可逆的終止子核苷酸和使用方法

2023-06-20 08:06:06 3

專利名稱：可逆的終止子核苷酸和使用方法
可逆的終止子核苷酸和使用方法
1. 介紹
利用可逆的終止子核苷酸測序多核苷酸的方法典型地包括多個鑑定
單個鹼基和重新產生測序引物的3'末端的步驟，所述測序引物是允許鑑定
所述多核苷酸的每個連續鹼基所需要的。這些步驟典型地包括將可逆的終
止子結合在所述引物的3'末端，洗掉未結合的可逆終止子和其它測序試 劑，檢測附著到所結合的可逆終止子上的標記，從所結合的終止子上去除 所述標記，並且從所述可逆終止子去除封閉基團。因此，目前利用可逆終 止子的多核苷酸測序方法是費時費力的，並且具有與鑑定每個鹼基相關的 高成本。因此，在本領域中，存在對於可逆終止子核苷酸和減少鑑定多核 苷酸的每個鹼基所需要的步驟數目的應用方法的需求。
2. 附圖簡述


圖1提供一種示例性可逆終止子核苷酸的結構，其包含染料標記、磷 酸酯(phosphate銜閉基團和可斷裂的接頭，所述可斷裂的接頭包含磷酸酯 引發部分；
圖2提供一種可斷裂的接頭的實例，其包含螢光標記和磷酸酯引發部 分；和
圖3提供一種可斷裂的接頭的實例，其包含螢光標記和磷酸酯引發部分。
3. 詳述
本部分詳細描述本發明的各種不同的實施方案。應該使用標題幫助組 織本發明的不同組成部分。
本發明公開的是用於對多核苷酸進行測序包括單分子測序的組合物 和方法。本發明公開的組合物包括可逆終止子核苷酸，其可以通過聚合酶 以模板依賴性/引導性方式結合在多核苷酸的3'末端。在一些實施方案中，
6所述可逆終止子核苷酸通常包含在糖部分的3'-位置的羥基，在糖部分的 2'-位置的封閉基團，和附著到鹼基上的標記。當結合可逆終止子核苷酸時， 封閉基團使得所述多核苷酸不能通過聚合酶延伸。在一些實施方案中，所 結合的可逆終止子還通常是針對3'-5'核酸外切酶或聚合酶的"校正活性" 抗性的。
3.2定義
當用於本文時，下述術語意欲具有下述意義 "核苷"是指由嘌呤、脫氮嘌呤或嘧啶核苷鹼基例如腺嘌呤、鳥嘌呤、
胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤組成的化合物，
所述核苷鹼基在r位置與戊糖糖的異頭碳連接，所述戊糖如核糖、2'-脫氧
核糖或2',3'-二-脫氧核糖。當核苷鹼基是嘌呤或7-脫氮嘌呤時，戊糖在嘌 呤或脫氮嘌呤的9-位置附著，並且當核苷鹼基是嘧啶時，戊糖在嘧啶的1-位置附著(參見，例如，Komberg和Baker, DNA複製(DA^4 i 印/z'caf/o"), 第2版.(Freeman 1992))。當用於本文時，術語"核苷酸"是指核苷的磷 酸酯，例如，單-、二-或三磷酸酯，其中最常見的酯化位點是附著到戊糖 的C-5位置的羥基基團。"核苷酸5'-三磷酸酯"是指在5'位置具有三磷酸 酯基團的核苷酸。當用於本文時，術語"核苷/核苷酸"是指一組包括核苷 和/或核苷酸二者的化合物。
"核鹼基(nucleobase)聚合物或寡聚物"是指通過連接(linkage)相連 的兩個或多個核鹼基，所述連接允許得到的核鹼基聚合物或寡聚物與具有 互補核鹼基序列的多核苷酸雜交。核鹼基聚合物或寡聚物包括，但不限於， 多核苷酸和寡核苷酸(例如，DNA和RNA聚合物和寡聚物)，多核苷酸 和寡核苷酸類似物以及多核苷酸和寡核苷酸模擬物，諸如聚醯胺或肽核 酸。核鹼基聚合物或寡聚物在大小上可以從幾個核鹼基，2-40個核鹼基到 幾百個核鹼基，到數千個核鹼基或更多而變化。
"多核苷酸或寡核苷酸"是指核鹼基聚合物或寡聚物，其中核鹼基通 過糖磷酸酯連接(糖-磷酸酯骨架)連接。示例性的多核苷酸和寡核苷酸包 括2'-脫氧核糖核苷酸的聚合物(DNA)和核糖核苷酸的聚合物(RNA)。多核 苷酸可以完全由核糖核苷酸組成，完全由2'-脫氧核糖核苷酸組成或它們的 組合組成。
7在一些實施方案中，核鹼基聚合物是多核苷酸類似物或寡核苷酸類似 物。"多核苷酸類似物或寡核苷酸類似物"意指核鹼基聚合物或寡聚物， 其中核鹼基由包含一個或多個糖磷酸酯類似物的糖磷酸酯骨架連接。典型 的糖磷酸酯類似物包括，但不限於，糖烷基磷酸酯，糖亞磷醯胺，糖垸基 -或取代的烷基磷酸三酯，糖硫代磷酸酯，糖二硫代磷酸酯，糖磷酸酯和糖 磷酸酯類似物，其中所述糖不是2'-脫氧核糖或核糖，核鹼基聚合物具有帶
正電荷的糖-胍基互連，諸如在美國專利號6，013，785和美國專利號 5，696，253中描述的那些(還參見，Dagani, 1995,化學和工程新聞(CTzem. cS:五"g. A^vw)4-5:1153; Dempey等，1995,美國化學學會雜誌(J. C/zem.
117:6140-6141)。其中糖是2'-脫氧核糖的這樣的帶正電荷的類似物 稱為"DNGs"，而其中糖是核糖的那些稱為"RNGs"。在多核苷酸和寡核苷 酸類似物的定義中特別包含的是鎖定核酸(LNAs;參見，例如，Elayadi等, 2002,生物化學(所oc/2emWo^) 41 :9973-9981; Koshkin等，1998,美國化學 學會雜誌(J爿m. C/7em.Soc.) 120:13252-3; Koshkin等，1998,四面體通訊 (r"ra/2Wran, 39:4381-4384; Jumar等,1998，生物有機和醫學化 學通i刊(傷oorgam'c <fe Afeiz'c/""/ CTzem^^j8:2219-2222; Singh禾口 Wengel， 1998,化學通訊(Chem. Commun.) , 12:1247- 1248; WO 00/56746; WO 02/28875;和，WO 01/48190)。
在一些實施方案中，核鹼基聚合物是多核苷酸模擬物或寡核苷酸模擬 物。"多核苷酸模擬物或寡核苷酸模擬物"是指這樣的核鹼基聚合物或寡 聚物，其中一個或多個骨架糖-磷酸酯連接用糖-磷酸酯類似物替代。這樣 的模擬物能夠與互補多核苷酸或寡核苷酸、或多核苷酸或寡核苷酸類似物 或者與其他多核苷酸或寡核苷酸模擬物雜交，並且可以包括包含一個或多 個下述連接的骨架具有烷基胺側鏈的帶正電荷的聚醯胺骨架，如在美國 專利號5786461, 5766855, 5719262， 5539082和WO 98/03542中所述(還 參見，Haaima等，1996,爿"gevra"&e Ctem/e/"f7五d.英文版35:1939-1942; Lesnick等,1997,核苷酸(Nucleotid.) 16:1775-1779; D'Costa等,1999,有 機通訊(Org. Lett.) 1 :1513-1516; Nielsen, 1999,現代生物技術觀點(Curr. Opin.Biotechnol.) 10:71-75);不帶電荷的聚醯胺骨架，如在WO 92/20702 和美國專利號5539082中所述；不帶電荷的嗎啉代-氨基磷酸酯骨架，如在美國專利號5698685, 5470974, 5378841,和5185144中所述(還參見， Wages等，1997，生物技術(說b7fec/zw一^) 23:1116-1121);基於肽的核酸 模擬物骨架(參見，例如，美國專利號5,698,685);氨基甲酸酯骨架(參見， 例如，Stirchak和Summerton, 1987,有機化學雜誌(J Og. C72e附.)52:4202); 醯胺骨架(參見，例如，Lebreton, 1994, Synlett. 1994年2月137);甲基羥 胺骨架(參見，例如，Vasseur等，1992,美國化學學會雜誌(J. Am. Chem. Soc.) 114:4006); 3'-thioformacetal骨架(參見，例如，Jones等，1993,有機 化學雜誌(丄Org, Chem.) 58:2983)和氨基磺酸酯骨架(參見，例如，美國 專利號5,470,967)。所有前述參考文獻都通過引用結合於此。
"肽核酸"或"PNA"是指多核苷酸或寡核苷酸模擬物，其中核鹼基通過 氨基連接(不帶電荷的聚醯胺骨架)相連，諸如在下述一個或多個美國專 利號中所述美國專利號5539082， 5527675， 5623049, 5714331， 5718262， 5736336, 5773571,5766855， 5786461, 5837459， 5891625， 5972610, 5986053, 6107470, 6451968, 6441130， 6414112和6403763;所述這些通過引用結合 於此。術語"肽核酸"或"PNA"還應該應用於任何寡聚物或聚合物，其包
含在下述出版物中描述的那些多核苷酸模擬物的兩個或多個亞基
Lagriffoul等，1994，生物有機和醫學化學通訊(所oorgam'c & MeAdwa/ C7zemW^丄e股ra), 4:1081-1082; Petersen等，1996,生物有機和醫學化學通 ifl (S/owgam.c C7zew^/>7 Ze/fe^y ) ， 6:793-796; Diderichsen等，
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PNAs的一些實例是其中核鹼基附著在N-(2-氨基乙基)-甘氨酸骨架上 的那些，即，肽樣的、醯胺-連接的單位(參見，例如，美國專利號5719262; Buchardt等，1992, WO 92/20702; Nielsen等，1991,科學(5We膨) 254:1497-1500)。
在一些實施方案中，核鹼基聚合物是嵌合寡核苷酸。"嵌合寡核苷酸" 意指這樣的核鹼基聚合物或寡聚物，其包含多種不同的多核苷酸、多核苷 酸類似物和多核苷酸模擬物。例如，嵌合寡聚物可以包括與RNA序列連 接的DNA序列。其他嵌合寡核苷酸的實例包括與PNA序列連接的DNA 序列，和與PNA序列連接的RNA序列。
在一些實施方案中，核鹼基聚合物是嵌合寡核苷酸。"嵌合寡核苷酸" 意指包含多種不同的多核苷酸、多核苷酸類似物和多核苷酸模擬物的核鹼 基聚合物或寡聚物。例如，嵌合寡聚物可以包含與RNA序列連接的DNA 序列。嵌合寡核苷酸的其他實例包括與PNA序列連接的DNA序列和與 PNA序列連接的RNA序列。
在一些實施方案中，所公開方法的不同成分，包括但不限於引物、可 逆終止子核苷酸、和其他反應區室(reaction compartment),可以包括可檢 測部分。 "可檢測部分"，"檢測部分"或"標記"是指使得其所附著的分 子是可利用已知的檢測系統(例如，分光鏡的、放射性的、酶的、化學的、 光化學的、生物化學的、免疫化學的、色譜的、物理的(例如沉積、離心、 密度)、電泳的、重量分析的或磁性系統)檢測或鑑定的部分。標記的非 限制性實例包括量子點(quantum dot)、同位素標記(例如，放射性的或重 同位素)、磁性標記；旋轉標記、電標記；熱標記；有色標記(例如，發 色團)、發光標記(例如，螢光劑、化學發光劑)、酶標記(例如，辣根過 氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、(3-半乳糖苷酶)(Ichiki,等，1993,免疫學雜誌U/mm畫/.) 150(12):5408-5417; Nolan,等，1988,美國國家科學 院學報(屍rac. AW/Jew. >SW. f/W) 85(8):2603-2607)),抗體標記，和化學 修飾的標記。另外，在一些實施方案中，這樣的標記包括配體-結合配偶體 對的成分(例如，抗原-抗體(包括單鏈抗體和抗體片段，例如，FAb, F(ab)，2, Fab'， Fv，等)(基礎免疫學(JFww/awe"to//mm頭o/og>047-105 (William E. Paul 編，第5版，Lippincott Williams &Wilkins 2003))，激素-受體結合，神經遞 質-受體結合，聚合酶-啟動子結合，底物-酶結合，抑制劑-酶結合(例如， 硫氰酸胺(sulforhodamine )-纈氨醯-丙氨醯-天冬氨醯-氟甲基酮 (SR-VAD-FMK-胱天蛋白酶結合)，變構劑-酶結合，生物素-鏈黴抗生物素 蛋白結合，地高辛-抗地高辛結合，碳水化合物-凝集素結合，膜聯蛋白V-磷脂醯絲氨酸結合(Andree等，1990,生物的化學雜誌( /說o/. C/7e肌) 265(9):4923-8; van Heerde等，1995， T7zram6. 73(2):172-9; Tait等，
