生產達瑪二烯和原人參二醇的重組微生物及其構建方法

2023-06-13 04:07:46 2

專利名稱：生產達瑪二烯和原人參二醇的重組微生物及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種生產達瑪二烯和原人參二醇的重組微生物及其構建方法。
背景技術：
原人參二醇(Protopanoxadiol)是藥用植物人參中提取的三職阜苷元,達瑪二烯(Dammarenediol-II)為其生物合成的前體化合物。原人參二醇具有抗癌、抗抑鬱、激活氯離子通道和抑制鈉離子通道去極化的作用、抑制人胚腎HEK-293細胞和幽門螺旋桿菌生長等多種藥理活性。原人參二醇的糖基化產物人參二醇型人參皂苷類化合物，如人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3等在心腦血管，抗腫瘤等方面也有很好的藥理活性，這類化合物的相關產品已在臨床廣泛使用。當前人參皂苷類化合物的主要來源是通過中藥材人參中直接提取，但隨著開墾荒地、荒山伐林人參野生資源的生長環境遭到嚴重破壞，人參資源極度緊·張；人工種植過程中也遇到品種退化，大量的土地和人力成本等因素。人參皂苷類化合物產量已經遠不能滿足社會的需求，嚴重影響了人參的臨床應用和人參皂苷類製藥原料中間體的開發和應用，亟待需要提供新的資源途徑。目前利用合成生物學的原理，設計和改造微生物菌株來生產天然產物已被國際認為是一種最有潛力的方法，如在大腸桿菌中生產紫杉醇的前體紫杉二烯已達到1000mg/L(ParayiI Kumaran Ajikumar et al. , 2010, Science, 330:70-74);銀杏內酯類(Ginkgol ides)前體左旋海松二烯(Levopimaradiene),在改造後的大腸桿菌工程菌中達到700mg/L 的產量(Effendi Leonard et al.，2010，PNAS, 107 (31) : 13654 - 13659);在酵母工程菌中生產青蒿素(Artemisinin)的前體青蒿酸(Artemisinic acid)最高達到IOOmg/L(Dae-Kyun Ro etal. , 2006, Nature, 440:940-943);目前國內在青蒿素，紫杉醇和丹參酮等藥物分子的生物合成方面有相關研究。原人參二醇為人參植物體內萜類合成途徑的產物，由人參細胞中線粒體、細胞溶質和內質網存在的甲羥戊酸代謝途徑(MVA Pathway)與在質體中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛代謝途徑(MEP Pathway)共同合成。其中前體物質鯊烯(Squalene)為IPP和DMAPP經過法呢基焦磷酸合酶(FPS)和鯊烯合酶(SQS)共同催化得到，鯊烯可以被鯊烯環氧酶(SQE)和達瑪二烯合酶依次催化為達瑪二烯(dds)，達瑪二烯能被原人參二醇合成酶(pros)和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶(CPR)共同催化生成原人參二醇。作為傳統發酵工藝中常用菌株釀酒酵母在其體內存在生產萜類成分的甲羥戊酸途徑，其中產三萜類成分麥角留醇(Ergosterol)能達到生物量的4. 6%(Arnezeder, C. et al. , 1990, Biotechnollett.，12:277-282) ; 二萜香葉醯香葉醯醇(GGOH)也能達到 283mg/L(Tokuhiro, K. etal.，2009，Appl Environ Microbiol.，75:5536-5543)。由此，利用合成生物學的方法和技術在釀酒酵母中構建和優化相關生物合成途徑來生產達瑪二烯和原人參二醇具有很大潛力。

發明內容
本發明的一個目的是構建重組菌的方法。本發明提供的構建重組菌的方法，包括如下步驟向釀酒酵母中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒，得到重組菌I。上述向釀酒酵母中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒為通過同源重組的方法向釀酒酵母的rDNA位點中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒;所述同源重組的方法具體為向釀酒酵母中導入含有篩選標記基因A的rDNA位點上遊同源臂rDNA-LEU2-up (來源於質粒prDNA_LEU2 )、達瑪二烯合酶編碼基因表達盒PrcK1-PgDDS-TADHlt (來源於質粒pM14-PgDDS)、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒Ptefi-PgPPDS-Tcyci (來源於質粒pM3-PgPH)S)、煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒PTDH3-AtCPRl-Tmi (來源於質粒pMll-AtCPRl)和rDNA位點下遊同源臂 rDNA-down (來源於質粒 prDNA_LEU2)；上述含有篩選標記基因A的rDNA位點上遊同源臂rDNA-LEU2-up、達瑪二烯合酶編碼基因表達盒PrcK1-PgDDS-TADHlt、原人參二醇合成酶編碼基因表達、煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒PTDH3-AtCPRl-TTm、rDNA位點下遊同源臂rDNA-down的製備方法均見實施例2的I )，而各自片段來源的質粒的製備方法均見實施例I。上述方法中，所述篩選標記基因A為LEU2 ；所述達瑪二烯合酶編碼基因表達盒包括啟動子PGK1、達瑪二烯合酶編碼基因PgDDS、終止子 ADHlt ；所述原人參二醇合成酶編碼基因表達盒包括啟動子TEFl、原人參二醇合成酶編碼基因PgPPDS和終止子CYCl ；所述煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒包括啟動子TDH3、煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因AtCPRl和終止子TPII。上述方法還包括如下步驟提高所述重組菌I中的3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶的活性，得到重組菌2。上述方法中，所述提高所述重組菌I中的3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶的活性為向所述重組菌I中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒；上述向所述重組菌I中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒具體為通過同源重組向所述重組菌I的δ位點中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒；上述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌I中導入線性化的含有3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒的質粒P δ -tHMGl ；上述線性化質粒P δ-tHMGl的製備方法見實施例3，涉及的質粒P δ-tHMGl的製備方法見實施例I。
