽)上的生長率與野生型生物相比少於100%。特別地，所述生長速率與野生型生物的生長率相比可以降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%和更多。優選地，與含有野生型轉酮酶基因的細胞相比，生長速率降低在10%和90%之間，更優選地在20%和80%之間，還更優選地在25%和75%之間。特別地，本發明涉及經遺傳工程改造的/重組產生的宿主細胞(也稱作重組細胞或經轉化的細胞)，其中野生型轉酮酶基因已經被替換為編碼下述酶的經修飾的轉酮酶基因，所述酶允許在不僅僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上輕微降低或不降低的生長，但是當生物在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上生長時顯示顯著降低的生長速率。這類經遺傳工程改造的宿主細胞顯示發酵產物產率和生產過程效率的提高，優點是可以預防不期望的營養缺陷型生長和多效作用。本發明還涉及生產能夠表達本發明轉酮酶的宿主細胞的方法，包括步驟(i)製造突變的轉酮酶，其與各自的野生型酶相比顯示經調控的活性，即a)提供編碼第一轉酮酶或未經修飾的轉酮酶的多核苷酸，所述轉酮酶具有應當被改變的特性；b)向多核苷酸序列中引入一個或多個突變，使得突變的多核苷酸序列編碼新的或經修飾的轉酮酶，所述轉酮酶與所述第一轉酮酶相比含有至少一個胺基酸突變，其中所述至少一個胺基酸突變可以是對應於SEQIDNO:2所示胺基酸序列位置357上的胺基酸；c)任選地在載體或質粒中插入經突變的多核苷酸；(ii)用來自相同生物或另一生物的轉酮酶變體代替宿主細胞的野生型轉酮酶，所述轉酮酶變體允許在不僅僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上正常或輕微降低的生長，但是當生物在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上生長時顯示顯著降低的生長速率，即a)替換合適的野生型宿主細胞的野生型轉酮酶而不改變基因的調節序列；b)測定在最小培養基中葡萄糖酸鹽上的生長速率並與野生型宿主菌株比較；禾口c)選擇轉酮酶突變體，其允許在葡萄糖酸鹽上小於野生型菌株100%的生長速率。本發明還涉及用於生產下述物質的方法，所述物質是5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖的次級產物，所述方法包括a)在合適的培養基中、允許經修飾的轉酮酶表達的條件下，培養經遺傳工程改造的/重組產生的宿主細胞，其中野生型轉酮酶基因已經被編碼下述酶的經修飾的轉酮酶基因替換，所述酶允許在不僅僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上輕微降低或不降低的生長，但是當生物在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上生長時顯示顯著降低的生長速率；和b)從培養基中分離發酵產物。本文使用"發酵產物"可以是由上文定義的合適宿主細胞產生的任何產物，所述產物的生物合成使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作為底物。這類發酵產物的例子包括但不限於核黃素、核黃素前體、黃素單核苷酸(FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物、磷酸吡哆醛(維生素B6)、鳥苷、腺苷和這些核苷酸的衍生物。本發明的上下文中，"核黃素前體"和"核黃素、FMN或FAD的衍生物"應當包括其(生物)合成中需要5-磷酸核酮糖或5-磷酸核酮糖作為中間產物或底物的任何和所有的代謝物。在本發明的上下文中，這類(生物)合成途徑是天然的還是非天然的(即不是天然發生而是經生物技術工程改造的途徑)沒有關係。優選地，合成途徑是生物化學的途徑。核黃素前體和核黃素、FMN或FAD的衍生物包括但不限於DRAPP;5-氨基-6-核糖基氨基-2，4(lH，3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸鹽；2,5-二氨基-6-核糖醇基氨基-4(3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸鹽；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸鹽；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮；6，7-二甲基-8-核糖醇基氨基-2,4-二氧四氫蝶啶(DMRL);和黃素蛋白。術語"核黃素"也包括其衍生物，例如5-磷酸核黃素及其鹽，例如核黃素5-磷酸鈉。多核苷酸、多肽、重組宿主細胞和本文所述的方法可用於上文定義的一種或多種發酵產物的生物技術生產。本發明的合適宿主細胞的遺傳工程改造和代謝改造方法是本領域技術人員已知的。類似地，用於例如核黃素、核黃素前體、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一種或種衍生物的合適純化方法(可能)是精細化學品生物合成和製造領域所公知的。