1989,生物的化學雜誌a說'o/. C/zem.) 264(14):7944匿9),核酸退火或雜交， 或貢獻或接受電子對與配位複合物的中央金屬原子形成配位共價鍵的分 子。在各種示例性實施方案中，結合配體的解離常數可以小於約io—4-io-6 M-1，小於約l(T5-10-9M-i，或小於約10:10力M-'o
"螢光標記"、"螢光部分"和"螢光團"是指可以通過其內在的螢光 性質檢測的分子。適當的螢光標記的實例包括，但不限於，螢光素，羅丹 明，四甲基羅丹明，伊紅，藻紅，香豆素，甲基-香豆素，芘，孔雀綠，1,2-二苯乙烯，螢光黃，Cascade藍，德克薩斯紅，IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640，藻紅蛋白，LC Red 705， Oregon綠，Alexa- Fluor染料 (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488， Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade藍，Cascade黃和R-藻紅蛋白(PE), FITC，羅丹明，德克薩斯 紅(Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)，Cy5, Cy5.5, Cy7 (安瑪西亞生命科學 (Amersham Life Science), Pittsburgh, PA)和串聯綴合物，諸如但不限於, Cy5PE, Cy5.5PE，Cy7PE, Cy5.5APC，Cy 7 APC。在一些實施方案中，適當 的螢光標記還包括，但不限於，綠色螢光蛋白(GFP; Chalfie,等，1994，科 學(5We"ce) 263(5148):802-805), EGFP (克隆技術實驗室公司(Clontech Laboratories Inc),帕洛阿爾託，加利福尼亞州)，藍色螢光蛋白(BFP;量子
ii生物技術公司(Quantum Biotechnologies, Inc.)蒙特婁，加拿大；Heim等， 1996,現代生物學(Cwr.說o/.) 6:178-182; Stauber, 1998，生物技術
(歷ofec/zm々M^) 24(3):462-471;),增強的黃色螢光蛋白(EYFP;克隆技術 實驗室公司(Clontech Laboratories Inc)，帕洛阿爾託，加利福尼亞州)，和 renilla(WO 92/15673; WO 95/07463; WO 98/14605; WO 98/26277; WO 99/49019;美國專利號5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079， 5804387， 5874304, 5876995,和5925558)。螢光標記的其它實例在Haugland, 螢光探豐十禾口石開究手冊(Z/flW^ooA: 0/F/"0msce"f屍ro6^s "/WW&sefln^),第 9版，分子探針公司(Molecule Probes, Inc. ) Eugene, OR (ISBN 0-971063 6-0-5)中找到。
在本文中，"微粒"、"微球體"、"微珠"、"珠子"和語法等價物意指 小的分散的合成顆粒。如本領域已知的，珠子的組合物可以取決於使用它 們的測定的類型而不同，因此，選擇微珠組合物是在操作者的能力範圍之 內的。適當的珠子組合物包括在肽、核酸和有機合成中使用的那些，其包 括但不限於，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、 順磁性材料(美國專利號4358388, 4654267, 4774265， 5320944, 5356713)， 氧化釷溶膠，碳石墨，二氧化鈦，乳膠或交聯的葡聚糖諸如瓊脂糖
(Sepharose)，瓊脂糖(agarose),纖維氣羧甲基纖維素，羥乙基纖維素, 蛋白質樣聚合物，尼龍，球蛋白，DNA,交聯的膠束和特氟隆(Tefkm)都是 可以使用的(參見，例如，Bangs實驗室的微球檢測指導(M'cra^/zew Defecft'cw Gw/tfe j^ow 5a"gs丄a60n^on.es) , Fishers, IN)， 珠子還可以從， 例如，Bio-Rad實驗室(Bio-Rad Laboratories)(里奇蒙，加利福尼亞)，LKB (瑞典)，法瑪西亞(Pharmacia)(皮斯卡塔韋，新澤西州)，IBF (法國),Dynal 公司(Great Neck,紐約)商購獲得。在一些實施方案中，珠子可以包含交 聯劑，諸如但不限於，聯乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯，三羥甲基丙烷 三甲基丙烯酸酯，N,N'亞甲基-二-丙烯醯胺，已二酸，癸二酸，琥珀酸，檸 檬酸，1,2,3,4-丁烷四羧酸，或I,IO癸烷二羧酸或本領域已知的其它功能等 價的試劑。在許多示例性實施方案中，珠子可以是球體的、非球體的、卵 形的、不規則形狀的等。微粒的平均直徑可以由操作者的判斷力選擇。然 而，通常微粒的平均直徑可以在納米(例如，約100 nm)-毫米(例如，約1 mm)範圍內，其中優選約0.2 pm-約200 pm的珠子，特別優選約0.5-約10pm的珠子，儘管在一些實施方案中，可以使用更小或更大的珠子， 如下文所述。
在一些實施方案中，微粒可以是多孔的，由此增加可用於另一種分子、 部分或化合物(例如，引物)附著的表面積。因此，微粒可以具有另外的 表面官能團，以促進附著和/或結合。這些基團可以包括羧酸酯、酯，醇、 尿素、醛、胺、氧化硫、氧化氮或滷化物。將另一種分子或部分附著到珠 子上的方法是本領域已知的(參見，例如，美國專利號.6268222， 6649414)。 在一些實施方案中，微粒可以進一步包含標記。
"延長的多核苷酸"是指在其上已經添加了或另外結合了 (例如，共 價結合)一個或多個額外的核苷酸的多核苷酸。
"模板多核苷酸"是指引物可以與之雜交並且延伸的多核苷酸。因此， 模板多核苷酸包括與引物至少部分互補的亞序列。模板多核苷酸可以基本 上來源於任何來源。為了舉例說明，模板核酸任選地來源於或分離自，例 如，培養的微生物、未培養的微生物、複合的生物混合物、組織、血清、 收集的血清或組織、多種類聚生體(consortia)、遠古的、化石的或其它無 生命的生物殘留物、環境分離物、土壤、地下水、廢物裝置、深海環境等。 此外，模板多核苷酸任選地包括或來源自，例如，單個的cDNA分子，克 隆的cDNAs組，cDNA文庫，提取的RNAs,天然RNAs,體外轉錄的RNAs: 表徵的或未表徵的基因組DNAs，克隆的基因組DNAs，基因組DNA文庫, 酶斷裂的DNAs或RNAs,化學斷裂的DNAs或RNAs，物理斷裂的DNAs 或RNAs,等。模板核酸還可以利用本領域公知的技術化學合成。另外，模 板核酸任選地與基因的至少一部分相對應或與其互補。當用於本文時，"基 因"是指與生物功能相關的DNA的任何片段。因此，基因包括編碼序列， 並且任選地包括它們的表達所需要的調控序列。基因還任選地包括不表達 的DNA片段，其例如，形成其它蛋白的識別序列。
當額外的核苷酸(或其它類似分子，例如，可逆終止子核苷酸)結合 到核酸上時，多核苷酸被"延伸"或"延長"。例如，多核苷酸任選地通 過核苷酸結合的聚合酶延伸，所述聚合酶典型地在多核苷酸的3'末端添加 核苷酸。
13"可延伸的多核苷酸"是指在其上可以添加或者共價鍵合至少一個其 它核苷酸的核苷酸，例如，在當所述可延伸的多核苷酸被結合時由聚合酶 催化的反應中。可延伸的多核苷酸典型地通過在糖部分的3 '-位置添加另 一個核苷酸而延伸。
"不可延伸的"核苷酸是指這樣的核苷酸，即，當結合到多核苷酸中 時，其至少基本上抑制所述多核苷酸的進一步延伸。
當用於本文時，"平行反應"是指包括適於同時進行多個反應的多個 分立區域的反應。事實上，可以平行分析任何數目的多核苷酸。例如，在 許多示例性實施方案中，可以通過所公開的方法平行分析數百、數千、幾 十萬、數百萬、和甚至更大數目的多核苷酸。在許多示例性實施方案中，
平行分析的多核苷酸的數目可以是至少2, 100, 500， 1000, 10000, 50000， 100000， 300000, 500000,或1000000,並且甚至更多。
"部分"或"基團"是指某種事物諸如分子可以分割的部分中的一種 (例如，官能團、取代基團等)。例如，核苷酸典型地包含鹼性基團(例 如，腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、或類似的鹼性基團)、 糖部分(例如，包含糖環或其類似物的部分)、和一個或多個磷酸基團。
"雜環"是指這樣的單環或雙環，其是飽和的、不飽和的、或芳香環，
並且其包含獨立選自下列各項的一個或多個雜原子氮、氧和硫。雜環可 以通過任何雜原子或碳原子附著到本發明的核苷酸的糖部分或其類似物
上。示例性的雜環包括嗎啉基，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl),吡咯烷基，哌 啶基，乙內醯脲基，戊內醯胺基，環氧乙垸基，氧雜環丁烷基，四氫呋喃基, 四氫吡喃基四氫吡啶基，四氫嘧啶基(tetrahydr叩rimidinyl),四氫苯硫 基，四氫吡喃基，四氫嘧啶基，四氫苯硫基，四氫吡喃基，呋喃基，苯並呋 喃基，苯硫基，苯並苯硫基，吡咯基，吲哚基，異吲哚基，氮雜吲哚基，吡 啶基，喹啉基，異喹啉基，噁唑基，異噁唑基，苯並噁唑基，吡唑基，咪唑 基，苯並咪唑基，噻唑基，苯並噻唑基，異噻唑基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪 基，三嗪基，噌啉基,2,3-二氮雜萘基，喹唑啉基等。
"碳環"是指飽和的或不飽和的(但不是芳香的)碳環，諸如環丙烷、 環丁烷、環戊烷、環己烷、環庚烷、環己烯等。
"烷基"是指直鏈的、支鏈的或環狀飽和的烴部分，並且包括所有的位置異構物，例如，甲基，乙基丙基，l-甲基乙基，丁基，l-甲基丙基，2-
甲基丙基，l,l-二甲基乙基，戊基l-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基， 2,2-二甲基丙基，1-乙基丙基己基，l,l-二甲基丙基，1,2-二甲基丙基，1-甲 基戊基2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，l，l-二甲基丁基，1,2-二甲基 丁基，1,3-二甲基丁基，2,2-二甲基丁基，2,3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1,1,2-三甲基丙基，1,2,2-三甲基丙基，1 -乙基-1-甲 基丙基和l-乙基-2-甲基丙基，正己基,環己基，正庚基，正辛基，2-乙基己 基，正壬基，正癸基等。烷基基團典型地包含約l-20個碳原子，並且更典 型地包含約2-15個碳原子。烷基基屈可以是取代的或未被取代的。
