一種基於nad(p)h螢光的醇脫氫酶的篩選鑑定方法

2023-06-13 17:38:56

專利名稱：一種基於nad(p)h螢光的醇脫氫酶的篩選鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種基於NAD(P)H螢光的醇脫氫酶的篩選鑑定方法，適用於所有以 NAD(H)或NADP (H)為輔酶的醇脫氫酶。
背景技術：
醇脫氫酶(ADHs，Ε. C. 1. 1. 1. 1)是以NAD (H)或NADP (H)為輔酶進行電子轉移，催化醇的氧化或酮、醛還原的酶類。醇脫氫酶廣泛地存在於細菌、酵母和黴菌等微生物中，在胞內代謝中具有重要的生理意義。醇脫氫酶也是一類重要的生物催化劑，可通過選擇性氧化或不對稱還原製備藥物中間體-手性醇，在生物化工和工業催化領域正得到越來越大的應用。目前，篩選醇脫氫酶的方法主要包括用傳統的特定底物多次富集法和基於NAD (P) H生成的比色法，即NBT/PMS檢測方法。傳統的方法通過多次的底物富集工作量大時間長， 得到優良菌株的機率小。NBT/PMS檢測方法相對於傳統方法有所改進，該方法所需試劑較多、所用試劑毒性較大並且過程較為繁瑣。因此，設計出一套簡單快速經濟的方法提高篩選醇脫氫酶的成功率是相當必要和迫切的。

發明內容
本發明為了解決上述課題，基於醇脫氫酶以NAD(H)或NADP(H)為輔酶的特性，在反應體系中加入待測樣本對醇進行氧化，在醇氧化的同時把不發射螢光的氧化型輔酶NAD+ 或NADP+轉化成能在一定激發光激發下發射螢光的還原型輔酶NADH或NADPH，利用反應液螢光強度的變化設計出了一種醇脫氫酶的快速篩選鑑定方法。本發明採用的技術方案是一種基於NADH或NADPH螢光的醇脫氫酶的篩選鑑定方法，所述方法包括在96孔微孔板中，分別加入PH 7. 0 8. 8的Tris-HCl或ρΗ8· 8 10. 5的甘氨酸-NaOH緩衝液， 然後往緩衝液中添加0. 2. 0% (ν/ν)的底物，0. 5 ImM的輔酶NAD+或NADP+，以及待測樣本，在0 80°C下反應1 4 後，反應液在激發波長340nm 380nm和發射波長 450nm 470nm下檢測螢光強度，在同等條件下以反應體系中不加入底物的反應液為對照， 與對照相比，螢光強度增加值大於400的樣本，即為含有對應醇脫氫酶的樣本，反之則否； 所述底物為C2 ClO的醇、C6 ClO的芳香醇或C4 ClO的脂肪醇，包括混旋的醇或光學純的醇。本發明方法可用於未知樣品中醇脫氫酶的篩選，待測樣品為微生物或酶液，所述微生物來自各種可分離得到的微生物樣品，如汙水、化工廠、農田等的土樣或水樣以及現存或保藏的微生物菌種或者基因工程菌，也可將待篩選的微生物經培養得到菌體後，再進行篩選操作。本發明方法也可用於已知酶樣品的鑑定，待測樣品為已知的粗酶液或經純化後的純酶，可為市購產品，也可為已知產醇脫氫酶微生物經發酵分離獲得的酶液。
優選的，所述芳香醇為苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯。優選的，所述脂肪醇為乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羥基丁
酸乙酯。添加的輔酶為NAD+時，反應液在激發波長360nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。添加的輔酶為NADP+時，反應液在激發波長350nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。本發明中所涉及的底物有一部分水溶性較差，本發明通過兩種策略解決這一問題，一是降低底物濃度，另一是添加適量的助溶劑。優選的，所述緩衝液還添加有體積為緩衝液體積10 30%的助溶劑，所述助溶劑為甲醇、二甲基亞碸或乙腈。優選的，所述緩衝液還可添加有1 10g/L的溶菌酶。添加溶菌酶，有助於胞內醇脫氫酶的釋放和大分子底物進入細胞，有利於增強反應液的螢光強度。優選的，所述待測樣品為微生物菌株，所述方法可應用於醇脫氫酶產生菌的快速篩選，所述方法如下(1)在固體培養基上塗上20 200μ 1底物，作為富集平板，稱取0. 