應當理解用於生物技術生產發酵產物(例如根據本發明的核黃素、核黃素前體、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一種或多種衍生物)的方法不限於上文所述的全細胞發酵方法，而是也可以使用例如透化的宿主細胞、細胞粗提物、細胞抽提物，所述細胞抽提物通過例如離心或過濾、或甚至重建的反應途徑用經分離的酶從細胞殘餘物中澄清。這類方法的組合也在本發明的範圍內。在無細胞生物合成的情況下(例如通過重建的反應途徑)，經分離的酶是否由宿主細胞製備並從中分離、通過體外轉錄/翻譯製備或通過其它手段製備是無關的。發酵培養基必須含有合適的碳源。合適的底物可包括，但不限於單糖如葡萄糖或果糖，寡糖如乳糖或蔗糖，多糖如澱粉或纖維素或其混合物，和來自可更新的給料的未經純化的混合物。應當理解本發明中使用的碳源可包括多種含碳底物，並僅受生物選擇的限制。本文描述的本發明的多種實施方案可以交叉組合。本發明即將通過以下的非限制性例子更詳細地闡述。這些例子參考附圖描述。如上文所述，圖1顯示編碼未經修飾的轉酮酶的多核苷酸序列的例子，圖2顯示一組引物。特別地，圖1顯示通過程序clustalW(1.83)計算的、來自^c/zen'c/^co//(TKT—ECOLI)、5ac〃/^s15"Z)ri/^(TKT—BACSU)、5aa'〃ws//c/emyb/7w/s(TKT一BACLD)、萬acZ〃MS/w/c^wram1(TKT—BACHD)、Co，eZ^"m.簡g7wtow/cww(TKT—CORGL)、SflccAaro柳3;ce51cerev/^Vze(TKT—YEAST)禾口A'，gcw^/^'(TKT—ASHGO)的轉酮酶胺基酸序列的多序列比對。以下實施例之一中討論的與勘c///^認M/"轉酮酶的胺基酸殘基357同源的/等效的位置是黑體字母。用於這些位置的編號根據Sac/Z/船卯^/fo野生型胺基酸序列完成。這種類型的比對可以用CLUSTAL或PILEUP使用標準參數完成。如所示的，轉酮酶的胺基酸序列是高度保守的。特別是在所示的所有轉酮酶中和更多的未顯示的轉酮酶中，精氨酸357(根據5aa7/M^^ft'fo轉酮酶編號)是保守的。因此，也可以用其它轉酮酶進行所述類型的實驗(所述實驗使用本文報導的概念和突變)用於促進核黃素、核黃素衍生物或化合物(其使用5-磷酸核糖、5-磷酸木酮糖或5-磷酸核酮糖作為前體)的生產，所述其它轉酮酶在與Saa7/^5"6rifo轉酮酶胺基酸序列位置357同源的位置上具有精氨酸，如^^&^0^》7^轉酮酶。也可能用位置357上突變的i^c77/船ra&Zfc轉酮酶突變體基因替換生物的原始轉酮酶基因，並可針對新生物對所述DNA序列進行或不進行適應性修飾。轉酮酶突變體基因來自其即將被引入的生物中不是必須的。另一宿主生物所需的實踐步驟是公開的，並是本領域技術人員已知的和在別處描述的。實施例1:分離來自5aa7/w^Mto的基因組DNA使用來自Qiagen(QIAGENGmbH，QIAGENStr.1，40724Hilden,Germany)的DNeasyTissueKit試劑盒根據供應商的說明書製備gDNA。使用3ml在37。C(250rpm)在VY液體培養基(BectonDickinson,Sparks,MD21152,USA)中孵育的5acz7/wraZ^'fo過夜培養物中的1ml作為細菌細胞來源。最後將gDNA洗脫進200yl的AE緩衝液(試劑盒中提供)中。實施例2:擴增來自S"cz7/m的轉酮酶基因使用來自5.y"MfoPY79(P.Youngman,J.Perkins,andR.Losick(1984)，ConstructionofacloningsitenearoneendofTn917intowhichforeignDNAmaybeinsertedwithoutaffectingtranspositionin5acz,〃wsswM/korexpressiononthetransposon-borneermgene.Plasmid12:1-9;參閱實施例1)的gDNA擴增汰/基因。根據基因組DNA序列，基因在其編碼序列(SEQIDNO:l)內含有一個五coRI位點。因為五coRI限制性位點通常被用於克隆進&c/^n'c/'"o//表達載體如pQE80(QIAGENGmbH,QIAGENStr.1,40724Hilden，Germany)中，所以通過用T代替C315(這是將苯丙氨酸密碼子從TTC改變為TTT的沉默突變)刪除該位點。為此，進行兩個獨立的PCRA和B。PCRA使用以下的PCR條件在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2ptM引物tktIS(根據序列SEQIDNo:3，也參閱圖2)禾qtkt2AS(根據SEQIDNo:4，圖2)、0.2mM每種核苷酸(ATP,GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene,GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands)、100ng基因組DNA(實施例1)。