"烯基基團"是指直鏈的、支鏈的或環狀不飽和的烴部分，其包含一 個或多個碳-碳雙鍵。示例性的烯基基團包括乙烯基,2-丙烯基,2-丁烯基，3-丁烯基l-甲基-2-丙烯基，2-甲基-2-丙烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基， "甲基-2-丁烯基2-甲基-2-丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，l-甲基-3-丁烯基2-甲 基-3-丁烯基，3-甲基-3-丁烯基，1,1-二甲基-2-丙烯基，1,2-二甲基-2-丙烯基，
1- 乙基-2-丙烯基,2-己烯基，3-己烯基,4-己烯基，5-己烯基，l-甲基-2-戊烯基
2- 甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基l-甲基-3-戊烯基2-甲 基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，l-甲基-4-戊烯基，2-甲基 -4-戊烯基3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1,1-二甲基-2-丁烯基1,1-二 甲基-3-丁烯基，1,2-二甲基-2-丁烯基1,2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基,l,3-二甲基-3-丁烯基，2,2-二甲基-3-丁烯基2,3-二甲基-2-丁烯基， 2，3_二甲基_3_丁烯基3,3-二甲基-2-丁烯基l-乙基-2-丁烯基,l-乙基-3-丁烯 基，2-乙基-2-丁烯基,2-乙基-3-丁烯基,1, 1， 2-三甲基-2-丙烯基,l-乙基-l-甲基-2-丙烯基l-乙基-2-甲基-2-丙烯基，等。所有的烯基基團典型地包含 約l-20個碳原子，並且更典型地包含約2-15個碳原子。烯基基團可以是 取代的或未被取代的。
"炔基基團"是指直鏈的、支鏈的或環狀不飽和的烴部分，其包含一 個或多個碳-碳三鍵。代表性的炔基基團包括，例如，2-丙炔基,2-丁炔基,3-丁炔基，l-甲基-2-丙炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，l-甲基-2-丁炔基, 1_甲基-3-丁炔基,2-甲基-3-丁炔基，1,1-二甲基-2-丙炔基，l-乙基-2-丙炔基, 2-己炔基,3-己炔基,4-己炔基,5-己炔基，l-甲基-2-戊炔基，l-甲基-3-戊炔基b甲基—4-戊炔基2-甲基-3-戊炔基,2-甲基-4-戊炔基,3-甲基-4-戊炔基,4-甲 基-2-戊炔基，1, 1 -二甲基-2-丁炔基，1， l-二甲基-3 -丁炔基，1 ,2-二甲基-3 -丁炔基，2,2-二甲基-3-丁炔基3,3-二甲基-1-丁炔基1-乙基-2-丁炔基，1-乙 基-3-丁炔基,2-乙基-3-丁炔基l-乙基-l-甲基-2-丙炔基，等。炔基基團典型 地包含約l-20個碳原子，並且更典型地包含約2-15個碳原子。炔基基團 可以是取代的或未被取代的。
"烷氧基基團"是指包含氧原子的烷基基團，並且包括，例如，甲氧 基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基、庚氧基、辛氧基等。
"滷基團"是指包含滷素原子諸如F,Cl，Br，或I的基團。
"芳基基團"是指源自芳香化合物的原子或部分的取代基團。示例性 的芳基基團包括，例如，苯基基團、苄基基團，甲苯基基團，二甲苯基基 團，等。芳基基團任選地包括多個芳香環(例如，聯苯基基團等)。另外， 芳基基團可以是取代的或未被取代的。
"芳氧基基團"是指包含氧原子的芳基基團，並且包括，例如，苯氧 基、氯苯氧基、甲基苯氧基、甲氧基苯氧基、丁基苯氧基、戊基苯氧基、
苄氧基等。
"烷基-芳基基團"是指包含烷基和芳基部分的基團。
"醚基團"是指包含附著到單個氧原子上的兩個碳原子的直鏈的、支
鏈的或環狀的部分。示例性的醚基團包括，例如，甲氧基甲基，甲氧基乙
基，甲氧基丙基，乙氧基乙基，等。
"硫醚基團"是指包含附著到單個硫原子上的兩個碳原子的直鏈，支
鏈或環狀的部分，並且包括，例如，甲硫基甲基，甲硫基乙基，甲硫基丙
基，等。
"垸基胺基團"是指包含至少一個烷基基團的氨基基團。 "烯基胺基團"是指包含至少一個烯基基團的氨基基團。 "炔基胺基團"是指包含至少一個炔基基團的氨基基團。 "酯基團"是指一類包括通式RCOOR'的有機化合物，其中R和R'
獨立地選自烷基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、或它們的組合。 "聚胺基酸"是指包含兩個或多個胺基酸殘基的化合物或組。示例性
的聚胺基酸包括肽、多肽、蛋白等。"醛基團"是指包含式CHO的有機基團。
"醇基團"是指包含至少一個羥基基團的有機基團。
"甲矽烷基基團"是指一類包含通式SiRR'R"的化合物，其中R, R'，和 R"獨立地是H、垸基基團、烯基基團、炔基基團、芳基基團、或這樣的基 團的組合。
"磷酸酯類似物"是指可以由磷酸酶諸如鹼性磷酸酶裂解的部分。
多核苷酸的"序列"是指核酸中的核苷酸的順序和身份(identity)。序 列典型地以5'到3'方向讀取。
"附著的"是指包括但不限於下述各項的相互作用共價結合、離子 結合、化學吸附、物理吸附和它們的組合。
"接頭"或"間隔臂(spacer)"是指將化合物或取代基團共價或非共 價(例如，離子地等)附著到例如固體支持物、另一種化合物或基團等上 的化學部分。例如，接頭任選地將標記(例如，螢光染料、放射性同位素 等)附著到2'-終止子核苷酸等上。接頭典型地是雙官能化學部分，並且在 某些實施方案中，它們包括可裂解的附著，其可以通過例如，熱、酶、化 學試劑、電磁輻射等裂解，以從例如固體支持物、另一種化合物等上釋放 物質或化合物。接頭的認真選擇允許裂解在與化合物的穩定性和測定方法 相容的適當條件下進行。通常，接頭沒有特別的生物活性，除了例如將化 學種類連接在一起或在這樣的種類之間保持某些最小距離或其它空間關 系之外。然而，可以選擇接頭的成分，以影響連接的化學種類的一些性質， 諸如三維構象、淨電荷、疏水性等。接頭分子的其它描述提供在，例如， Lyttle等(1996)核酸研究(A^c/e/c A^s ) 24(14):2793, Shchepino等 (2001)核苷，核苷酸和核酸(Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids) 20:369, Doronina等(2001)核苷，核苷酸和核酸(Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids )20:1007， Trawick等(2001)生物綴合物化學(Bioconjugate Chem.) 12:900, Olejnik等(1998)酶學方法(Methods in Enzymology) 291 :135, Pljevaljcic等(2003)美國化學學會雜誌( / ^m. CAem. Soc.) 125(12):3486, Ward,等，美國專利號4,711,955， Stavri訓poulos,美國專利 號4,707,352,和Stavrianopoulos，美國專利號4,707,440中，其分別通過引 用結合。
17"修飾的"酶是指包含這樣的序列的酶，在所述序列中，至少一個氨 基酸與參照序列諸如天然的或野生型的酶或酶的另一種修飾形式不同，例 如，當兩個序列關於最大相同性進行比對時。示例性的修飾包括單體插入、 刪除和取代。修飾的酶(例如，聚合酶)可以通過各種生成方法產生。盡 管基本上可以使用任何方法來產生修飾的酶，但是某些代表性的技術包括重組(例如，通過循環重組、合成重組等)編碼一個或多個母體酶的兩個 或更多個核酸，或者通過突變編碼酶的一個或多個核酸，例如，使用循環集團誘變(recursive ensemble mutagenesis),盒誘變，隨機誘變，體內誘變， 位點定向誘變等進行突變。編碼母體酶的核酸典型地包括這樣的基因，艮P， 通過轉錄和翻譯機制，其產生與母體酶例如酶的天然形式相對應的胺基酸 序列。修飾的酶還包括嵌合酶，其具有源自兩個或更多個母體的可以鑑定 的組成序列(例如，結構和/或功能性結構域等)。在修飾的酶的定義中還 包括相對於參照序列包含化學修飾(例如，附著的取代基、改變的取代基 等)的那些。"固體支持物"是指可以衍生具有或另外附著化學部分諸如多核苷酸 等的固體材料。示例性的固體支持物包括平板，珠子，微珠，纖維，須晶， 梳狀晶簇(comb),雜交晶片，膜，單晶，陶瓷層，載玻片，自我組裝的單層等。"裂解"是指從另一種物質或化合物或部分釋放物質或化合物或部分 的過程。3.3詳述應該理解，包括附圖的前述概述和以下的詳述二者都只是示例性的和 解釋性的，並且不限制這一公開內容。在這一公開內容中，單數的使用包括複數，除非另外特別闡明。此外，"或"的使用意指"和/或"，除非另外 指明。類似地，"包含"("comprise," "comprises," "comprising")，包括 ("include," "includes,"禾口"including")不意欲是限制性的。本文公開的是對多核苷酸進行測序包括單分子測序的組合物和方法。 本發明公開的組合物包括可逆終止子核苷酸，其可以通過聚合酶以模板依 賴性/指導性方式結合在多核苷酸的3'末端。在一些實施方案中，所述可逆終止子核苷酸通常包含在糖部分3'-位置的羥基基團，在糖部分2'-位置的 封閉基團，和附著到鹼基上的標記。當結合可逆終止子核苷酸時，所述封 閉基團使得所述多核苷酸不能通過聚合酶延伸。在一些實施方案中，所結 合的可逆終止子還通常是對3'-5'核酸外切酶或聚合酶的"校正活性"有抗性的。在結合之後，可以檢測可逆終止子核苷酸的標記，以鑑定終止子核苷 酸的鹼基，並且因此鑑定模板多核苷酸的對應的鹼基。為了允許下一輪的 延伸，可以將所述多核苷酸在去除封閉基團和標記的條件下用一種或多種 試劑處理。因此，封閉基團和標記可以在相同條件下去除。當去除標記和封閉基團後，所述多核苷酸的3'末端可以以模板依賴性方式進一步延伸。示例性可逆終止子核苷酸的結構如式I所示其中R,代表H,OH,親水基團或疏水基團；B代表核鹼基，其包含至少一個碳環、至少一個雜環(具有或不具有 環外的雜原子)、或至少一個芳基基團、或它們的組合； BG代表可逆的封閉基團； Z代表0,CH2，或S;二代表單鍵或雙鍵。在一些實施方案中，可逆終止子核苷酸可以包括附著在5'位置的至少 1, 2,或3個磷酸酯基團和/或磷酸酯類似物。在一些實施方案中，可逆終 止子核苷酸包括標記。在一些實施方案中，R和BG可以分別在2'和3'位置。式I的B基團的非限制性實例包括腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧 啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假 異胞嘧啶、2-硫代尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)，N9-(2,6-二氨基嘌呤)，次黃嘌呤，N9-(7-脫氮-鳥嘌呤)，N9-(7-脫氮 -8-氮雜-鳥嘌呤)，N8-(7-脫氮-8-氮雜-腺嘌呤)，異C和異G。適當的B基團的其它非限制性實例包括在下列各項中公開的核鹼基美國專利號 5432272, 6001983, 6037120, 61040496, 6357163, 6617106, 6977161;美國專 利公布號 20040106108, 20050037398， 20060078936; EP1358352, EP1590482;和WO9220702, WO9220703, WO0233126和WO04065550。 