所述3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒進一步包括啟動子PGKU3羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因tHMGl和終止子ADHlt。上述方法還包括如下A-F中的任一一種A :提高所述重組菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌3 ；B :提高所述重組菌2中的鯊烯合酶的活性，得到重組菌4 ；C :提高所述重組菌2中的鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌5 ；D :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌6 ； E :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶和鯊烯合酶的活性，得到重組菌7 ；F :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶、鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌8。A :所述提高重組菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述向所述重組菌2中導入法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒為通過同源重組的方法實現；所述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌2中導入含有篩選標記基因B和所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒片段HIS3-PPGK1-ERG20-TADHlt (來源於質粒 pEHIS3_ERG20);所述 HIS3-Ppgk1-ERG20-T麗lt 的製備方法見實施例4，涉及的質粒pEHIS3-ERG20的製備方法見實施例I。B :所述提高重組菌2中的鯊烯合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ;所述向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A具體通過同源重組實現；所述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌2中導入含有所述篩選標記基因B和所述鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A片段HIS3-PrcK1-ERG9-TADHlt (來源於質粒 pEHIS3-ERG9) ；HIS3-PPGK1-ERG9-TADHlt 的製備方法見實施例 5，涉及的質粒 pEHIS3_ERG9的製備方法見實施例I。C :所述提高重組菌2中的鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒實現；上述同源重組進一步具體為向所述重組菌2中導入含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B Ptef1-ERG9-Tctc1、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒PPGK1-ERG20-TADHlt 和 Trpl 位點的下遊同源臂 Trp-down ；含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂(來源於質粒pTrp-HIS3)、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B (來源於質粒PM3-ERG9)、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒(來源於質粒PEHIS3-ERG20)和Trpl位點的下遊同源臂(來源於質粒pTrp_HIS3)的製備方法均見實施例6，涉及的質粒的製備方法見實施例I。D:所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶ERGl和法呢基焦磷酸合酶ERG20的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組的向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌2中導入含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A Ptefi-ERGI-Tctci、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒Praa-ERGZO-Tadh1P Trpl位點的下遊同源臂Trp-down ；含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up (來源於質粒pTrp-HIS3)、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A Ptefi-ERGI-Tctci(來源於質粒pM13_ERGl)、·法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒PrcK1-ERG20-TADHlt (來源於質粒pEHIS3_ERG20)、Trpl位點的下遊同源臂Trp-down(來源於質粒pTrp_HIS3)的製備方法均見實施例7,涉及的質粒的製備方法見實施例I。E:所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶和鯊烯合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ;所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ;所述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌2中導入含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up (來源於質粒pTrp_HIS3)、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A Ptefi-ERGI-Tcyci (來源於質粒pM13_ERGl)、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A Pj^-ERGg-I^mt (來源於質粒pEHIS3_ERG9)、Trpl位點的下遊同源臂Trp-down (來源於質粒 pTrp_HIS3)；含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up、鯊烯環氧酶編碼基因 ERGl 表達盒 A Ptefi-ERGI-Tctci、鯊烯合酶編碼基因 ERG9 表達盒 A Ppgki-ERGQ-Tadhio Trpl位點的下遊同源臂Trp-down的製備方法均見實施例8,涉及的質粒的製備方法見實施例I。