溫度調節如下步驟l:95。C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:52。C30秒步驟4:72。C30秒步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。在以下條件下進行PCRB:在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2岸引物tkt2S(根據SEQIDNo:8，圖2)和tkt]AS(根據SEQIDNo:13，圖2)、0.2mM每種核苷酸(ATP，GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚'合酉每(Stratagene，GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands)、100ng基因組DNA(實施例1)。溫度調節如下歩驟l:95。C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:52。C30秒步驟4:72。C2分鐘步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。通過瓊脂糖凝膠電泳和隨後使用來自Qiagen(QIAGENGmbH,QIAGJENStr.1，40724HiWeri,Germany)的MinEluteGelExtractionKit從凝膠中抽提來純化兩種PCR產物A和B。使用PCR產物A和B的重疊區，可能通過第三種PCR將它們組裝在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2/^M引物RpiMutS(根據SEQIDNo:5，圖2)禾Qtkt1ASohne(根據SEQIDNo:6，圖2)、0.2mM每種核苷酸(ATP,GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stmtagene,GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost,TheNetherlands)、100ngPCR產物A禾卩PCR產物B。步驟1:95°C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:53。C30秒步驟4:72。C2.5分鐘步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。在QiagenPCRpurificationKit(QIAGENGmbH，QIAGENStr.1,40724Hilden，Germany)的幫助下純化PCR產物並洗脫進50pl洗脫緩衝液中。通過五coRI消化證實PCR產物。為了進一步證實，用引物tktlS、tkt2S、tkt2AS、tkt3S(根據SEQIDNo:9，圖2)、tkt4S(根據SEQIDNo:10，圖2)、tkt5S(根據SEQIDNo:11，圖2)、tkt6S(根據SEQIDNo:12，圖2)、tktlAS對其測序。實施例3:構建汰,突變體酵母轉酮酶的3D結構可以與突變(其顯示影響酵母轉酮酶底物的結合)的選擇一起獲得(Nilsson,U.,L.Meshalkina,Y.Lindqvist,andG.Schneider.1997)。在位置R359(^a7/MswMfo轉酮酶中編號357)上，原始的精氨酸被幾乎所有其它胺基酸取代。突變體的構建基本上如實施例l中所述進行。圖1中顯示了包括來自酵母、S"a7/w^Mfo和來自其它生物的轉酮酶的胺基酸序列比對。使用不含五coRI的tkt基因作為模板(實施例2)，如對￡coRI位點的缺失所述引入突變。對PCRA和B使用以下PCR條件在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2/^M引物RpiMutS(A)或tkt357nnn-S(B)和tkt357AS(A)(根據SEQIDNo:14，圖2)或tkt1ASohne(B)、0.2mM每種核苷酸(ATP，GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene,GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands)、100ng不含￡coRI的汰/基因(實施例2)。在PCRB的情況下，根據被引入的胺基酸選擇有義引物在wMto轉酮酶的位置357上引入天冬醯胺用tkt357N-S(根據SEQIDNo:15，圖2)、引入穀氨醯胺用tkt357Q-S(根據SEQIDNo:16，圖2)、引入丙氨酸用tkt357A-S(根據SEQIDNo:17，圖2)、引入賴氨酸用tkt357K-S(根據SEQIDNo:18，圖2)、引入絲氨酸用tkt357S-S(根據SEQIDNo:19，圖2)、引入蘇氨酸用tkt357T-S(根據SEQIDNo:20，圖2)、引入組氨酸用tkt357H-S(根據SEQIDNo:21，圖2)、引入纈氨酸用tkt357V-S(根據SEQIDNo:22，圖2)、引入異亮氨酸用tkt357I-S(根據SEQIDNo:23，圖2)、引入亮氨酸用tkt357L-S(根據SEQIDNo:24，圖2)、引入甲硫氨酸用tkt357M-S(根據SEQIDNo:25，圖2)和對於甘氨酸用tkt357G-S(根據SEQIDNo:26，圖2)。