因此，熟練的技術人員應該理解，式I的B基團可以是任何天然存在的或 合成的核鹼基，其適合以序列-特異性方式與多核苷酸雜交。封閉基團(BG)可以是適於基本上抑制多核苷酸延伸的任何部分，其包 含式I的3'可逆終止子核苷酸。BG抑制延伸的機制可以是通過各種方法， 包括但不限於，電荷(例如，正電荷或負電荷)或立體化學抑制。在一些 實施方案中，BG可以任選地使得多核苷酸基本上抗3'-5'核酸外切酶和/或 聚合酶的"校正活性"。除了基本上抑制延伸，式I的BG是可逆的。在本 文中，"可逆"意指BG基本上可以被去除，以產生適合以模板指導方式 進行引物延伸的3'末端。BG的去除可以使用各種方法和試劑實現，包括 但不限於，酶，諸如鹼性磷酸酶。在一些實施方案中，BG可以是S03。在一些實施方案中，BG可以是C(0)R9，其中R9表示H,烷基基團，苄 基基團,芳基基團,烯基基團，炔基基團，或它們的組合。 在一些實施方案中，BG可以包含式II:formula see original document page 20(II)射當X代表0, S， NR3， CR3R4,或SiR3R4時；Y代表CR5R6R7, SiR5R6R7, 0R5, SR5,或NHR5;R2代表H, OH，NHR8，SR8,烷基基團，節基基團，芳基基團,烯基基團, 炔基基團，垸氧基基團，或它們的組合；和R3， R4, R5, R7,和Rs獨立選自H,垸基基團，苄基基團，芳基基團, 烯基基團，炔基基團，或它們的組合。在一些實施方案中，BG可以包含式III:oR:;III射X代表CR3R4R5, SiR3R4R5， OR3, SR3,或NHR3;R2代表H， NHR6, SR6,烷基基團，苄基基團，芳基基團,烯基基團，炔 基基團，烷氧基基團，或它們的組合；和R3,R4,R5,和R6獨立地選自H,烷基基團，苄基基團，芳基基團,烯基 基團，炔基基團，或它們的組合。在一些實施方案中，BG可以是磷酸酯(-P04)。在一些實施方案中，BG可以是S03。在一些實施方案中，BG可以是C(O)R。合成BG基團和它們的等價物的方法是本領域已知的。本發明公開的可逆終止子任選地包含至少一個標記。在一些實施方案 中，標記可以附加在可逆終止子的核鹼基(B)上，例如，在碳環、雜環或芳 基基團上(例如，通過嘧啶的C-5，胞苷的N-4，嘌呤的N-7，腺苷的N-6， 嘌呤的C-8，或本領域內的另一個附著位點)。在一些實施方案中，標記可 以通過醯胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳、或其它類型的共價鍵附著。在 一些實施方案中，標記可以附著到可逆終止子核苷酸的糖部分(例如，核 糖)或其類似物上。在一些實施方案中，標記可以附著到BG上，諸如， 式II和III的BG或磷酸上，諸如，通過醯胺、酯、硫酯、醚、硫醚、碳-碳或其它的鍵附著。在一些實施方案中，標記可以通過本文所述的接頭附 加到可逆終止子核苷酸上。在許多示例性實施方案中，標記包括螢光染料(例如，羅丹明染料(例 如，R6G, R110, TAMRA, ROX,等),螢光素染料(例如，JOE, VIC, TET,HEX， FAM，等)，滷代螢光素染料，花青染料(例如，CY3, CY3.5, CY5, CY5.5，等)，BODIPY⑧染料(例如，FL, 530/550, TR， TMR,等)，ALEXA FLUOR⑧染料(例如，488, 532， 546， 568, 594， 555, 653, 647, 660， 680,等)， 二氯羅丹明染料，能量轉移染料(例如，BIGDYETMv 1染料，BIGDYE v 2染料,BIGDYE v 3染料，等)，螢光染料(例如，螢光黃，等)，CASCADE BLUE , Oregon綠，等。其它示例性染料提供在Haugland,螢光探針和研 究產物的分子探針手冊(Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products),第9版.(2003)和其更新材料中。螢光染料通常易 於從各種商業供應商獲得，其包括，例如，分子探針公司(Molecular Probes, Inc.) (Eugene, OR),安瑪西亞生物科學公司(Amersham Biosciences Corp.) (皮斯卡塔韋,新澤西州),Applera公司/應用生物系統部(Applied Biosystems Group)(福斯特城，加利福尼亞州)。其它示例性的標記包括，例如，生物 素，弱螢光標記(Yin等.(2003)應用環境微生物學(Appl Environ Microbiol.) 69(7):3938; Babendure等.(2003)分析生物化學(Anal. Biochem.) 317(1):1;和Jankowiak等.(2003)毒性化學研究(Chem Res Toxicol.) 16(3):304),非螢光標記，比色標記，化學發光標記(Wilson等. (2003) Analyst. 128(5):480; Roda等.(2003)發光(Luminescence) 18(2):72), 拉曼標記，電化學標記，生物發光標記(Kitayama等.(2003)光化學和光生 物學(PhotochemPhotobiol.) 77(3):333; Arakawa等.(2003)分析生物化學 (Anal. Biochem.)314(2):206;和Maeda(2003)藥物生物醫學分析雜誌U 屍/zamt所omed爿"a/.) 30(6): 1725),和a-甲基-PEG標記試齊U，如在，例如, 於2002年11月22日提交的美國臨時專利申請號60/428,484中所述。在一些實施方案中，標記包括放射性同位素，諸如3H, 14C,22Na， 32P,33P， 35S, 42K， 35Ca, 59Fe, 1251,2G3Hg，等。在一些實施方案中，標記可以包括至少 一個質量-修飾基團，其包括但不限於，氘，F， Cl， Br, I， S, N3， XY, CH3, SP04, BH3, SiY3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3, (CH2)nCH3， (CH2)nNY2, CH2CONY2, (CH2)nOH, CH2F， CHF2, CF3,和硫代磷酸酯基團， 其中X是O， NH, NY, S, NHC(S)， OCO(CH)nCOO， NHCO(CH2)nCOO, OS0220, OCO(CH2)n, NHC(S)NH, OCO(CH2)nS, OCO(CH2)S, NC4402H2S, OPO(O-烷基)，或OP(O-烷基)；其中n是1-20閉區間內的整數；並且，Y是H，氘，垸基基團，烷氧基基團、芳基基團、聚氧基亞甲基基團，單烷 基化聚氧基亞甲基基團，聚乙烯亞胺基團，聚醯胺基團，聚酯基團，烷基 化的甲矽烷基基團，雜寡聚物，聚胺基酸，雜寡聚物/聚胺基酸基團，或聚 乙二醇基團。可以使用許多接頭，以任選地將標記和BG連接到可逆終止子核苷酸 上，並且這對於本領域技術人員是顯而易見的。接頭通常是在空間和電子 學上適於結合到多核苷酸中的結構。在一些實施方案中，接頭可以包括醚， 硫醚，甲醯胺，磺胺，尿素，氨基甲酸酯，肼，或其它部分。在一些實施方案中，接頭可以包括約l-約25個選自例如C，N,0,P,Si，S,等的非氫原 子，並且基本上包括示例性基團的任何組合，諸如醚、硫醚、胺、酯、甲 醯胺、磺胺、醯肼鍵、芳香或雜芳香鍵。在一些實施方案中，接頭包括單 碳-碳鍵和甲醯胺或硫醚鍵的組合。在一些實施方案中，可以使用接頭的更 長的線性片段，最長的線性片段典型地包含約3-約15個非氫原子，其包 括一個或多個雜原子。接頭部分的非限制性實例包括取代的(例如，官能化的)或未被取代 的基團，諸如咪唑/生物素接頭，聚亞甲基基團，亞芳基基團，烷基亞芳基 基團，亞芳基垸基基團，芳硫基基團，醯氨基烷基基團，炔基烷基基團， 烯基烷基基團，烷基基團，烷氧基基團，硫基，氨基烷基基團，嗎啉衍生 的磷酸酯，肽核酸(例如,N-(2-氨基乙基)甘氨酸，等)，等。(參見，例如，美 國專利號.4711958, 5047519, 5175269, 5328824, 6339392;和美國專利公布 號20020151711。標記和接頭的其它實例提供在Hermanson，生物綴合物技 術(Bioconjugate Techniques) , Elsevier Science (1996)中。在一些實施方案中，適當的接頭包括可以光致斷裂的部分，諸如2-硝基苄基部分，a-取代的2-硝基苄基部分(例如，l-(2-硝基苯基)乙基部分), 3,5-二甲氧基苄基部分，硫代異羥肟酸，7-硝基二氫吲哚部分，9-苯基咕噸 基部分，苯偶姻部分，羥基苯甲醯甲基部分,NHS-ASA部分,等。示例性的 可光致斷裂的接頭在美國專利公布號20030099972中描述。在一些實施方 案中，接頭包括金屬，諸如鉑原子,(參見，例如，美國專利號5714327)。 許多不同長度的接頭可從許多供應商處商購獲得，其包括，例如，Qiagen/ 操縱子技術公司(Qiagen/Operon Technologies, Inc.) (Alameda, CA), BD生物科學BD克隆技術公司(BD Biosciences Clontech)(帕洛阿爾託，加利 福尼亞)，和分子生物科學(Molecular Biosciences)(玻爾得，科羅拉多州)。 在一些實施方案中，適當的接頭可以是可斷裂的接頭。當用於本文時， "可斷裂的接頭"是指能夠在電子級聯自我消除反應中斷裂的接頭。在許多 示例性實施方案中，接頭的斷裂可以導致從本發明公開的可逆終止子核苷 酸上去除標記和/或BG。可斷裂接頭的實例在美國專利公布號 20060003383中公開。
在一些實施方案中，可斷裂接頭包含接頭部分和引發部分。所述接頭 部分，所述引發部分，和任選的標記和/或BG可以以允許它們發揮它們各 自的功能的任何方式連接到接頭部分上。引發部分包括可以通過專門的引 發劑斷裂或"激活"的底物。引發部分的激活引發自發的重排，其導致接 頭的斷裂和標記和/或BG的釋放。在一些實施方案中，標記和/或BG從可 逆終止子核苷酸的釋放可以由環閉合機制引起。在一些實施方案中，接頭 通過消除反應斷裂。各種消除反應，包括但不限於，1,4-, 1,6-和1,8-消除 反應已經用於設計前藥，並且可以適用於本發明所述的組合物和方法中, (參見，例如，WO02083180, Gopin等.Angew Chem intEd. 32:327-332 (2003), Niculescu-Duvaz等.醫學化學雜誌aMWC7z亂)41 :5297-5309 (1998), Florent等.醫學化學雜誌( / MW CTze附.)41:3572-3581 (1998), Niculescu-Duvaz等.醫學化學雜誌MW CA綴)42:2485-2489 (1999), Greenwald等.醫學化學雜誌aA/WC7^m.) 42:3657-3667 (1999), de Groot 等.生物有機醫學化學通信(所owgMWC77ew丄故).12:2371-2376(2002), Ghosh等.四面體通訊(Tetrahedron Letters) 41 :4871-4874 (2000), Dubowchik等.生物綴合物化學(Bioconjugate Chem.) 13:855-869 (2002), Michel等.Atta-ur-Rahman (編)21 :157-180 (2000), Dinaut等.化學通訊 (ChemCommun.) 1386-1387 (2001), Ohwada等.生物有機醫學化學通訊 (說00rgMWC/7em丄e".) 12:2775-2780(2002), de Groot等.有機化學雜誌 QOg C7z纖.)66:8815-8830 (2001), Leu等.醫學化學雜誌a她d C7z亂) 42:3623-3628 (1999), Sauerbrei等.Angew Chem Int Ed. 37:1143-1146 (1998) Veinberg等.生物有機醫學化學通訊C&m丄欲.)14:1007-1010 (2004), Greenwald等.生物綴合物化學(Bioconjugate Chem.) 14:395-403(2003),和Lee等.Angew Chem Int Ed.. 43:1675-1678 (2004)。