F :所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶、鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述同源重組的方法進一步具體為向所述重組菌2中導入含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up (來源於質粒pTrp_HIS3)、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒BPtdh3-ERGI-Ttpii (來源於質粒 pMll-ERGl)、鯊烯合酶編碼基因 ERG9 表達盒 B Ptefi-ERG9-TCYC1(來源於質粒PM3-ERG9)、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒PrcK1-ERG20-TADHlt (來源於質粒pEHIS3-ERG20)、Trpl位點的下遊同源臂Trp-down (來源於質粒pTrp_HIS3)；含有篩選標記基因B的Trpl位點的上遊同源臂Trp-HIS3-up、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B PTDH3-ERG1-TTPI1、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B PTEF1-ERG9_TCTC1、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒Ppm-ERGZO-I^mt、Trpl位點的下遊同源臂Trp-down的製備方法均見實施例9，涉及的質粒的製備方法見實施例I。所述篩選標記基因B進一步具體為HIS3 ；所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒進一步具體包括啟動子PGK1、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20和終止子ADHlt ；
所述鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A進一步具體包括啟動子PGKl、鯊烯合酶編碼基因ERG9和終止子ADHlt ；所述鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B進一步具體包括啟動子TEFl、鯊烯合酶編碼基因ERG9和終止子CYCl ；所述鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A進一步具體包括啟動子TEFl、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl和終止子CYCl ； 所述鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B進一步具體包括啟動子TDH3、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl和終止子TPII。上述方法中，所述編碼基因PgDDS的核苷酸序列為序列表中的序列I ;
所述編碼基因PgPros的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述編碼基因AtCPRl的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述編碼基因ERG20的核苷酸序列為序列表中的序列4 ；所述編碼基因ERG9的核苷酸序列為序列表中的序列5 ；所述編碼基因ERGl的核昔酸序列為序列表中的序列6 ；所述編碼基因tHMGl的核苷酸序列為序列表中的序列7 ；所述啟動子PGKl的核苷酸序列為序列表中的序列8 ；所述啟動子TEFl的核苷酸序列為序列表中的序列9 ；所述啟動子TDH3的核苷酸序列為序列表中的序列10 ；所述終止子CYCl的核苷酸序列為序列表中的序列11 ;所述終止子ADHlt的核苷酸序列為序列表中的序列12 ；所述終止子TPIl的核苷酸序列為序列表中的序列13 ；所述HIS3的核苷酸序列為序列表中的序列14 ；所述LEU2的核苷酸序列為序列表中的序列15。上述釀酒酵母具體為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。由上述的方法得到的重組菌I也是本發明保護的範圍；或由上述的方法得到的重組菌2也是本發明保護的範圍；或由上述的方法得到的重組菌3、重組菌4、重組菌5、重組菌6、重組菌7或重組菌8也是本發明保護的範圍。上述重組菌I、所述重組菌2或所述重組菌3-8中任意一種在生產達瑪二烯和/或原人參二醇中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的另一個目的是提供一種生產達瑪二烯和/或原人參二醇的方法。本發明提供的方法，為發酵上述重組菌I、所述重組菌2或所述重組菌3-8中任意一種，得到達瑪二烯和/或原人參二醇。上述發酵採用的培養基為液體培養基，其中各組分及其終濃度如下終濃度為1%(質量百分含量)Yeast Extract (酵母膏)、終濃度為2% (質量百分含量)Peptone (蛋白腖)、終濃度為2% (質量百分含量)Dextrose (葡萄糖)，用水補足體積；固體培養基需再加2%瓊脂粉。上述發酵的條件為30°C，250rpm/min、振蕩培養8天。本發明中涉及的蛋白和基因的名稱具體如下
ERG9為酵母藍烯合酶基因名，其編碼的酶為藍烯合酶(Squalene synthase)；ERG20為酵母法呢基焦磷酸合酶基因名，其編碼的酶為法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；