溫度調節如下-.步驟1:95。C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:52。C30秒步驟4:72。C60秒步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。通過瓊脂糖凝膠電泳和隨後使用來自Qiagen(QIAGENGmbH,QIAGENStr.1，40724Hilden，Germany)的MinEluteGelExtractionKit從凝膠中抽提來純化兩種PCR產物A和B。在第三個PCR中進行PCR產物A和B的組裝在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2引物RpiMutS和tktlASohne、0.2mM每種核苷酸(ATP,GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene，GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost,TheNetherlands)、100ngPCR產物A和PCR產物B。步驟l:95。C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:53。C30秒步驟4:72。C2.5分鐘步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。用QiagenPCRpurificationKit(QIAGENGmbH，QIAGENStr.1,40724Hilden，Germany)純化轉酮酶的PCR產物並洗脫進50洗脫緩衝液屮。使用PCR產物轉化Sad/Z船卵M:fo。實施例4:構建轉酮酶缺陷的^C涯"犯/勸'fc菌株向Sfld//^幼Mfo基因組的原始汰H立點中不含標記地引入突變的轉酮酶，構建轉酮酶缺陷的菌株。將通過PCR獲得的、含有轉酮酶基因(SEQIDNO:2)鹼基對452到1042和鹼基對1562到2001的兩個DNA片段與新黴素抗性基因盒組合(M.Itaya，K.Kondo,andT.Tanaka.1989.Aneomycinresistancegenecassetteselectableinasinglecopystateinthe5ac"/wchromosome.NucleicAcidsRes17:4410)。PCRA使用以下的PCR條件在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2岸引物tktRecIS(根據SEQIDNo:27，圖2)和tktRecIAS(根據SEQIDNo:28，圖2)、0.2mM每種核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene,Gebo而California,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands)、100ng實施例2的經擴增的汰基因。溫度調節如下步驟1:95。C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:52。C30秒步驟4:72。C30秒步驟5:72。C5分鐘步驟2到步驟4重複30次。在以下條件下進行PCRB:在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2引物tktRec2S(根據SEQIDNo:29，圖2)和tktRec2AS(根據SEQIDNo:30，圖2)、0.2mM每種核苷酸(ATP，GTP，TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene,GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands)、100ng實施例2的經擴增的汰基因。溫度調節如下95°C3分鐘95。C30秒52°C30秒72°C2分鐘72°C5分鐘步驟2到步驟4重複30次。通過瓊脂糖凝膠電泳和隨後使用來自Qiagen(QIAGENGmbH,QIAGENStr.1,40724Hilden,Germany)的MinEluteGelExtractionKit從凝膠中抽提來純化兩種PCR產物A和B。因為PCR產物A和B與新黴素抗性盒序列的的重疊區，可能通過第三種PCR將它們組裝在與DNA聚合酶一起提供的適當緩衝液中2AtM引物tktRecIS和tktRec2AS、0.2mM每種核苷酸(ATP,GTP,TTP,CTP)、2.5U校正讀碼的DNA聚合酶(Stratagene,GebouwCalifornia,1101CBAmsterdamZuidoost，TheNetherlands),100ngPCR產物A、100ngPCR產物B，禾B100ng新黴素抗性盒。