可以使用激活引發部分的任何方式，條件是用於激活引發部分的方式 能夠產生可檢測的變化，諸如，螢光的減少和/或去除BG和/或引物延伸。 激活的具體方式，並且因此引發部分的選擇可以部分取決於具體的斷裂反 應，以及其它因素。
在一些實施方案中，激活基於引發部分的斷裂。在這些實施方案中， 所述引發部分包括通過化學試劑或裂解酶裂解的裂解位點。在非限制性示 例性實施方案中，引發部分可以包括通過硫酸酯酶裂解的裂解位點(例如,
S03及其類似物)，酯酶(例如，C(0)R9及其類似物)，或磷酸酶(例如，P04及
其類似物(Parent等.現代遺傳和發育學觀點(CM"e" (9/ /m'o" c& Deve/opweW) 1997;7(3):386-391; Ellis等.應用和環境微生物學(々 p//W & ￡"v/ra"me"to/ Mfcra6zb/ogy) 2002;68(1):31-36; Bogaerts等.環境毒性和化 學 (￡>7"Wrawmewto/ 7bx/co/ogy c& C7zew&^y ) 1998; 17(8): 1600-1605; Choudhury.組織化學和細胞化學雜誌(Journal of Histochemistry and Cytochemistry) 1972;20(7):507-517)。作為特別的實例，引發部分可以包括 通過磷酸酶如鹼性磷酸酶裂解的裂解位點。
引發部分還可以包括促進裂解酶的特異性、親和性和/或動力學的其它 殘基和/或特徵。取決於具體的裂解酶的需要，這樣的裂解酶"識別部分" 可以包括裂解位點，或備選地，所述裂解位點可以在識別部分之外。
引發部分的化學組成特別取決於裂解酶的需要。例如，如果裂解酶是 磷酸酶，則所述引發部分可以包括由特別的磷酸酶識別並斷裂的磷酸酯或 磷酸酯類似物。如果所述斷裂酶是核酸酶，則引發部分可以包括由特別的 核酸酶識別並斷裂的寡核苷酸(或其類似物)。如果所述斷裂酶是糖苷酶， 則引發部分可以包括由特別的糖苷酶識別並斷裂的碳水化合物(參見，例 如，Florent等.醫學化學雜誌(JMMC/z置)41 :3572-3581 (1998)， Ghosh 等.四面體通訊(Tetrahedron Letters) 41 :4871-4874 (2000), Michel等. Atta-ur-Rahman(ed.)21 :157- 180(2000),禾B Leu等.醫學化學雜誌aMed CTzem.) 42:3623-3628 (1999))。由脂肪酶和酯酶如磷酸酶識別並裂解的示 例性結構，也是公知的，並且包括在下列各項中公開的結構Ohwada等.生 物有機醫學化學通訊(所oorg Med C7zem Le". ) 12:2775-2780 (2002),Sauerbrei等.Angew Chem Int Ed. 37:1143-1146 (1998), Greenwald等.醫學 化學雜誌通訊(JMedC/7ewZ^0 43:475-487 (2000), Dillon等.生物有機 醫學化學通訊(Bioorg Med Chem Lett.) 14:1653-1656 (1996),和Greenwald 等.醫學化學雜誌(JA/WC/7ew.) 47:726-734(2004))。由蛋白酶/蛋白水解 酶識別並裂解的示例性結構在下列各項中公開Niculescu-Duvaz等.醫學 化學雜誌(J她dCW) 41 :5297-5309 (1998), Niculescu-Duvaz等.醫學 化學雜誌a^fedOzem.) 42:2485-2489(1999), Greenwald等.醫學化學雜 志(J Med C77緩)42:3657-36670 (1999), de Groot等.生物有機醫學化學 通訊(所owgA/^/Cfem丄e".) 12:2371-2376 (2002), Dubowchik等.生物綴 合物化學(Bioconjugate Chem.) 13:855-869 (2002)，和de Groot等.有機化 學雜誌aOg(3em.) 66:8815-8830 (2001)。由催化抗體識別並裂解的示 例性結構在Gopin等.Angew Chem Int Ed. 42:327-332 (2003), Di腿t等. 化學通訊(ChemCommun.) 1386-1387 (2001)中公開。
接頭部分，引發部分和任選的標記和BG以允許它們發揮它們各自的 功能的任何方式連接到接頭部分上。在一些實施方案中，引發部分，標記 和/或BG分別獨立於彼此地，直接連接到接頭部分上。在其它實施方案中， 引發部分，標記和/或BG可以是，獨立於彼此地，通過一個或多個任選的 連接間接相連到接頭部分上。任選的連接可以包括離去基團，其在底物化 合物斷裂時，與附著於其上的部分一起從接頭的骨架上釋放。例如，在一 些實施方案中，所述標記可以通過包含離去基團的連接附著到接頭部分的 骨架上，而BG可以通過穩定的連接附著到接頭部分的骨架上，所述穩定 的連接例如在斷裂反應後不從接頭骨架上解離的連接。
在一些實施方案中，所述引發部分還作為接頭部分。在這些實施方案 中，專門的引發劑對引發部分的裂解還導致接頭的斷裂和標記和/或BG的 釋放。
在一些實施方案中，所述引發部分還作為BG。在這些實施方案中， 專門的引發劑對引發部分的裂解導致接頭的斷裂和BG的去除。因此，在 這些實施方案中，接頭斷裂和BG去除可以在單一步驟中在相同條件下發 生。結果，附著到可斷裂接頭上的標記和BG可以在單一步驟中在相同條 件下去除。也可以作為BG的引發部分的實例包括但不限於，-P04， S03,和C(0)R9。
包含磷酸酯BG和引發部分的可逆終止子核苷酸的實例顯示在圖1 中，其中可斷裂接頭附加在胞嘧啶鹼基上。在可斷裂接頭上的磷酸酯作為 引發部分。磷酸酯引發部分的裂解引起接頭的斷裂和染料從胞嘧啶鹼基上 的去除。在核糖糖2'位置的磷酸酯BG的裂解允許其它的核苷酸添加到3' 位置。包含磷酸酯引發部分的可斷裂接頭的其它實例顯示在圖2和圖3中， 其中可斷裂接頭包含螢光染料。製備這些和其它示例性可斷裂接頭的方法 在美國專利公布號20060003383中公開。
在一些實施方案中，磷酸酯BG和引發部分可以通過鹼性磷酸酶 ("ALP")(正磷酸單酯磷酸水解酶[鹼性最宜];(EC 3丄3.1))裂解。通常， ALPs是催化磷酸單酯酶反應的同型二聚體非特異性金屬酶。(Coleman.生 物物理生物分子結構年刊(Annu Rev Biophys Biomol Struct.) 1992;21 :441-483; Holtz等.FEBS Lett. 1999;462:7-11; Holtz等.生物的化學 雜誌(J脂C/z亂)1999;274:8351-8354; Kim等.Clin Chim Acta 1989;186;175-188; Manes等.Genomics (基西組學)1990;8:541畫554; McComb等.鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase) 1979 Plenum Press, NY; Trowsdale等.生物化學學會交流(Biochem Soc Trans.) 1990;18: 178-180)。 ALPS的反應條件是本領域公知的，並且適用於該公開方法的ALPs的非 限制性實例包括蝦鹼性磷酸酶(de Backer等.分子生物學雜誌( / A/o/ A'o/.) 2002年5月17日;318(5):1265-74;01sen等比較生物化學生物物理 學(Comp所oc/zemP/z;^0/.) 1991 99B:755-61)，牛腸鹼性磷酸酶(Weissig 等生物化學雜誌(所oc/zem J!) 1993;290:503-508)，和分離自下列各項的 的ALPs:屍yracoc面—肌'(Erauso等.微生物學進展(Ac/z M,cra6/。/). 1993;160:338-349; Zappa等.應用環境微生物學(Appl Environ Microbiol.) 2001年10月；67(10):4504-11),屍,ococcws Zzor汰tw/n7物禾中(Gonzalez等.極 立崙生鬥勿(Extremophiles) 1998;2: 123-130), 77zermatogweMz'cra6 Tec/mo/.) 1997;21 :335-340), TTzemms caWo; M^ GK24 (Park等FEMS微生物學通訊(F五MS Mfcra^o/) 1999;180:133-139),嗜熱棲熱菌(T7ze匿"/z謂—7ws) (Pantazaki等.應 用生物化學生物技術"/ p/.所oc/zem所ofec/z"o/.) 1998;75:249-259),鹽盒菌屬 (Goldman等.細菌學雜誌 (J Bacteriol.) 1990;172:7065-7070)，鹽桿菌屬(//a/o&cfen'wm) (Bonet等.國際生物化學 分子生物學(歷oc/zem Mo/5/o//"O 1994;34:1109-1120; Fitt等生物化學 雜誌(Biochem J.) 1979;181 :347-353),中間普雷沃氏菌(屍謂&//。 ,她匿&a) (Ansai等FEBS通訊(FEBS Lett) . 1998;428: 157-160),桿菌 屬(Sac/〃M5)(Hulett.分子微生物學(Mo/ M/cra6z'o/.) 1996; 19:933-939; Mori 等生物技術應用生物化學(5Wec/ww/^; p/所oc/zew) 1999;29:235-239; Sharipova等生物化學(莫斯科)(Biochem. (Moscow)) 1998;63:1178-1182; Sharipova等國際生物化學分子生物學(所oc/zem Mo/所o/ /"f.) 1996;38:753-761; Spencer等細菌學雜誌(JBacteriol.) 1981;145:926-933), 弧菌屬(J^n'o) (Hauksson等酶學微生物學技術(五"zjwe M/cra6 Tec/^o/.) 2000;27:66-73),大腸桿菌(j^c/^n'c/n'a co/O (Coleman.生物物理學生物分 子結構每年綜述(j朋w i ev歷o^/z，所omo/ S&w". ) 1992;21 :441-83; Derman 等.細菌學雜誌(JBacteriol.) 1991年12月；173(23):7719-22; Hulett等生 物的化學雜誌(j Biol Chem.) 1991;266:1077-1084; Janeway等生物化學 (Biochemistry) 1993;32:1601-1609; Kane.現代生物技術觀點(CurrOpin Biotechnol.) 1995;6:494-500; Karamyshev等分子生物學雜誌(JMo/說o/.) 1998年4月10;277(4):859-70; Kim等生物技術通訊(Biotechnol Lett.) 1998;20:207-210; Murphy等分子生物學雜誌(J Mol Biol.) 1995;253:604-617; Murphy等生物的化學雜誌(J Biol Chem.) 1993;268:21497-21500),擬桿菌屬(Sa"eraW^) (Yamashita等感染免疫 學(Infect Immun.) 1990;58:2882-2887), Gafiky mor/ma (Asgeirsson等比較 生物化學生物物理學(Comp所oc/zem P/z》w'o/.) 1995;110B:315-329)，鋸緣 青蟹(Scy〃fl化rrato)(生物化學細胞生物學雜誌(J Biochem Cell Biol.) 2000;32:879-885),人(Berget等美國國家科學院學報(PNAS USA) 1987;84:695-698; Weiss等美國國家科學院學報(PNAS USA) 1986;83:7182- 7186),昆蟲(Eguchi.比較生物化學生物物理學(Comp Biochem Physiol.) 1995;111B:151-162),脈孢菌屬(TVewra^ora) (Morales 等Braz J Med Biol Res. 2000;33:905-912)，南極菌株TAB5(Antarctic strain TAB5) (Rina等歐洲生物化學雜誌(Eur J Biochem) 2000;267: 1230-1238)。