1 1克土壤樣本，溶於1 2ml無菌水中，充分混勻，再用無菌水稀釋1000 10000倍後塗布於富集平板，在30或37°C下培養12 72h，挑選具有不同菌落形態特徵的菌株，接種於斜面，在30 或37°C下培養12 72h，從斜面上用接種環挑取2環菌體，用60 μ 1無菌水製成菌懸液，用於96孔板的微量反應體系；(2)在96孔微孔板中，分別加入ρΗ 7. 0 8. 8的Tris-HCl或ρΗ 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH緩衝液，然後往緩衝液中添加0. 2. 0%的底物，0. 5 ImM的輔酶NAD+ 或NADP+，以及步驟(1)獲得的菌懸液，在20 50°C下反應10 24h後，反應液在激發波長340nm 380nm和發射波長450nm 470nm下檢測螢光強度，在同等條件下以反應體系中不加入底物的反應液為對照，與對照相比，螢光強度增加值大於400的樣本，即為含有對應醇脫氫酶的樣本，即為相應醇脫氫酶產生菌。初篩所得的菌株可再利用氣相色譜或液相色譜分析技術作進一步復篩確認。本發明的發明點如下(1)提供了一種醇脫氫酶的快速篩選鑑定方法，確定輔酶NADH和NADPH的激發和發射波長範圍及其最適值，並得到優化的篩選反應體系及參數。(2)通過確定溫度、ρΗ、助溶劑、底物與NAD(P)H螢光的關係，排除本發明在具體實施中NAD(P)H螢光的幹擾因素，使本發明適用性更廣。(3)利用96孔微孔板作為反應容器，利用輔酶螢光正向篩選醇脫氫酶，解決已有醇脫氫酶的篩選中時間過長，過程繁瑣，試劑用量大且成功率低等問題。(4)本發明提供一種同時適用於篩選具有立體選擇性的醇脫氫酶(底物為手性醇時)的方法。本發明的有益效果主要體現在本發明與已有的醇脫氫酶篩選方法相比，耗時短， 精確率高，所需反應試劑微量，具有高通量篩選的特點，並且反應體系簡單，操作過程簡便， 反應的幹擾因素少。

圖1為不同種類輔酶不同濃度下的螢光光譜圖；「□」表示NADH ；「▲」表示NADPH ； 「· 」表示 NADP+ ； 「 Δ 」 表示 NAD+ ；圖2為還原型輔酶NAD (P)H在發射光譜400 500nm的範圍內螢光光譜圖；「 □」 表示 NADH ；「▲」 表示 NADPH ；圖3為還原型輔酶NAD (P)H在激發光譜300 400nm的範圍內螢光光譜圖；「 □」 表示 NADH ；「▲」 表示 NADPH ；圖4為還原型輔酶NAD(P)H在不同溫度下的螢光光譜圖；「□」表示NADH ；「▲」表示 NADPH ；圖5為還原型輔酶NAD (P)H在不同pH下的螢光光譜圖；「 □」表示NADH ；「▲」表示 NADPH ；圖6為不同助溶劑對還原型輔酶NADH螢光強度的影響；「 □」代表未加助溶劑， 「曲』』代表加入10%的助溶劑，「 ■」代表加入20%的助溶劑，「國』』代表加入30%的助溶劑；圖7為編號為觀13的菌株氣相色譜結果；1、溶劑乙酸乙酯；2、苯乙酮；3、 (R)-I-苯乙醇；4、(S)-I-苯乙醇。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1 輔酶NADH和NADPH的激發與發射波長將還原型輔酶NADH和NADPH、氧化型輔酶NAD+和NADP+分別配製成從0. 01 ImM的不同濃度梯度的水溶液，取300 μ 1加入96孔微孔板中，在激發波長360nm，發射波長 460nm處測螢光強度，結果見圖1。由圖可知，在激發波長360nm和發射波長460nm下，還原型輔酶具有螢光，而氧化型輔酶不發射螢光。配製0. 5mM的NADH和NADPH水溶液，設定激發波長360nm，在發射光譜400 500nm的範圍內測其螢光值，得到螢光光譜圖，見圖2。由圖2可知，NADH和NADPH最適發射波長為460nm。另外，設定發射波長460nm，在激發光譜300 400nm的範圍內測其螢光值，得到螢光光譜圖，見圖3。由圖3可知，NADH最適激發波長為360nm，NADPH最適激發波長為350nm。實施例2 溫度、pH、有機溶劑、底物等與NAD (P) H螢光的關係(1)溫度與NAD(P)H螢光的關係配置0. 