步驟1:95°C3分鐘步驟2:95。C30秒步驟3:55。C30秒步驟4:72。C2.5分鐘步驟5:72。C5分鐘步驟2到4重複35次。將五個組裝的PCR合併並用QiagenPCRpurificationKit(QIAGEN步驟1:步驟2:步驟3:步驟4:步驟5:GmbH，QIAGENStr.1，40724Hilden，Germany)純化並洗脫進50yl洗脫緩衝液中。通過瓊脂糖凝膠電泳證實正確的PCR產物並用於轉化Sfld//^PY79。感受態5ad〃ww6"to細胞的製備根據Kunstetal.，1988(F.K畫t,M.Debarbouille，T.Msadek，M.Young,C.Mauel,D.Karamata,A.Klier,G.Rapoport，andR.Dedonder.1988.DeducedpolypeptidesencodedbytheSad〃iw幼6ft.fo5^cf/locussharehomologywithtwo-componentsensor-regulatorsystems.JBacteriol170:5093-101)製備。2mlMNGE+BactoCasaminoAcid(CAA)(9mlMN培養基(13.6g/1K2HP04、6.0g/1KH2P04、0.88§/1檸檬酸鈉*2^0)、lml葡萄糖(20。/。)、40穀氨酸鉀(40%)、50/^1檸檬酸鐵(m)銨(2.2mg/l，新鮮製備的)、100^色氨酸(8mg/l)、30MgS04(1M)、+/-50MlBactoCasaminoAcid(20%,BectonDickinsonAG,Postfach,CH-4002Basel,Switzerland)用單個菌落接種並在37。C和250ipm下孵育過夜。使用該培養物接種10mlMNGE+CAA(起始OD5。。nm為0.1)並在37"C下搖動(250rpm)培養直到OD，，達到1.3。用相同體積的MNGEw/oCAA稀釋培養物並再孵育1小時。離心步驟(10分鐘，4000rpm，20°C)後，將上清液傾倒在無菌管中。將沉澱物重懸於1/8保留的上清液中。將300yl細胞稀釋於1.7mlMN(lx)、43//1葡萄糖(20%)和34^MgS04(1M)中。將10和20gl所製備的PCR產物加入400/xl經稀釋的感受態細胞中並在37'C下搖動30分鐘。添加100jul表達混合物(500^5%酵母提取物(BectonDickinsonAG,Postfach,CH-4002Basel,Switzerland),125/xlCAA(20%)、如果用於選擇的話1/100的最終抗生素濃度(2/zg/rnl新黴素)和750^無菌bidest.水)並在37。C下將細胞搖動1小時。最後，將細胞離心沉澱、重懸於200/xl的上清液中並塗布在含有2Atg/ml新黴素的TBAB平板(BectonDickinsonAG,Postfach,CH-4002BaselSwitzerland)上。在VY培養基(5g/1酵母提取物(BectonDickinsonAG,Postfach,CH-4002Basel,Switzerland),25g/1牛肉浸出培養液(Sigma))上培養兩種轉化體。如實施例1中所述從轉化體之一(命名為BS3402)分離基因組DNA，並通過標準PCR證實新黴素基因盒對轉酮酶DNA從鹼基對1043到1561片段的正確替換，所述標準PCR使用tktRecIS和tktRec2AS作為引物。如對轉酮酶缺失突變體所期望的那樣，菌株不能在核糖或葡萄糖酸鹽作為唯一碳源時生長，並需要所有三種芳香族胺基酸或莽草酸用於生長。實施例5:用轉酮酶變體基因轉化轉酮酶缺陷的S"C///^W&Z'fo菌株BS3402如實施例4中所述，用0.5和1Mg經擴增的轉酮酶基因及其變體的DNA(實施例2和3)用於轉化BS3402。通過在最小培養基上生長鑑定陽性菌落，所述最小培養基為SMS培養基(2g/1(NH4)2S04、14g/1K2HP04、6g/lKH2P04、lg/l檸檬酸三鈉、0.2g/lMgS04*7H20;1.5%瓊脂(BectonDickinsonAG,Postfach,CH-4002Basel,Switzerland)和微量元素(500倍濃縮物5.0g/1MnS04xlH20、2.0g/1CoCl2*6H20、0.75g/1(NH4)6Mo7024*4H20、0.5g/1A1C13*6H20、0.375g/1CuCl.2H20))中2g/l葡萄糖和山梨糖醇。菌落在24到48小時後可見。所有的轉化體對新黴素敏感指示著新黴素基因被引入的野生型和突變的岀基因替換。從轉化體中分離基因組DNA並如實施例1所述通過PCR擴增血基因。通過測序證實被引入的突變。沒有觀察到其它核苷酸交換。產生的5ad//^^Mfo菌株被稱作:R357A—BS34(B、R357H-BS3482、R357K-BS3484、R357G—BS3512、R357V—BS3487、R357I-BS3509、R357L-BS3507、R357T-BS3492、R357S-BS34卯、R357M-BS3505、R357N-BS3486、R357Q-BS3488。