28可逆終止子核苷酸實際上可以用於分析或檢測多核苷酸的任何方法中。在許多非限制性實例中，適當的多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的，或它們的組合，線性的或環形的，染色體或基因或其部分或片段，調節性多
核苷酸，來自例如質粒或染色體DNA、基因組DNA、線粒體DNA的限制性片段，來自構建體或構建體文庫的DNA (例如，來自YAC, BAC或PAC文庫)，RNA (例如，mRNA, rRNA或vRNA)或cDNA或cDNA文庫。如本領域己知的，cDNA是通過RNA模板的反轉錄產生的單鏈的或雙鏈的DNA。因此， 一些實施方案包括反轉錄酶和適用於將RNA模板反轉錄成為cDNA的一個或多個引物。反應、進行這樣的"RT"反應的試劑和條件是本領域已知的(參見，例如，Blain等，1993,生物的化學雜誌(J.所o/.C/iew. )5:23585-23592; Blain等，1995，病毒學雜誌(乂 P ra/. )69:4440-4452;PCR基本技術(PC7 五^e油'a/ rec/zm々w") 61-63， 80-81， (Burke， ed.， J. Wiley& Sons 1996); Gubler等,1983,基因25:263-269; Gubler, 1987,酶學方法(MeAo^ 五"2^wo/) ， 152:330-335; Sellner等，1994,病毒學方法雜誌(■/ Wra/. M"/zod.) 49:47-58; Okayama等，1982,分子細胞生物學(Mo/.Ce〃.2:161-170;和美國專利號5310652, 5322770, 6300073,它們的這些內容通過引用結合於此。在一些實施方案中，多核苷酸可以包括單個多核苷酸(例如，染色體，質粒)，從該多核苷酸可以克隆擴增和分析一條或多條不同的目的序列。克隆擴增的方法在美國申請系列號11/377,763中公開。
在一些實施方案中，多核苷酸可以以平行方式分析。例如，不連續的或分離的多核苷酸可以作為它們附著在表面的分立區域或分離在多孔平板的孔內的結果進行平行分析。因此，在一些實施方案中，可以平行分析至少100, 500, 1000, 10000, 50000, 100000， 300000, 500000，或1000000個多核苷酸。通常，平行反應產生不連續的可以與單個多核苷酸締合或連接的檢測信號。
在一些實施方案中，多核苷酸可以使用可逆終止子核苷酸基於邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis)技術進行測序。所述邊合成邊測序技術利用核酸的控制合成(例如，引物延伸)和以逐步方式檢測每一個結合的可逆終止子核苷酸。例如，在一些實施方案中，在4種可逆終止子核苷酸三磷酸酯和聚合酶的存在下，引物可以雜交到固定在表面上的多核苷酸上，其中所述可逆終止子核苷酸三磷酸酯每一種用光譜解析性螢光染料標記。第一可逆終止子在測序引物3'末端的結合防止進一步延伸。為了檢測所結合的可逆終止子，洗掉未結合的可逆終止子，並且通過可逆終止子的螢光標記檢測結合的可逆終止子。為了允許下一個延伸和檢測循環，將標
記和BG從結合的可逆終止子上去除。在實施方案中，其對可逆終止子使用磷酸酯BG和包含磷酸酯引發部分的可斷裂接頭，使用鹼性磷酸酶，諸如蟲下鹼性磷酸酶，如上述，可以在相同條件下去除BG和標記。因此，可以利用酶反應在相同條件下有效地去除標記和BG。在從結合的可逆終止子上去除所述標記和BG之後，在再次引入4種可逆終止子核苷酸三磷酸酯和聚合酶之前，將鹼性磷酸酶滅活或洗掉。例如，在一些實施方案中，蝦鹼性磷酸酶可以通過在65'C溫育15分鐘而滅活。
在實施所公開的方法時，可以使用分子生物學和重組DNA中的許多常規技術。這些技術是本領域公知的，並且例如在下列各項中公開現代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology),第I, II,禾口 III巻，1997 (F. M. Ausubel編.)；Sambrook等，2001，分子克隆實驗室手冊
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第3版，冷泉港實驗室出版社
(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港，紐約；Berger禾。Kimmel,分子克隆技術指導，酶學方法(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第152巻，學院出版社公司(Academic Press, Inc.),San Diego, Calif. (Berger), DNA克隆實踐方法(DNA Cloning: A PracticalApproach),第I和II巻，1985 (D. N. Glover編)；寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis), 1984 (M. L. Gait編)；核酸雜交(Nucleic AcidHybridization) , 1985, (Hames禾卩Higgins);轉錄禾口番羽譯(Transcription andTranslation) , 1984 (Hames和Higgins編)；動物細胞培養(Animal CellCulture) , 1986 (R. I. Freshney編,)；固定的細胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes), 1986 (IRL Press); Perbal, 1984,分子克隆的實踐指導(A PracticalGuide to Molecular Cloning);酉每學方f去(Methods in Enzymology)系歹(J (學院出版社公司(Academic Press, Inc.));用於哺乳動物細胞的基因轉移載體
(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) ， 1987 (J. H. Miller和M. P.Calos編，冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory));和酶學方法(Methods in Enzymology)第154和155巻(分別由Wu和Grossman,和Wu,編)。
將多核苷酸共價或非共價附著到固體支持物或表面上的方法也是本領域公知的。固體支持物可以包括各種材料，包括但不限於，塑料、玻璃、陶瓷、金屬、樹脂、凝膠和膜中的任何一種或多種。固體支持物的示例性類型包括但不限於平板、載玻片、珠子、微珠、須晶、纖維、梳狀晶簇、雜交晶片、膜、單晶、陶瓷、和自我裝配的單層。
多核苷酸可以通過共價結合附著到固體支持物上，諸如通過用偶聯劑綴合，或通過非共價結合，諸如靜電相互作用、氫鍵或抗體-抗原偶聯，或通過它們的組合來附著。示例性的偶聯劑包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈黴抗生物素蛋白、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白質A/IgG抗體Fc片段，和鏈黴抗生物素蛋白/蛋白質A嵌合物(Sano等.(1991)生物/技術(Bio/Technology) 9:1378，其通過引用結合)，或這些試劑的衍生物或組合。核酸可以通過可光致斷裂的鍵、靜電鍵、二硫鍵、肽鍵、二酯鍵或這些鍵的組合而附著到固體支持物上。核酸還通過選擇性釋放的結合諸如4，4'-二甲氧基三苯甲基或其衍生物任選地附著到固體支持物上。已經發現有用的衍生物包括3或4 [二-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸,N-琥珀醯亞胺基-3或4 [二-(4-甲氧基苯基)]-甲基-苯甲酸，N-琥珀醯亞胺基-3或4[二-(4-甲氧基苯基)]-羥甲基-苯甲酸，N-琥珀醯亞胺基-3或4 [二-(4-甲氧基苯基)]-氯甲基-苯甲酸，以及這些酸的鹽。在一些實施方案中，多核苷酸可以通過在核酸和固體支持物之間的間隔部分附著到固體支持物上。
在一些實施方案中，多核苷酸可以通過可裂解的附著而附著到固體支持物上。可裂解的附著可以通過在多核苷酸和固體支持物之間附著可裂解的化學部分而產生，其包括，例如，寡肽，寡核苷酸，低聚醯胺,丙烯醯胺低聚物,乙二醇低聚物，約6-20個碳原子之間的烷基鏈，以及它們的組合。'這些部分可以使用，例如，添加的化學試劑、電磁輻射、或酶裂解。由酶可裂解的示例性附著包括可以由蛋白酶裂解的肽鍵和可以由核酸酶裂解的磷酸二酯鍵。
化學試劑如(3-巰基乙醇，二硫蘇糖醇(DTT)和其它還原劑裂解二硫
31鍵。可以使用的其它試劑包括氧化劑、水合劑和其它選擇性活性化合物。電磁輻射諸如紫外線、紅外線和可見光裂解可以光致斷裂的鍵。附著也可以是可逆的，例如，使用熱或酶處理，或是可逆的化學或磁性附著。釋放和再附著可以使用，例如，磁場或電場進行。
在測序和本發明所述的其它方法中可以使用多種核酸聚合酶。在許多示例性實施方案中，聚合酶可以是熱穩定性聚合酶或熱降解性聚合酶。適
當的熱穩定性聚合酶包括，但不限於，分離自下列各項的聚合酶Thermusantranikianii, 水生棲熱菌 (777e，Ms a，油'cws) , T77e，ws caWop/z//z ,777grmw51 c/z/z'arapMMS， 絲狀棲熱菌 (77^mi ), 黃棲熱菌
(T77en77ws y/avws) , Thermus igniterrae,孚L棲熱菌 (T7zermtw /"c/^ms ),r/zmwMs cw/z/附a,， 紅棲熱菌 (T7^mM- ra6er), 紅色棲熱菌 (772ermwsn^6e"s) , 7j^管致黑禾西tA菌(T7zerwus scc^odwc/t^) , T7zerwws w'/vaww51,禾西^5;菌屬(77 wmw)物種Z05，棲熱菌屬物種sps 17,嗜熱棲熱菌(r/^rmwAermop/zz./z^),海豐西熱淨包菌(772ermotoga ,那不勒其Jf禾西^ft袍菌