ERGl為酵母鯊烯環氧酶基因名，其編碼的酶為鯊烯環氧酶(Squaleneepoxidase)；pgDDS為來源於人參的達瑪二烯合酶編碼基因，其編碼的蛋白為達瑪二烯合酶(Dammarenediol-II synthase)；pgPPDS為來源於人參的原人參二醇合成酶編碼基因，其編碼的蛋白為原人參二醇合成酶(Protopanaxadiol synthase)；AtCPRl為來源於擬南芥的煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶I編碼基因，其編碼的蛋白為煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶(NADPH-cytochrome P450reductase)；tHMGl為來源於部分釀酒酵母的3-羥基_3_甲基戊二醯輔酶A還原酶I編碼基因，具體為釀酒酵母的3-輕基-3-甲基戍二醯輔酶A還原酶l(3-hydroxyl-3-methylglutaryl-CoA reductase)截取5』部分序列的功能蛋白。所述PGKl啟動子為釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶啟動子。所述TDH3啟動子為釀酒酵母的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子。所述TEFl啟動子為釀酒酵母的翻譯延伸因子I啟動子。所述δ位點為釀酒酵母染色體上多個δ基因中的1-10個隨機位置。所述rDNA位點為釀酒酵母染色體上多個核糖體基因中的1_10個隨機位置。所述HIS3位點為釀酒酵母染色體上組氨酸生物合成途徑中HIS3基因位置。所述Trpl位點為釀酒酵母染色體上色氨酸生物合成途徑中Trpl基因位置。本發明的實驗證明，本發明通過同源重組的手段，將PgDDS、AtCPRl和PgPTOS均導入釀酒酵母中得到初始重組菌，發現其可產生微量的達瑪二烯和原人參二醇；再提高初始重組菌的tHMGl的活性，得到中間重組菌，其達瑪二烯和原人參二醇產量明顯提高；在中間重組菌的基礎上又提高其ERG1、ERG9和ERG20 —個或者兩個或者三個的活性，發現也能構建出達瑪二烯和原人參二醇產量提高的重組菌；為人工合成達瑪二烯和原人參二醇奠定了基礎。


圖I為達瑪二烯GC-MS分析圖2為原人參二醇LC-MS分析圖3為工程菌株中達瑪二烯和原人參二醇含量分析
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、基因兀件克隆和含有對應基因原件的質粒構建一、基因元件的克隆分為以下三步
(I)酵母基因組DNA提取挑取釀酒酵母BY4742 (Saccharomyces cerevisiaeBY4742,記載在 Carrie bakerbrachmann et al.，1998，YEAST, 14:115 - 132,公眾可從天津工業生物技術研究所和中國中醫科學院中藥研究所獲得。)菌斑於YH)液體培養基(配方l%Yeast Extract (酵母膏)，2%Peptone (蛋白腺)，2%Dextrose (葡萄糖))中，30 °C, 200rpm,培養 24h。10000g,5 分鐘收集菌體於I. 5ml離心管中，水清洗兩次，菌體重懸於酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇緩衝液，5ul β -ME), 30°C溫浴Ih後離心；菌體用500ul TENTS緩衝液(IOmMTris-HCl,pH 7. 5 ； ImM EDTA, pH8. 0 ； IOOmM NaAc ；2%triton-100 ；1%SDS)重懸，60°C 水浴Ih ;酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍體積的EtOH，1/10倍體積的3M NaAc, -20°C冰箱放置2h ;13000g，4°C，離心lOmin，倒掉上清，沉澱用709ffit0H，洗劑沉澱2次後吹乾，雙蒸水溶解，-20°C保存備用，得到酵母基因組DNA。 (2)人參cDNA和擬南芥cDNA的獲得
總RNA提取分別收集人參細胞(人參的愈傷組織細胞，Juan Wang etal. , 2013, Industrial Crops and Products. 41:57-63,公眾可從天津工業生物技術研究所和中國中醫科學院中藥研究所獲得。)組織(用茉莉酸甲酯誘導24小時)和新鮮擬南芥(col-0 生態型；Athanasios Theologis et al. , 2000, Nature 408 :816_820，公眾可從天津工業生物技術研究所和中國中醫科學院中藥研究所獲得。)葉片各200mg用液氮研磨後CTAB法提取總RNA :在I. 5ml離心管中加入Iml 2*CTAB提取液，65°C預熱之後，加入20 μ I2-ΜΕ ;加入少量粉末(約50mg)，混合均勻，65°C保溫IOmin,搖勻5次；4°C，12000rpm離心IOmin,移出上清,用等體積的氯仿/異戍醇抽提；4°C, 12000rpm離心IOmin,移出上清,用等體積的氯仿/異戍醇抽提；4°C, 12000rpm離心IOmin,移出上清,用1/6體積的氯仿/異戍醇抽提；4°C，15000rpm離心30min，移出上清，加入1/4體積的10mol/L LiCl，4°C放置過夜；40C，15000rpm離心30min，棄去上清，用75%乙醇洗滌沉澱2次，無水乙醇洗滌沉澱I次，超淨臺放置15min (室溫)；用2(^1 milliQ DEPC處理水溶解，加入1/10體積的2mol/L NaAC(pH4. 0)，加入2體積的無水乙醇，_20°C放置2h ;4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，沉澱用75%乙醇洗滌兩次，無水乙醇洗滌沉澱I次；超淨臺放置15min(室溫)，加15μ I milliQDEPC處理水使沉澱充分溶解，-70°C保存。第一鏈反轉錄-PCR :取無RNA酶PCR管，按第一鏈反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)配備體系Radom 6Mers 2ul、dNTP lul、total RNA Iul (200ng)、H206ul、TotallOul、瞬間離心，PCR 65°C 5min,冰上急冷；再加入以下體系中反應液5*primerBuffer 4ul、RNAs Inhibiter O. 5ul> R-Transcription lul、H20 4. 5ul,瞬間離心，PCR 儀進行反應30°C 10min、42°C 60min、70°C 15min、4°C保溫。分別得到人參細胞cDNA和擬南芥cDNA。(3) PCR擴增及克隆基因元件以酵母基因組DNA為模板，用引物列表I中引物，擴增tHMGl、ERG20、ERG9、ERGl ；以人參細胞cDNA為模板擴增PgDDS基因和PgPPDS基因；以擬南芥cDNA為模板擴增 AtCPRl 基因。擴增體系為NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer IOul> dNTP(IOmMeach dNTP) lul、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 lul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (2. 5U/ul) 0. 5ul、補加蒸懼水至總體積 50ul。