實施例6:用轉酮酶缺陷野生型菌株BS3402的噬菌體PBS-1裂解物轉導5a"7/M^MfoRB50::[pRF69](EP0405370)如Henkinetal"1984(Henkin,T.M.,andG.H.Chambliss.1984.Geneticmappingofamutationcausinganalterationin5ac/〃W51swMtoribosomalproteinS4.MolGenGenet193:364-9)所述用噬菌體PBS-1進行轉導工作。為了製備PBS-1裂解物，在TBAB平板(5/xg/ml新黴素)上於37。C下將菌株BS3402培養過夜。使用細胞將25mlLB培養基(BectonDickinsonAG,Postfach，CH-4002Basel,Switzeriand)接種至Klett20-30的OD(使用綠色濾光器)。當50%的細胞能動時，向0.8ml的培養液中加入0.2ml的PBS-1噬菌體裂解物(Henkin，T.M.,andG.H.Chambliss.1984.Geneticmappingofamutationcausinganalterationin5a"7tosmZ^他ribosomalproteinS4.Mo1GenGenet193:364-9)。在37。C搖動下孵育30分鐘後，加入9mlLB培養基。然後是在37'C下的另一30分鐘孵育步驟。然後加入4^g/ml氯黴素，並將孵育再持續2小時。最後，將管轉移進37t:的千燥溫箱內，在其中過夜。第二天早晨，將培養物濾過0.45/mi的濾器並儲存於《C或直接用於轉導。為了轉導過量生產核黃素的菌株RB50::[pRF69]，將該菌株在TBAB平板上於37。C過夜培養。使用該平板的細胞接種25mlLB培養基(Klett20-30)。當培養物達到Klett175時，將0.8ml細胞與如上所述製備的0.2ml來自菌株BS3402的PBS-1裂解物混合。在37。C搖動下孵育30分鐘後，將細胞離心並重懸於1mlVY培養基中。隨後在同樣的條件下孵育1小時。將200到1000Ad經轉導的細胞塗布在含有2Mg/ml新黴素的選擇平板上。測試長成的菌落的新黴素抗性。分離gDNA(實施例1)後，進行使用引物tktIS和Rec2AS的標準PCR證實實施例4的構建體對汰野生型基因的替代。經證實的菌株稱作BS3523。實施例7:將經修飾的轉酮酶基因引入菌株BS3523為了製備菌株BS3403、BS3482、BS3484、BS3486、BS3490和BS3512的PBS-1裂解物，在TBAB平板(5Aig/ml新黴素)上將各菌株於37。C過夜培養。使用來自這些平板的細胞將25mlLB培養基接種至Klett20-30的OD(使用綠色濾光器)。當50%的細胞能動(在Klett150左右)時，向0.8ml的培養液中加入0.2ml的PBS-1噬菌體裂解物(Henkin，T.M.,andG.H.Chambliss.1984.GeneticmappingofamutationcausinganalterationinSflc/〃wssw^^7/sribosomalproteinS4.MolGenGenet193:364-9)。在37'C輕微搖動或轉動(轉鼓)下孵育30分鐘後，向細胞中加入9mlLB培養基。將它們在相同條件下再孵育30分鐘。加入氯黴素至4ptg/ml的濃度，並將孵育再持續2小時。將管在37'C下不搖動孵育過夜。第二天早晨，將培養物濾過0.45/mi的濾器並儲存於4'C或直接用於隨後的轉導。為此，將轉酮酶缺陷菌株BS3523(參閱實施例6)在TBAB平板上於37。C過夜培養。使用來自該平板的細胞接種25mlLB培養基(Klett2.0-30)。將培養物在37。C搖動下孵育。當培養物達到Klett175時，將0.8ml細胞與0.2ml如上所述的每種菌株BS3403、BS3482、BS34S4、BS3486、BS3490和BS3512的PBS-1裂解物混合。在37。C搖動下孵育30分鐘後，將細胞離心並重懸於1mlVY培養基中。在同樣的條件下孵育1小時後，再次離心細胞，懸浮於0.2mllxSMS培養基中並塗布在選擇平板(如上所述的1xSMS和lg/1葡萄糖、lg/1山梨糖醇和15%瓊脂糖)上。測試長成的菌落的新黴素抗性缺失。分離gDNA(實施例1)後，進行使用引物tktIS和Rec2AS的標準PCR，從基因組DNA中擴增汰/基因。顯示滅活的由基因被完整汰基因替換的菌落的汰Z基因被測序，以證實突變的存在。產生的菌株稱作BS3525(BS3484裂解物)、BS3528(BS3482裂解物)、BS3530(BS3486)、BS3534(BS3403裂解物)、BS3535(BS3490裂解物)、BS3541(BS3512裂解物)。實施例8:轉酮酶突變菌株在葡萄糖和葡萄糖酸鹽上的生長為了評價轉酮酶突變對萬a"7/"s幼6rito生存力和生長的作用，在2g/1葡萄糖或葡萄糖酸鹽上測定產生的菌株的最大生長率。使用以下的培養基1xSMS(2g/1(NH4)2S04、14g/lK2HP04、6g/1KH2P04、lg/l檸檬酸三鈉、0.2g/1MgS04*7H20)、2g/1葡萄糖或葡萄糖酸鹽、500酵母提取物和實施例5中所述的微量元素溶液。