(77zem otoga wea/ o/"awa)，非洲棲熱腔菌 (r/zermosi^/zo ayh'camw),^("aeraceZ/wm Ae削op/n7簡,熱堅芽孢桿菌(5鎖'〃ws ca/cfoteMox)，嗜熱月旨肪芽 包豐幹菌(5flcz.〃MS ■siZLearo L/7ermo/ /z//z^ ), 、 夭氏火球菌(屍jrococczw woese/),激烈火球菌(屍,ococcws/wn'osz^),禾口 77zer附ococcus /"orafe。例如，所述聚合酶任選地在該酶的螺旋O處缺少F-Y突變，或者另外缺少增強酶對3'-脫氧核苷酸的結合的突變。在一些實施方案中，聚合酶包含3'-5'核酸外切酶活性。在一些實施方案中，聚合酶可以是熱降解性的，諸如大腸桿菌DNA聚合酶I,大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段,T4DNA聚合酶,T5DNA聚合酶,T7 DNA聚合酶，以及其它。
適用於本發明所述的方法的可商購獲得的聚合酶的非限制性實例包括，但不限於，TaqFS , AmpliTaq CS (鉑爾金愛爾默(Perkin-Elmer)),AmpliTaq FS (柏爾金愛爾默(Perkin-Elmer))， Kentaql (AB肽(AB Peptide),St. Louis,密蘇裡州)，Taquenase (ScienTech公司，St. Louis，密蘇裡州)),ThermoSequenase (安瑪西亞(Amersham)) , Bst聚合酶，VentR(excT) DNA聚合酶，Reader Taq DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)) , DEEP VENT DNA聚合酶(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)) , PFUTurbo DNA聚合酶(Stratagene), Tth DNA聚合酶，KlenTaq-1聚合酶，SEQUENASE 1.0 DNA聚合酶(安 瑪西亞生物科學(Amersham Biosciences))，禾Q SEQUENASE 2.0 DNA聚合 酶(美國生物化學(United States Biochemicals))。
在一些實施方案中，聚合酶可以進行修飾，其可以增強本發明公開的 可逆終止子核苷酸的結合。示例性的修飾的聚合酶在美國專利號4889818, 5374553, 5420029, 5455170， 5466591, 5618711， 5624833， 5674738, 5789224, 5795762, 5939292;和美國專利公布號20020012970, 20040005599中公開。 修飾的聚合酶的非限制性實例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶，G46E E678G CS5 DNA聚合酶，E615G Taq DNA聚合酶，AZ05R聚合酶，和 G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶，其在美國專利公布號20050037398 中公開。修飾的聚合酶的生產可以使用本發明所述的和本領域已知的分子 生物學和重組DNA的許多常規技術實現。在一些實施方案中，其中未封 閉的2'-磷酸酯產生2'-羥基，即，核糖核苷酸，可使用聚合酶突變體，諸如 在美國專利號5939292中所述的那些，其結合NTPs以及dNTPs。
本發明公開的方法的產物可以通過寬範圍的方法進行分析，其可以依 據操作者的判斷力進行選擇。分析方法包括，但不限於，凝膠電泳，毛細 管電泳(CE:例如，3730 DNA分析儀，3730x1 DNA分析儀，3100-Avant基 因分析儀，和270A-HT毛細管電泳系統(應用生物系統(Applied Biosystems),福斯特城，加利福尼亞)(參見，例如，美國專利號.RE37941, 5384024， 6372106, 6372484, 6387234, 6387236, 6402918， 6402919, 6432651, 6462816, 6475361, 6476118, 6485626， 6531041, 6544396, 6576105, 6592733, 6596140,6613212,6635164,和6706162)，其使用各種聚合物(例如，分離 聚合物(例如，POP-4 POP-6TM，或POP-7 (應用生物系統(Applied Biosystems),福斯特城，加利福尼亞)，線性聚丙烯醯胺(LPA: Kleparnik 等，2001，電泳(五/ec rap/7we^) 22(4):783-8; Kotler等，2002,電泳 (五/e"ra/ /zw^&) 23(17):3062-70; Manabe等，1998，電泳(￡/e"ra; /7w^&) 19:2308-2316)),層析，薄層層析，或紙層析，通過雷射-誘導的螢光(參見， 例如，美國專利號5945526, 5863727， 5821058， 5800996, 5332666, 5633129, 和6,395,486),放射自顯影，化學發光，質譜方法(參見，例如，美國專利號.6225450和510412)，顯微毛細管電泳方法(參見，例如，Doherty等，2004， 分析化學(J加/;;fea/ C/2ew^^y) 76:5249-5256; Ertl等，2004，分析化學
"wa(y"ca/ C/ e冊'"^) 76:3749-3755; Haab等，1999,分析化學U"a/_y"'ca/ )71 :5137-5145 (1999); Kheterpal等，1999,分析化學""咖ca/ C7湖勿)71 :31A-37A; Lagally等，2000，傳感器和激發器(&"麗
B 63:138-146; Lagally等，2001,分析化學) 73:565-570; Lagally等，2003,在顯微總分析系統中使用可攜式PCR-CE微 系統進行遺傳分析(Gewe"c爿wa/"^s L^'"g a戶Ci -C￡ MifcmsjAstew, ,'"M'cra 7bto/爿腦/戸^ 5y他臘)第2巻,Northrup等(編)第1283-1286頁； Liu等，1999,分析化學""a/. C7z亂)71 :566-573; Medintz等，2000,電泳
(五/e"rap/zoms&) 21 :2352-2358; Medintz等，2001,基因組研究(Ge"ome i e廳rc/2) 11 :413-421; Paegel等,現代生物技術觀點(CWeWO—'謹z'" 腸fec/zm /ogy ) 14:42哉Scherer等，1999, 電泳(臉c卿/zo固'" 20:1508-1517; Shi等，1999,分析化學(」"a/,'ca/C7zem&^y)71 :5354-5361; Wed函yer等,2001，生物技術(5/o!Tec/wz々z^) 30:122-128;美國專利號. 6787015, 6787016;美國申請號20020166768， 20020192719， 20020029968, 20030036080, 20030087300, 20030104466, 20040045827, 20040096960; EP1305615;禾卩WO 02/08744)。
在一些實施方案中，由本文公開的標記產生的可檢測信號可以使用光 電倍增管(PMTs),電荷-偶聯的裝置(CCDs)，加強的CCDs,光電二極體, 離子雪崩光電二極體，光學傳感器，掃描探測器，等檢測。檢測器，諸如這 些易於從許多商業來源獲得，所述商業來源包括，例如，應用生物系統
(Applied Biosystems)(福斯特城，加利福尼亞)。用於實施本發明方法的 檢測系統進一步在，例如，Skoog等，儀器分析原理(Principles of Instrumental Analysis),第5版,Harcourt Brace College Publishers (1998)禾口 Currell,儀器分析性能特徵和質量(Analytical Instrumentation: Performance Characteristics and Quality) ， John Wiley & Sons,公司(2000)中 描述。
在本發明公開的方法中所用的引物(例如，測序引物)通常應該是足 夠長，足以在反應條件下引發模板-引導的合成。引物的準確長度可以取決
34於許多因素，包括但不限於，在引物和多核苷酸之間需要的雜交溫度，不 同靶多核苷酸序列的複雜性，鹽濃度，離子強度，pH和其它緩衝劑條件， 以及引物和多核苷酸的序列。選擇適用於具體應用的引物的長度和序列的
能力在普通技術人員的能力範圍內(參見，例如，Sambrook等分子克隆 實驗室手冊(Mo/簡/ar C7o"z'w J丄a6oratoa M m/"/) 9,50-9.51, 11.46, 11.50 (第2版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 10.1-10.10 (第3版.冷泉港實驗室出版社))。在一些實施方案中， 引物包含約15-約35個核苷酸，所述核苷酸適於與靶多核苷酸雜交，並且 形成適於DNA合成的底物，儘管所述引物可以包含更多或更少的核苷酸。 更短的引物通常需要更低的溫度與靶序列形成充分穩定的雜交複合物。多 核苷酸退火的能力可以由雜交複合物的熔融溫度("Tm")確定。Tm是其中 50%的多核苷酸鏈與其精確的補體形成雙鏈多核苷酸的溫度。因此，對於 所選擇的多核苷酸的Tm隨著影響或改變雜交的因素而改變。在一些實施 方案中，在其中發生熱循環，引物可以設計成具有在約60-75。C範圍內的 熔融溫度("Tm")。在這一範圍內的熔解溫度傾向於在引物延伸的起始時保 證引物保持退火或與靶多核苷酸雜交。除其它因素外，引物延伸反應所用 的實際溫度可以特別取決於，例如，引物的濃度。對於使用熱穩定性聚合 酶諸如Taq DNA聚合酶進行的反應，在示例性實施方案中，引物可以設 計成具有在約60-約78"C或約55-約70。C範圍內的T 。不同引物的熔解溫 度可以是不同的，然而，在備選實施方案中，它們應該都是近似相同的， 即，每個引物的L，例如，在平行反應中，可以在約5T:或更小的範圍內。 不同引物的Ls可以利用本領域公知的熔解技術憑經驗確定(參見，例如， Sambrook等分子克隆實驗室手冊(Mo/ecw/ar C7om'"g.'爿丄a6orato^y ikfam/。/) 11.55-11.57 (第2版，冷泉港實驗室出版社))。備選地，可以計算 引物的Tm。關於計算引物的Tms的許多參考文獻和輔助在本領域中是可 用的，並且包括，例如但不限於，Baldino等.酶學方法(M"/wA 五"zymo/ogy.) 168:761-777; Bolton等，1962,美國國家科學院學報(屍rac. 扁.腦)48:1390; Bresslauer等,1986,美國國家科學院學報 (/Voc.編.Jcac/. 5W.園)83:8893-8897; Freier等，1986，美國國家科學