5mM的NAD (P)H水溶液，取300 μ 1分裝入96孔微孔板中，在4 70°C的溫度梯度內過夜放置16h，期間用保鮮膜封存，防止揮發對螢光值造成影響。在最適波長下分別測其螢光值，結果見圖4。由圖4可知，在此範圍內溫度對NADH的螢光值基本無影響； NADPH在高溫下自發螢光有所減弱，但是根據實施例1中圖1的結果分析，其螢光仍顯著。(2) pH與NAD(P)H螢光的關係用pH 7.0 10. 5的緩衝液配置0.5mM的NAD (P) H溶液，其中pH 7. 0、7. 5、8. 0為 50mM 的 Tris-HCl 溶液，pH 8. 5、9. 0、9. 5、10. 0、10. 5 為 50mM 的甘氨酸-NaOH 溶液。取不同pH的NAD (P) H溶液各300μ 1，30°C恆溫過夜放置16h，在最適波長下測其螢光值，結果見圖 5。在pH 7.0 10. 5範圍內，pH對NAD(P)H螢光沒有明顯影響。(3)助溶劑與NAD(P)H螢光的關係在0.5mM的NAD (P) H水溶液中加入不同濃度常用助溶劑(甲醇、二甲基亞碸、乙腈)，取300 μ 1加入96孔微孔板中，用保鮮膜封存防止揮發損失，30°C恆溫過夜放置16h， 在最適波長下測其螢光值，其中NADH的數據如圖6。由圖可知，幾種常見的助溶劑對其自發螢光值基本無影響，NADPH的結果基本與NADH —致。(4)底物NAD (P) H螢光的關係在0. 5mM的NAD (P) H水溶液中加入1. 0% (V/V)的各種常用醇脫氫酶底物，芳香醇以苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯為例；脂肪醇以乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羥基丁酸乙酯為例。取300 μ 1加入96孔微孔板中，用保鮮膜封存， 30°C恆溫過夜放置16h，在最適波長下測其螢光值，結果顯示螢光值均在4000 6000的範圍內，表明該方法對各種類型的醇具有普適性。在96孔微孔板中，分別加入pH 10. 5的50mM甘氨酸-NaOH緩衝液，然後往緩衝液中添加1.0% (ν/ν)的前述常用醇脫氫酶底物(乙醇、仲丁醇、4-氯-3-羥基丁酸乙酯、 1-苯乙醇或扁桃酸甲酯)，0. 5mM的輔酶NAD+，以及相應的醇脫氫酶(乙醇脫氫酶、仲醇脫氫酶、4-氯-3-羥基丁酸乙酯脫氫酶、芳香醇脫氫酶)，反應總體系為300 μ 1。將反應液體系在96孔微孔板中配置好後，用保鮮膜封存，30°C恆溫過夜放置16h，在最適波長下測其螢光值，在同等條件下以反應體系中不加入底物的反應液為對照，結果顯示與對照相比，所有樣本螢光強度增加值均大於400。實施例3 以1-苯乙醇為底物快速篩選醇脫氫酶產生菌取150 μ 1 1-苯乙醇塗布與LB平板上，吸收片刻，即為富集平板。稱取土樣(來源於湖北，內蒙古，山東等地)0. 5克，置於2ml離心管(含無菌水Iml)中，用無菌水1000 倍稀釋後取10(^1均勻塗布於富集平板，301培養4811。然後選取平板上形態不同的菌落接種於LB斜面上，30°C培養Mh。從所得斜面中取2接種環菌體在60 μ 1無滅菌水中，震蕩製成菌懸液，用於初篩。反應體系總體積為300 μ 1，分別包括pH 10.0的甘氨酸-NaOH緩衝液(總濃度50mM)、0. 5% (V/V)混旋1-苯乙醇、1. OmMNAD+和25 μ 1待測菌懸液。將配置好的反應液體系300 μ 1，加入96孔微孔板，保鮮膜封存，在30°C下反應1 後，在激發波長360nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。反應體系中不加底物苯乙醇作為對照，排除微生物可能由於自身存在能將NAD+還原成NADH的酶而影響篩選方法的準確性。對照在上述同等條件下反應並檢測螢光強度。選取反應液的螢光值與對照差值大於400以上的菌株作為醇脫氫酶產生菌。實施例4 以1-苯乙醇為底物快速篩選醇脫氫酶產生菌菌株富集方法與菌懸液製備方法與實施例3中所用方法相同。反應體系總體積為 300 μ 1，分別包括pH 9. 