用過夜培養物(5mlVY，重懸於1ml新鮮的VY中)將300ml帶擋板的燒瓶中25ml所述培養基接種至Klett20到30的OD。將它們在37。C搖動(220rpm)下孵育。在停滯期期間以--小時的間隔檢測培養物的OD。在對數期期間，間隔降低至30分鐘。對數期期間的至少四個數據點被用於測定最大生長速率。表1:tableseeoriginaldocumentpage30野生型菌株PY79如所預期地顯示在兩種底物上均為最高的生長速率。通過在轉酮酶位置357上引入不同突變，如所預期地，在葡萄糖酸鹽上的生長比在葡萄糖上的生長受到更多影響。在葡萄糖酸鹽上最大生長速率的降低被用作下述影響的度量，所述影響是轉酮酶突變對經過非氧化戊糖磷酸分路的通量和對戊糖磷酸累積的影響。大泛圍的生長速率被所示突變覆蓋。實施例9:搖瓶中的核黃素生產用核黃素生產菌株RB50::[pRF69]、BS32525、BS3528、BS34530、BS3434、BS34335和BS3441(參閱實施例7)接種5ml含有氯黴素(10yg/ml)的VY。過夜培養後，將細胞離心(15分鐘，4000rpm)並懸浮於lml篩選培養基(2xSMS、10g/l葡萄糖、lg/l酵母提取物，和如實施例5中所述的微量元素)中。用0.25ml重懸的細胞接種含有25ml篩選培養基的200ml帶擋板的燒瓶。培養物在水飽和的大氣中於37t孵育48小時。48小時孵育時間(其中在所有培養物中提供的葡萄糖被耗盡)後，從培養物中取出0,5ml的樣品，添加35Ml4NNaOH並將混合物振蕩1分鐘。然後直接添加465/zl1M磷酸鉀緩衝液，pH6.8。通過在14000rpm(Eppendorf離心機5415D)離心5分鐘來澄清混合物。將上清液轉移至新管。使用核黃素測定的兩種不同方法。對於熱測定法而言，用800水稀釋200Ml上清液。444nm處的吸光度乘以因數0.03305以獲得每升培養基的核黃素克數。對最終結果而言，將獲得的值針對體積差異進行校正。核黃素濃度也通過HPLC根據實施例10測定。結果在表2中顯示錶2:-故士.4.閨株UV結果相對於HPLC結果相對於核黃素RB50::[pRF69]核黃素[mg/1]RB50::[pRF69]的％的％BS3528(R357H)179171%139193%BS3535(R357S)173166%136188%BS3534(R357A)144138%124172%BS3525(R357K)148142%112155%BS3559(R357Q)134129%103143%BS3530(R357N)126120%93129%RB50::[pRF69]104100%72100%BS3541(R357G)9289%6692%BS3523(缺失)9087%5881%幾乎所有含有轉酮酶突變的菌株顯示清楚提高的核黃素生產，而轉酮酶陰性菌株生產比對照菌株更少的核黃素。在R357H突變的情況下，核黃素濃度幾乎加倍。實施例10:核黃素髮酵如EP405370中所述進行發酵過程。用菌株(l)RB50::[pRF69]、(2)BS3534(R357A)和(3)BS3528(R357H)進行發酵。在24小時和48小時的發酵時間測量培養液中的核黃素濃度和生物質(細胞乾重)。如表3所示，親本菌株RB50::[pRF69]在48小時內生產9.8g/1的核黃素，對底物的產率為3.59%(w/w)。生物質以對底物20.3%(w/w)的產率產生。表達經修飾的轉酮酶基因的RB50::[pRF69]衍生物顯示在核黃素生產中的顯著提高。BS3528和BS3534分別產生11.7g/1和14.6g/l。這對應於BS3528和BS3534對葡萄糖分別為4.23%和5.14%的產率(表3)。這些結果證明轉酮酶活性的修飾導致核黃素生產力的提問。表3:48小時發酵時間後核黃素和生物質對底物的產率tableseeoriginaldocumentpage32實施例ll:用於測定核黃素的分析方法為了測定核黃素，可以使用以下分析方法(Bretzeletal,，J.Ind.Microbiol.Biotechnol,22，19-26，1999)。色譜系統是裝配有二元泵、柱恆溫箱和冷卻的自動採樣器的Hewlett-Packard1100系統。串聯使用二極體陣列檢測器和螢光檢測器。記錄兩組信號，280nm處的的UV和446nm激發、520nm發射的螢光。與保護管一起使用不鏽鋼SupercosilLC-8-DB柱(150x4.6mm,3ym顆粒尺寸)。移動相為100mM醋酸(A)和甲醇(B)。使用根據以下流程的梯度洗脫時間[分鐘]%A%B09826982155050255050將柱溫度設定為2(TC，流速為1.0ml/分鐘。運行時間為25分鐘。發酵樣品被稀釋、過濾和分析，而不進行其它處理。通過與外標比較定量核黃素。計算是以280nm處的UV信號為基礎的。使用購自Fluka(9471Buchs，Switzerland)的核黃素作為標準材料(純度》99.0%)。權利要求1.經修飾的轉酮酶，其中經修飾的轉酮酶的胺基酸序列含有至少一個突變，使得與相應的未經修飾的野生型酶相比，所述經修飾的酶的比活性被調控。2.根據權利要求1的轉酮酶，其中所述經修飾的轉酮酶的胺基酸序列在對應於SEQIDNo.2所示Sfld〃w轉酮酶的位置357的胺基酸位置上含有突變。