一種具有抗腫瘤活性的化合物及其製備方法
2023-06-20 23:02:21
專利名稱：一種具有抗腫瘤活性的化合物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物化學醫藥領域，涉及一種具有抗腫瘤活性的化合物及其製備方法，具體的說，本發明涉及一種從蒙藥苦馬豆(Sphaerophysa salsula(Pall.)DC.)中提取的具有明顯預防和治療腫瘤作用的新型三萜類化合物及其製備方法。
背景技術：
目前，全世界每年有600多萬人死於癌症，新發病例800萬，這數字還在逐年增加。我國13億人口中每年有百萬新發癌症病人，待治療病人約200萬，死亡約130萬。估計到2006年，我國將有170萬人死於癌症，癌症已成為人類的一大殺手！然而，以手術、放療、化療為主的傳統治療模式雖然有一定療效，卻存在許多不足，未能取得整體滿意效果。因此，人們把目光轉向中藥，試圖從天然成分中尋找毒副作用小，作用獨特的抗腫瘤藥物。苦馬豆(Sphaerophysasalsula(Pall.)DC.)為豆科苦馬豆屬植物，主要分布於我國西北，其性微苦、平，有補腎、利尿、消腫固精之功效。現代藥理學研究表明，苦馬豆全草水提物具有降血壓、中樞神經系統抑制作用及對動物血流動力學和耐缺氧的影響。迄今為止，國內外對其化學成份知之甚少，更沒有其關於抗腫瘤活性的報導。為了探索這一藥用植物是否具有抗腫瘤有效成分，我們首次對苦馬豆果實的提取物的化學成分進行了研究，發現了一種高效的具有抗腫瘤作用的化合物。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的化合物。
本發明的另一個目的是提供上述化合物的製備方法。
本發明的再一個目的是提供上述化合物的應用。
本發明的提供了一種具有抗腫瘤活性的化合物，該化合物的結構式為
其中，基團R1是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3z或者葡萄糖基中的一種；R2是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一種；R3是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一種。為了敘述方便可簡稱Sphaerophysone B或苦馬豆酮B。
本發明的一個實施例中，該化合物的結構式為
該化合物被命名為7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。表1為苦馬豆酮B核磁共振的數據結果。
表1苦馬豆酮B的NMR數據(in CD3OD，1H NMR 500MHz，13C NMR 125MHz)
本發明的苦馬豆酮B單體，是一種新發現的新型三萜類化合物；迄今為止，國內外沒有其抗腫瘤活性的報導。而苦馬豆素(Swainsonine)為一生物鹼類化合物，最早從澳大利亞的植物Swainsona canescens中分離得到，其廣泛存在於黃芪屬和棘豆屬植物，在我國也存在於「瘋草」中，因而，它們之間有本質的不同。
本發明的苦馬豆酮B可採用各種常規的方法製備，例如化學合成或者從適當的原料中提取。例如，本發明的7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可以採用如下方法製備的(1)將苦馬豆粉碎；(2)以濃度(體積比濃度)為30-100％的飽和脂肪醇回流或浸泡提取2-5次，每次1-24小時，然後回收醇，得到醇提取物；(3)將醇提取物溶於1-100倍的水，以等體積的有機溶劑萃取2-5次，得到有機溶劑提取物；用於萃取的有機溶劑可以為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者正丁醇；(4)將上述有機溶劑提取物過色譜柱，洗脫後即得。
本發明中，作為原料的苦馬豆取適量即可，對於不同數量的苦馬豆原料，提取和製備的試劑量相應改變，反應溫度也為常規溫度，例如室溫，20-30℃。
本發明中，所用飽和脂肪醇濃度較好為60-100％。
本發明中，飽和脂肪醇較好為甲醇或乙醇。
本發明中，飽和脂肪醇用於將原料中的化合物充分溶解，以達到粗提目標化合物的目的。(2)中回流提取次數可以為2-3次，提取時間為1-2小時/次。例如，用於回流或浸泡的飽和脂肪醇可以是苦馬豆體積的0.5-100倍，較好的，飽和脂肪醇與苦馬豆的體積比為0.5∶1-10∶1。
本發明中，(2)中浸泡提取次數可以為2-3次，提取時間為8-16小時/次。
本發明中，醇提取物可以溶於1-10倍於醇提取物體積的水。
本發明中，用於萃取的有機溶劑為氯仿和/或二氯甲烷，或者兩者的混合物。
本發明中，柱色譜填料可以為矽膠或氧化鋁。
本發明中，樣品量與填料的體積比範圍為1∶1-1∶7。
本發明中，(4)中的洗脫劑為石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中任意兩種混合或任意三種混合；兩兩混合的混合體積比例為100∶1-1∶1，三相溶劑的混合體積比例為100∶1∶1-4∶2∶1。
本發明中，(4)中的洗脫劑為氯仿-甲醇或者二氯甲烷-甲醇。
本發明所使用的試劑的設備都是市售或者常用的，實驗條件可以根據實驗室的條件進行常規替換和優化。