35院學報(屍rac. Ato/.爿cad 5W. "SL4) 83:9373-9377; Kierzek等，生物化學 (Aoc/zew^o025:7840-7846; Montpetit等，1992,病毒學方法雜誌(J Wra/. Af^/zoA) 36:119-128; Osbome， 1991, C」B/CW8:83; Rychlik等，1990,核酸 研究(M/c/e/cy4c/cfa^s.) 18:6409-6412 (erra/^w, 1991，核酸研究(7W/c/"c ^c/A L ) 19:698); Rychlik. NIH研究雜誌(J. NIH Res.) 6:78; Sambrook 等.分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) 9.50-9.51, 11.46-11.49 (第2版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(Mo/ecw/ar C7om'"gv J丄W0rato7 Ma腦fl/) 10.1-10,10 (第3版.冷泉港實驗室出版社))； SantaLucia, 1998,美國國家科學院學報(戶rac.淑/. Jed 5W.園) 95:1460-1465; Suggs等，1981 ,在使用純化的基因的發育生物學 (Deve/op膨"to/ t/y— P鵬y ed C ewasO 中(Brown等,編.),第
683-693頁，學院出版社(Academic Press); Wetmur, 1991, CWf. 所oc/^m. Mo/所o/. 26:227-259,其內容通過應用結合。這些方法中的任何一種可以 用於確定引物的Tm。
正如熟練的技術人員應該理解的，通常，對每條鏈具有相同序列的 RNA:RNA, RNA:DNA,和DNA:DNA雜化物(hybrid)的相對穩定性以及由 此的Tm可能不同。通常，RNA:RNA雜化物是最穩定的(最高相對Tm)， 並且DNA:DNA雜化物是最不穩定的(最低的相對Tm)。因此，在一些實 施方案中，除了上述那些之外，在設計引物時要考慮的另一個因素是引物 和靶多核苷酸的結構。例如，在RNA多核苷酸反轉錄產生cDNA的實施 方案中，確定用於反轉錄反應的DNA引物的適合性應該包括所述RNA多 核苷酸對所述引物的Tm的影響。儘管不同雜化物的Tm可以憑經驗確定， 如上述，但是計算不同雜化物的Tm的方法的實例在Sambrook等分子克 隆實驗室手冊(Mo/ecw/ar C/om'"g.'」丄a6orafow Ma"wa/)9.51 (第2版，冷 泉港實驗室出版社)中找到。
用於所公開的方法的引物的序列設計成基本上與靶多核苷酸的區域 互補。"基本上互補"在這裡意指引物的序列包括足夠的互補性，以在所 述濃度和反應中所用的溫度和條件下與靶多核苷酸雜交，並且通過DNA 聚合酶延伸。
36本文所述的組合物和試劑可以包裝在試劑盒中。在一些實施方案中， 試劑盒包含一種或多種可逆終止子核苷酸。在一些實施方案中，每個可逆 的核苷酸可以包含標記(例如，螢光染料，放射性同位素，質量-修飾基團 等)。在一些實施方案中，標記可以通過可斷裂接頭附著到可逆終止子核苷 酸上。在一些實施方案中，可逆終止子核苷酸的BG和引發部分可以在相 同條件下通過酶如鹼性磷酸酶的作用去除。因此，在一些實施方案中，試
劑盒可以包括適於激活引發部分並且從可逆終止子核苷酸上去除BG的引
發劑。在一些實施方案中，試劑盒可以包括聚合酶，其包括但不限於，本 文所述的修飾的聚合酶。在一些實施方案中，試劑盒可以包括一種或多種 測序引物。在一些實施方案中，試劑盒可以進一歩包括適用於測序的模板 多核苷酸，其可以任選地附著在表面或固體支持物上。在一些實施方案中， 試劑盒可以包括一個或多個反應區室，其包括適於實施反應如測序反應的 試劑，其依賴於操作者的判斷力選擇。例如，在一些實施方案中，試劑盒 可以包括--個或多個反應區室，其包括一種或多種測序試劑。在一些實施 方案中，試劑盒的成分可以與來自商購試劑盒的一種或多種試劑聯合使
用，其包括但不限於，可從下列各項商購的那些應用生物系統(Applied Biosystems)(即，Big Dye 終止子循環測序試劑盒)，Epicentre (即， S叫uiThermTM循環測序試劑盒)，安瑪西亞(Amersham)(即，DYEnamic直 接染料-引物循環測序試劑盒)，Boehringer Mannheim (即，CycleReader DNA測序試劑盒)，Bionexus公司(即，AccuPower DNA測序試劑盒)，和 USB循環測序試劑盒(即，Thermo S叫uenaseTM循環測序試劑盒)。
在試劑盒中包含的各種成分典型地包含在分開的容器中，然而，在一 些實施方案中， 一種或多種所述成分可以存在於相同的容器中。另外，試 劑盒可以包括本文所述的組合物和試劑的任意組合。在一些實施方案中， 試劑盒可以包括對於實施所公開的方法是必需的或任選的其它試劑。這樣 的試劑包括，但不限於，緩衝液、分子大小標準、對照多核苷酸等。
在本申請中，單數的應用包括複數，除非另外特別指明。本文所用的 部分標題僅是用於組織的目的，並不以任何方式解釋為限制所述的主題。 儘管結合許多實施方案描述了本發明的教導，但是並不意欲將本發明教導 限制為這樣的實施方案。相反，本發明教導包括各種備選方案、修改和等價物，這是本領域的技術人員應該理解的。
本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請和其它文件出於所有目 的通過引用完全結合於此，其在如同每一篇單獨的出版物、專利、專利申 請或其它文件出於所有目的通過引用單獨結合的相同程度上。儘管已經舉 例說明並且描述了許多具體的實施方案，但是應該理解，在不背離本發明 的精神和範圍的條件下，可以進行各種改變。
權利要求
1. 一種包含鹼基和糖的核苷，其中在所述鹼基上附著標記，並且在所述糖上附著保護基團，其中所述標記和所述保護基團可以通過酶從所述核苷上脫離。
2. 權利要求1的核苷，其中所述標記和所述保護基團可以在相同條件下從所述核苷上脫離。
3. 權利要求1的核苷，其中所述標記和所述保護基團包含磷酸酯部分。
4. 權利要求l的核苷，其中所述標記和所述保護基團包含S03部分。
5. 權利要求l的核苷，其中所述標記和所述保護基團包含C(O)R部分。
6. 權利要求1的核苷，其中所述酶是磷酸酶。
7. 權利要求6的核苷，其中所述磷酸酶是蝦鹼性磷酸酶。
8. 權利要求l的核苷，其中所述酶是硫酸酯酶。
9. 權利要求1的核苷，其中所述酶是酯酶。
10. 權利要求1的核苷，其中所述標記是螢光標記。
11. 權利要求1的核苷，其中所述標記通過可斷裂的接頭附著到所述 鹼基上。
12. 權利要求11的核苷，其中所述可斷裂的接頭包含選自由下列各項 組成的組的引發部分P04,S03,和C(O)R。
13. 權利要求12的核苷，其中所述引發部分是所述酶的底物。
14. 一種包含鹼基和糖的核苷，其中在所述鹼基上附著標記，並且在 所述糖上附著保護基團，其中所述標記和所述保護基團分別包含磷酸酯部 分，並且可通過鹼性磷酸酶脫離。
15. —種包含鹼基和糖的核苷酸，其中在所述鹼基上附著標記，並且 在所述糖上附著保護基團，其中所述標記和所述保護基團可通過酶從所述 核苷上脫離。
16. 權利要求15的核苷酸，其中所述標記和所述保護基團可以在相同 條件下從所述核苷上脫離。
17. 權利要求15的核苷酸，其中所述標記和所述保護基團包含磷酸酯部分。
18.權利要求15的核苷酸，其中所述標記和所述保護基團包含S03就4V其中所述標記和所述保護基團包含C(O)R其中所述酶是磷酸酶。 其中所述磷酸酶是蝦鹼性磷酸酶。 其中所述酶是硫酸酯酶。 其中所述酶是酯酶。 其中所述標記是螢光標記。 其中所述標記通過可斷裂的接頭附著在所其中所述可斷裂的接頭包含選自由下列各 項組成的組的引發部分P04,S03,和C(O)R。
19.權利要求15的核苷酸部分。
20.權利要求15的核苷酸
21.權利要求20的核苷酸
22.權利要求15的核苷酸
23.權利要求15的核苷酸
24.權利要求15的核苷酸
25.權利要求15的核苷酸述鹼基上。
26.權利要求ll的核苷酸，
27. 權利要求12的核苷酸，其中所述引發部分是所述酶的底物。
28. 權利要求12的核苷酸，其中所述核苷酸是5'核苷酸三磷酸酯。
29. —種包含鹼基和糖的核苷酸，其中在所述鹼基上附著標記，並且 在所述糖上附著保護基團，其中所述標記和所述保護基團分別包含磷酸酯 部分，並且可通過鹼性磷酸酶脫離。
30. —種多核苷酸，其中3'末端核苷酸包含鹼基和糖，其中在所述鹼 基上附著標記，並且在所述糖上附著保護基團，其中所述標記和所述保護 基團可以通過酶從所述核苷酸上脫離。
31. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記和所述保護基團可以在相 同條件下從所述核苷上脫離。
32. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記和所述保護基團包含磷酸 酯部分。
33. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記和所述保護基團包含S03部分。
34. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記和所述保護基團包含 C(O)R部分。
35. 權利要求15的多核苷酸，其中所述酶是磷酸酶。
36. 權利要求20的多核苷酸，其中所述磷酸酶是蝦鹼性磷酸酶。
37. 權利要求15的多核苷酸，其中所述酶是硫酸酯酶。
38. 權利要求15的多核苷酸，其中所述酶是酯酶。
39. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記是螢光標記。
40. 權利要求15的多核苷酸，其中所述標記通過可斷裂的接頭附著到 所述鹼基上。
41. 權利要求ll的多核苷酸，其中所述可斷裂的接頭包含選自由下列 各項組成的組的引發部分P04，S03，和C(O)R。
42. 權利要求12的多核苷酸，其中所述引發部分是所述酶的底物。
43. —種延伸引物核酸的方法，所述方法包括使與模板多核苷酸雜交的引物與聚合酶和權利要求15-29中任一項的 核苷酸在適合於所述聚合酶的條件下接觸，以通過將所述核苷酸添加到所 述引物的3'末端以模板依賴性方式延伸所述引物。
44. 一種對模板多核苷酸進行測序的方法，所述方法包括a) 使與模板多核苷酸雜交的引物與聚合酶和權利要求19-29中任一項 的核苷酸在適合於所述聚合酶的條件下接觸，以通過將第一個核苷酸添加 到所述引物的3'末端以模板依賴性方式延伸所述引物；和b) 鑑定所述核苷酸的鹼基。
45. 權利要求44的方法，其中所述鹼基通過檢測所述標記進行鑑定。
46. 權利要求44的方法，所述方法還包括 使所述延伸的引物與使所述標記和所述保護基團脫離的酶接觸。
47. 權利要求46的方法，其中所述酶是鹼性磷酸酶。
48. 權利要求46的方法，其中所述酶是硫酸酯酶。
49. 權利要求46的方法，其中所述酶是酯酶。
50. 權利要求46的方法，所述方法還包括a)使與模板多核苷酸雜交的所述延伸的引物與所述聚合酶和權利要 求12-22中任一項的核苷酸在適合於所述聚合酶的條件下接觸，以通過將 第二個核苷酸添加到所述延伸的引物的3'末端以模板依賴性方式延伸所 述引物；和b)鑑定所述第二個核苷酸的鹼基。
51.權利要求43-49中任一項的方法，其中所述模板多核苷酸附著在表面上。
全文摘要
本發明公開了可逆終止子核苷酸以及使用方法。
文檔編號C12Q1/68GK101506375SQ200780024929
公開日2009年8月12日 申請日期2007年6月14日 優先權日2006年6月30日
發明者傑勒德·索恩, 琳達·G·李 申請人:阿普裡拉股份有限公司