3.根據權利要求2的轉酮酶，其中所述野生型胺基酸精氨酸被組氨酸、丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺或天冬醯胺替換。4.根據權利要求2的轉酮酶，其中所述野生型胺基酸精氨酸被組氨酸、丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺或甘氨酸替換。5.根據權利要求1到4中任一項的轉酮酶，其為來自5mz7/m、￡>ewoAec/M/w<xs/^y/或Co^y"e6fitcten'w^2g/wto附/ct/附屬的裡予生型轉酉同酶的修6.根據權利要求5的轉酮酶，其中野生型轉酮酶來自Sfld//^屬。7.根據權利要求6的轉酮酶，其中野生型轉酮酶來自5fl"7/i8.根據權利要求1的經修飾的轉酮酶，其中所述至少一個突變是以以下的方式進行的用經修飾的轉酮酶替換宿主細胞的野生型轉酮酶後，所產生的新菌株在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上的生長速率與含有野生型轉酮酶的原始宿主細胞相比被降低，優選地被降低至10%到90%之間的生長速率，更優選地降低至20%到80%之間的生長速率，進一步更優選地降低至25%到75。％之間的生長速率。9.包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因編碼根據權利要求1到8中任一項的轉酮酶。10.根據權利要求9的多核苷酸序列，其包含根據SEQIDNO1的核苷酸序列。11.含有根據權利要求9或10的多核苷酸的載體。12.用代替細胞野生型轉酮酶基因的根據權利要求9或10的多核苷酸或用根據權利要求11的載體遺傳工程改造的宿主細胞，其中與含有野生型轉酮酶的宿主細胞相比，所述宿主細胞在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上的生長速率被降低。13.根據權利要求12的宿主細胞，其中所述生長速率被降低了至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。14.用於生產根據權利要求12或13的、能夠表達經修飾的轉酮酶的宿主細胞的方法，包括步驟(i)產生突變的轉酮酶，其與相應的野生型酶相比顯示受調控的活性；(ii)用來自相同生物或另一生物的經修飾的轉酮酶替換所述宿主細胞的野生型轉酮酶，所述經修飾的轉酮酶允許在不僅僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上正常或輕微降低的生長，但是當所述生物在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上生長時生長速率降低。15.根據權利要求14的方法，其中宿主細胞選自細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、哺乳動物/動物細胞和植物細胞。16.根據權利要求15的方法，其中宿主細胞是五remo^edwwa"/、Cb^ywe6a"en'w附g7i^a附/cw附或來自5ad〃1^屬白勺生物。17.以5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖為生物合成前體的物質的生產方法，包括a)在合適的培養基中、允許經修飾的轉酮酶表達的條件下，培養經遺傳工程改造的/重組產生的宿主細胞，其中野生型轉酮酶基因己經被編碼下述酶的經修飾的轉酮酶基因替換，所述酶允許在不僅僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上輕微降低或不降低的生長，但是當生物在僅通過戊糖磷酸途徑代謝的碳源上生長時弓I起所述生物的生長速率降低；和b)從所述培養基中分離所述發酵產物。18.根據權利要求17的方法，其中使用根據權利要求12或13的宿主細胞或根據權利要求14到16中任一項生產的宿主細胞。19.根據權利要求17或18的方法，其中生產了發酵產物核黃素、核黃素前體、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一種或多種衍生物。20.根據權利要求19的方法，其中生產了核黃素或其衍生物。全文摘要本發明涉及用於生物技術生產化合物的改良方法，所述化合物以5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作為生物合成的前體，如核黃素(維生素B2)、FAD、FMN、磷酸吡哆醛(維生素B6)、鳥苷、GMP、腺苷、AMP。本發明還涉及生產這些化合物的生物。其還涉及突變的轉酮酶及其編碼多肽的產生，所述突變的轉酮酶被引入生產菌株時允許在葡萄糖上正常生長，但是在葡萄糖酸鹽上的生長被降低。文檔編號C12P25/00GK101300344SQ200680041181公開日2008年11月5日申請日期2006年10月25日優先權日2005年11月2日發明者漢斯-彼得·霍曼,麥可·漢斯,迪特馬爾·盧達爾特,馬丁·萊瑪恩申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司