另一方面，本發明提供了苦馬豆酮B的應用，即將該化合物用於製備抗腫瘤藥物。
研究表明，本發明的苦馬豆酮B對腫瘤細胞的抑制隨著化合物濃度的增加而增加，其機理是將細胞阻滯在G2/M期，對小鼠的抑瘤實驗表明，苦馬豆酮B可抑制瘤體生長。
本發明的一個實施例中，以MTT法進行抗腫瘤作用的篩選。對7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對腫瘤細胞系(HepG2)、腦膠質瘤細胞(U87)、腦膠質瘤細胞(SF188)、乳腺癌細胞(MCF-7)、肺癌細胞(H460)及正常肝細胞系L02的作用進行了研究。結果顯示隨著用藥濃度增高，與相應不加藥對照組相比，細胞增殖活性分別下降了，說明化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。而正常肝細胞系L02的細胞增殖活性未有變化，顯示出該化合物對正常細胞很少有毒性。
顯微鏡觀察7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷處理腫瘤細胞系HepG2後細胞形態變化。未有上述化合物處理的細胞形態正常；7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷處理後的許多細胞，形態在光鏡下變圓，經Hoechst 33528染色後，螢光鏡下胞核固縮，核碎裂。
用流式細胞儀檢測7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對腫瘤細胞系HepG2的細胞周期影響。結果顯示化合物能使細胞阻滯於G2/M期。進一步研究表明，7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷抗腫瘤細胞能上調p53蛋白的表達。
建立肝移植瘤小鼠模型，通過消化道或腹腔注射等給藥途徑進行體內抑瘤實驗。在治療12天後，7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷治療組瘤體重量顯著低於生理鹽水組。
本發明的苦馬豆酮B可與市售或者常用的載體結合，用於預防或者治療腫瘤和癌症。所述的藥物可以為片劑或者針劑。
利用本發明苦馬豆酮B，通過各種常規篩選方法，可篩選出與苦馬豆酮B發生相互作用的物質，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明的苦馬豆酮B及其抑制劑、拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
以本發明的苦馬豆酮B為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的人苦馬豆酮B可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的苦馬豆酮B還可與其他治療劑一起使用。
本發明的苦馬豆酮B在製備抗愛滋病藥物中的應用中，可以是針劑或者片劑。
當本發明的苦馬豆酮B多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明中，所述的腫瘤或者癌症可以是肝癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌或者血癌等等。
本發明的苦馬豆酮B為有效的抗腫瘤藥劑，在該植物中含量高，生產成本較低。本發明從苦馬豆酮B單體。該方法簡單可靠，成本低，所提取的化合物的純度都在99％以上，提取的效果好、成本低，實現了高效、經濟的目的。可進行工業化大生產，利於推廣應用。並且能充分利用我國西北豐富的苦馬豆資源，可以推動西部大開發。
圖1為7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對HepG2和L02細胞增殖影響圖。同時設相應的不加藥組；在處理24小時後用MTT法測定細胞增殖活性。用不同濃度的化合物處理肝腫瘤細胞系HepG2和正常肝細胞系L02。結果顯示，隨著用藥濃度增高，與相應不加藥對照組相比，細胞增殖活性分別下降了，說明化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。而正常肝細胞系L02的細胞增殖活性未有變化，顯示出該化合物對正常細胞很少有毒性。其中，按下式計算苦馬豆酮B對癌細胞的生長抑制率，抑制率＝(1-給藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100％。
圖2為7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷體外抗腫瘤的結果圖。所用腫瘤細胞系有U87、H460、SF188和MCF-7。同時設相應的不加藥組；在處理24小時後用MTT法測定細胞增殖活性。結果顯示隨著用藥濃度增高與相應不加藥對照組相比細胞增殖活性分別下降了，說明化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。
圖3為用Western Blotting方法分析7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷處理腫瘤細胞系HepG2後p53蛋白表達變化。結果顯示化合物能上調p53蛋白的表達。