0的甘氨酸-NaOH緩衝液(總濃度50mM) U.0% (V/V)混旋1_苯乙醇、l.OmM NADPMO% (V/V) 二甲基亞碸、1.0% (W/V)溶菌酶和50 μ 1待測菌懸液。將配置好的反應液體系300 μ 1，加入96孔微孔板，保鮮膜封存，在30°C下反應他後，在激發波長350nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。反應體系中不加底物苯乙醇作為對照，排除微生物可能由於自身存在能將NADP+還原成NADPH的酶而影響篩選方法的準確性。對照在上述同等條件下反應並檢測螢光強度。選取反應液的螢光值與對照差值大於400以上的菌株作為醇脫氫酶產生菌。實施例5 以1-戊醇為底物快速篩選醇脫氫酶產生菌取150 μ 1 1-戊醇塗布與LB平板上，吸收片刻，即為富集平板。稱取土樣0. 5克， 置於2ml離心管(含無菌水Iml)中，用無菌水1000倍稀釋後取100 μ 1均勻塗布於富集平板，30°C培養48h。然後選取平板上形態不同的菌落接種於LB斜面上，30°C培養Mh。從所得斜面中取2接種環菌體在60 μ 1無滅菌水中，震蕩製成菌懸液，用於初篩。反應體系總體積為 300 μ 1，分別包括 pH 8. 0 的 50mM Tris-HCl 緩衝液、2. 0% (V/V) 1-戊醇、0. 8mM NAD+、 20% (V/V)甲醇、0. 5% (ff/V)溶菌酶和50 μ 1待測菌懸液。將配置好的反應液體系300 μ 1， 加入96孔微孔板，保鮮膜封存，在30°C下反應IMi後，在激發波長360nm和發射波長460nm 下檢測螢光強度。反應體系中不加底物苯乙醇作為對照，排除微生物可能由於自身存在能將NAD+還原成NADH的酶而影響篩選方法的準確性。對照在上述同等條件下反應並檢測螢光強度。選取反應液的螢光值與對照差值大於400以上的菌株作為醇脫氫酶產生菌。實施例6 氣相色譜方法復篩醇脫氫酶產生菌將實施例3和4中初篩後得到的菌株接種於LB培養基中，在30°C和200rpm下培養48h，取IOml菌液在6000rpm下離心lOmin，棄上清，所得菌體用與甘氨酸-NaOH緩衝液 (50mM,pH 10. 0)洗滌一次，6000rpm離心lOmin，棄上清。所得菌體中加入2ml甘氨酸-NaOH 緩衝液(50mM，pH 10. 0),5 μ 1 1-苯乙醇和40 μ 1的NAD+(40mM)，混勻。反應液在30°C和 200rpm下反應16h，然後反應液經過乙酸乙酯1 1萃取，萃取所得的有機相用於氣相色譜分析(色譜柱，CHIRASIL-DEX CB ；流速，0. 60ml/min ；分流比，1 50 ；140°C恆溫)。結果表明，從土壤中分離得到菌株214株，經實施例3和4的螢光檢測後，初篩得到44株醇脫氫酶產生菌，佔所測菌株總數的20. 6%。初篩所得的菌株經氣相色譜法復篩後，結果表明具有氧化1-苯乙醇活力的菌株為36株，佔初篩所得菌株的81. 8%，其中47%的菌株的底物對映體過量值在80 %以上。本發明從菌種分離、菌懸液製備、反應、螢光檢測到色譜驗證整個篩選過程時間跨度約為5天，一批次可處理上百個待測菌株，與已有篩選的方法比較，本發明不僅僅大大縮短了篩選時間，更重要的是大幅度地提高了篩選的成功率。實施例7 用於手性催化的醇脫氫酶產生菌的篩選從實施例6中隨意選取一株ee值大於80%的菌株，篩菌編號為觀13，氣相結果如圖7所示。以混旋1-苯乙醇為底物時，菌株觀13選擇性氧化(S)-I-苯乙醇生成苯乙酮，同時導致(R)-I-苯乙醇的對映體過量值大於80%。按照實施例3中的反應體系作96孔微孔板檢測，將底物分別替換為(S)-I-苯乙醇及(R)-I-苯乙醇，得到螢光值如表1所示。螢光檢測結果顯示，以(S)-I-苯乙醇為底物時反應液的螢光值顯著增高，比對照大2598. 396。 而以(R)-I-苯乙醇為底物的反應液螢光值，與對照相比，螢光組增加值只有約197，與實施例6中得到的氣相結果一致。因而，分別以S型和R型對映體作為底物，通過比較它們的反應液螢光值，本方法也可用於篩選具有立體選擇性醇脫氫酶活力的菌株。表1
權利要求