圖4為7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷處理腫瘤細胞系(HepG2)4小時後細胞形態變化圖。A為未有上述化合物處理細胞形態，光鏡下細胞正常；B為化合物處理細胞後形態，光鏡下許多細胞變圓。C為未有化合物處理細胞經Hoechst 33528染色後細胞核的形態，螢光鏡下細胞核基本正常；D為化合物處理細胞經Hoechst 33528染色後細胞核形態，螢光鏡下胞核固縮，核碎裂。
圖5為用流式細胞儀檢測7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對腫瘤細胞系HepG2的細胞周期影響結果圖。結果顯示化合物能使細胞阻滯於G2/M期。
具體實施例方式
以下通過具體的實施方式的實施例對本發明的內容作進一步詳細的說明。但不應將實施例理解為對本發明的限制。在不脫離本發明上述思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段作出的各種替換手段或變更，均包含在本發明之內。
實施例1 7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-比喃葡萄糖苷的提取A.將1kg藥材苦馬豆粉碎後，裝入提取罐B.8L的95％乙醇回流提取3次，每次2小時，回收乙醇，得乙醇提取物103g。
C.將乙醇提取物溶於1L水，以等體積的氯仿萃取3次，得氯仿提取物33.7g。
D.氯仿提取物經矽膠柱色譜(溼法裝柱，幹法上樣)，樣品量與矽膠總量比為1∶5，以氯仿∶甲醇(100∶2)洗脫3個保留體積後，重結晶得7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(147mg)。
實施例2 7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的提取a將1kg藥材苦馬豆粉碎後，裝入提取罐b 10L甲醇浸泡提取3次，每次12小時，回收甲醇，得甲醇提取物116g。
c將甲醇提取物溶於800mL水，以等體積的二氯甲烷萃取2次，得二氯甲烷提取物31.9g。
d二氯甲烷提取物經氧化鋁柱色譜(溼法裝柱，幹法上樣)，樣品量與氧化鋁重量比為1∶10，以二氯甲烷∶甲醇(100∶3)洗脫4個保留體積後，重結晶得7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(132mg)。
實施例3 7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的體外抗腫瘤作用取對數期的細胞每孔3×104接種於96孔板上，12h後，棄上清，按一下分組給藥腫瘤細胞設不加藥組和加藥組(濃度0~100μM)，每組設6個復孔，培養24h，棄上清，加入帶MTT(四氮唑鹽，Sigma產品)的培養液50μl培養4h(0.5mg/mL)，加入100μl DMSO(二甲亞碸)，振蕩1小時，於酶標儀上570nm處測OD值。正常細胞系L02做對照。重複3次。
結果顯示，隨著用藥濃度增高，與相應不加藥對照組相比，細胞增殖活性分別下降了，說明化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。而正常肝細胞系L02的細胞增殖活性未有變化，顯示出該化合物對正常細胞很少有毒性。
實施例4細胞形態學觀察和Hoechst 33528染色腫瘤細胞設不加藥組和加藥組(加化合物濃度2μM)。細胞經2μM化合物作用4小時可進行光鏡觀察；然後，經冷甲醇固定後PBS洗滌兩次，Hoechst 33528染色20分鐘，螢光鏡下觀察細胞核形態。
未有上述化合物處理的細胞形態正常，經Hoechst 33528染色後細胞核亦基本正常；苦馬豆酮B處理後的許多細胞，形態在光鏡下變圓，經Hoechst 33528染色後，螢光鏡下胞核固縮，核碎裂。
實施例5流式細胞術分析細胞周期實驗設正常對照組(不加化合物7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和加藥組(加化合物，濃度2μM)。細胞經2μM化合物作用6小時、18小時後收集細胞，經冷PBS洗滌兩次，用70％預冷乙醇固定12小時以上，經PBS洗滌後加15μl RNase A(10g/L)和400μl碘化丙錠(50mg/L)避光染色；流式細胞儀(Becton Dickinson FACScan Flow Cytometer)檢測，FACS數據用FLOWJO software(Tree Star，CA)軟體進行數據分析。結果顯示化合物能使細胞阻滯於G2/M期。
不加藥組6小時(A)和18小時(B)G2/M細胞數分別為7.73±0.98％，9.65±0.14％。加藥組6小時(C)和18小時(D)G2/M細胞數分別為18.1±0.87％，29.4±0.9％。結果顯示化合物能使細胞阻滯於G2/M期。
表2用流式細胞儀檢測藥物(2μM)對腫瘤細胞系HepG2的細胞周期影響