1.一種基於NAD (P) H螢光的醇脫氫酶的篩選鑑定方法，所述方法包括在96孔微孔板中，分別加入PH 7.0 8. 8的Tris-HCl或pH 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH緩衝液，然後往緩衝液中添加0. 1 % 2. 0 %的底物，0. 5 ImM的輔酶NAD+或NADP+，以及待測樣本，在 0 80°C下反應1 48h後，反應液在激發波長!MOnm 380nm和發射波長450nm 470nm 下檢測螢光強度，在同等條件下以反應體系中不加入底物的反應液為對照，與對照相比，螢光強度增加值大於400的樣本，即為含有對應醇脫氫酶的樣本；所述底物為C2 ClO的醇、 C6 ClO的芳香醇或C4 ClO的脂肪醇。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述樣本為分離自天然環境的微生物、基因工程菌、粗酶或純酶樣本。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述芳香醇為苯甲醇、1-苯乙醇、1-苯丙醇、扁桃酸甲酯。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述脂肪醇為乙醇、丙醇、戊醇、仲丁醇、仲戊醇、仲辛醇、4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於添加的輔酶為NAD+時，反應液在激發波長 360nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於添加的輔酶為NADP+時，反應液在激發波長 350nm和發射波長460nm下檢測螢光強度。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述緩衝液還添加有體積為緩衝液體積 10 30%的助溶劑，所述助溶劑為甲醇、二甲基亞碸或乙腈。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述緩衝液還添加有1 10g/L的溶菌酶。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述待測樣品為微生物菌株，所述方法如下(1)在固體培養基上塗上20 200μ 1底物，作為富集平板，稱取0. 1 1克土壤樣本， 溶於1 2ml無菌水中，充分混勻，再用無菌水稀釋1000 10000倍後塗布於富集平板，在 30或37°C下培養12 72h，挑選具有不同菌落形態特徵的菌株，接種於斜面，在30或37°C 下培養12 72h，從斜面上用接種環挑取2環菌體，用60 μ 1無菌水製成菌懸液，用於96孔板的微量反應體系；(2)在96孔微孔板中，分別加入pH7. 0 8. 8的Tris-HCl或pH 8. 8 10. 5的甘氨酸-NaOH緩衝液，然後往緩衝液中添加0. 1 % 2. 0%的底物，0. 5 ImM的輔酶NAD+或 NADP+，以及步驟(1)獲得的菌懸液，在20 50°C下反應10 24h後，反應液在激發波長 340nm 380nm和發射波長450nm 470nm下檢測螢光強度，在同等條件下以反應體系中不加入底物的反應液為對照，與對照相比，螢光強度增加值大於400的樣本，即為含有對應醇脫氫酶的樣本。
全文摘要
本發明提供了一種基於NAD(P)H螢光的醇脫氫酶的快速篩選鑑定方法，所述方法基於醇脫氫酶以NAD(H)或NADP(H)為輔酶的特性，以96孔微孔板為反應容器，在反應體系中加入待測樣本對醇進行氧化，在醇氧化的同時把不發射螢光的氧化型輔酶轉化成能在一定激發光激發下發射螢光的還原型輔酶NADH或NADPH，通過測定反應液螢光強度的變化來篩選醇脫氫酶產生菌。本發明與已有的醇脫氫酶產生菌篩選方法相比，耗時短，精確率高，所需反應試劑微量，具有高通量篩選的特點，並且反應體系簡單，操作過程簡便，反應的幹擾因素少。
文檔編號G01N21/64GK102517378SQ20111036389
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者應向賢, 楊池, 汪釗, 熊斌 申請人:浙江工業大學