實施例6 Western Blotting方法分析p53蛋白表達變化收集HepG2細胞加100μl去汙劑裂解液煮沸5分鐘，等量蛋白上樣，12％SDS-丙烯醯胺凝膠電泳，轉膜，5％脫脂奶封閉，PBS-T漂洗，加一抗(p53 1∶1000)過夜，加二抗室溫反應3h，化學發光底物顯色。結果顯示化合物7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷能上調p53蛋白的表達。
實施例7體內抑瘤實驗建立肝移植瘤小鼠模型。昆明種小鼠(購自上海實驗動物中心)雌雄兼有，體重19.2±1.8g。將肝癌實體瘤HepG2移植到小鼠，接種於小鼠腋下皮內。12天後，以無菌操作取出肝癌實體瘤勻漿器勻漿，用生理鹽水1∶10稀釋，然後各組小鼠腋下皮下注射瘤液0.25mL/只接種。給藥(7β，24β，25-三羥基-9，19-環阿爾廷-1-烯-3-酮25-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)組於接種前4天開始灌胃給藥或腹腔注射等給藥直到接種後11天，第12天將小鼠處死，取出瘤體，剝離後稱取碼瘤體淨重。此實驗重複3次，對3批實驗結果進行統計分析。
表3體內抑瘤實驗的初步結果
權利要求
1.一種分離提取的化合物，其特徵在於，該化合物的結構式為 其中，基團R1是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3z或者葡萄糖基中的一種；R2是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一種；R3是β/α-OH、OMe、＝O、O(C＝O)CH3或者葡萄糖基中的一種。
2.一種如權利要求2所述的化合物，其特徵在於，其結構式為
3.一種如權利要求2所述化合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將苦馬豆粉碎；(2)以濃度為30-100％的飽和脂肪醇回流或浸泡提取2-5次，每次1-24小時，然後回收醇，得到醇提取物；(3)將醇提取物溶於1-100倍的水，以等體積的有機溶劑萃取2-5次，得到有機溶劑提取物；所述的有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯或者正丁醇；(4)將上述有機溶劑提取物過色譜柱，洗脫後即得權利要求2所述化合物。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所用飽和脂肪醇濃度為60-100％。
5.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，飽和脂肪醇為甲醇或乙醇。
6.根據權利要求3的製備方法，其特徵在於，(2)中回流提取次數為2-3次，提取時間為1-2小時/次。
7.根據權利要求3的製備方法，其特徵在於，(2)中浸泡提取次數為2-3次，提取時間為8-16小時/次。
8.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，醇提取物溶於1-10倍量的水。
9.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，用於萃取的有機溶劑為氯仿或者二氯甲烷。
10.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，柱色譜填料為矽膠或氧化鋁。
11.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，樣品量與填料的體積比範圍為1∶1-1∶7。
12.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，(4)中的洗脫劑為石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中任意兩種混合或任意三種混合；兩兩混合的混合體積比例為100∶1-1∶1，三相溶劑的混合體積比例為100∶1∶1-4∶2∶1。
13.根據權利要求12所述的製備方法，其特徵在於，(4)中的洗脫劑為氯仿-甲醇或者二氯甲烷-甲醇。
14.如權利要求1所述的化合物在製備抗腫瘤藥物中的應用。
15.如權利要求14所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為片劑或者針劑。
16.如權利要求14所述的應用，其特徵在於，所述的腫瘤是肝癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌或者血癌。
全文摘要
本發明屬於生物化學領域，涉及一種具有抗腫瘤活性的化合物及其製備方法。人們常常談癌色變，這是因為癌症已日趨成為人類的第一位死因，但是到目前為止又缺乏特效藥預防和治療癌症或者腫瘤。本發明以蒙藥苦馬豆(Sphaerophysa salsula(Pall.)DC)為原料，經分離純化即獲得所述具有抗腫瘤活性的化合物。本發明的化合物製成抗腫瘤藥劑，可以用於肝癌、腦瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌和血癌等。
文檔編號A61P35/00GK1900105SQ200610029180
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月20日 優先權日2006年7月20日
發明者朱煥章, 馬忠俊 申請人:復旦大學