表I引物序列
權利要求
1.一種構建重組菌的方法，包括如下步驟向釀酒酵母中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒，得到重組菌I。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述向釀酒酵母中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒為通過同源重組向釀酒酵母的rDNA位點中導入達瑪二烯合酶編碼基因表達盒、原人參二醇合成酶編碼基因表達盒和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒； 所述達瑪二烯合酶編碼基因表達盒進一步具體包括啟動子PGKl、達瑪二烯合酶編碼基因PgDDS、終止子ADHlt ； 所述原人參二醇合成酶編碼基因表達盒進一步具體包括啟動子TEF1、原人參二醇合成酶編碼基因PgPPDS和終止子CYCl ； 所述煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因表達盒進一步具體包括啟動子TDH3、煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因AtCPRl和終止子 TPI1。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於所述方法還包括如下步驟提高所述重組菌I中的3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶的活性，得到重組菌2。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述提高所述重組菌I中的3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶的活性為向所述重組菌I中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因的表達盒； 所述向所述重組菌I中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒具體為通過同源重組向所述重組菌I的S位點中導入3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因表達盒； 所述3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶I編碼基因表達盒進一步具體包括啟動子PGK1、3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶編碼基因tHMGl和終止子ADHlt。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述方法還包括如下A-F中的任一一種 A :提高所述重組菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌3 ； B :提高所述重組菌2中的鯊烯合酶的活性，得到重組菌4 ； C :提高所述重組菌2中的鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌5 ； D :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌6 ； E :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶和鯊烯合酶的活性，得到重組菌7 ； F :提高所述重組菌2中的鯊烯環氧酶、鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組菌8。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於 A :所述提高重組菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒； 所述向所述重組菌2中導入法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體為通過同源重組的方法實現；B :所述提高重組菌2中的鯊烯合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ;所述向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A具體通過同源重組實現； C :所述提高重組菌2中的鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒； 所述向所述重組菌2中導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒實現；D:所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒；所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組的向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒； E:所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶和鯊烯合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ； 所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A和鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A ； F :所述提高重組菌2中的鯊烯環氧酶、鯊烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性為向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒； 所述向所述重組菌2中導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒具體通過同源重組向所述重組菌2的Trpl位點導入鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B、鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B和法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒； 所述法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20表達盒進一步具體包括啟動子PGK1、法呢基焦磷酸合酶編碼基因ERG20和終止子ADHlt ； 所述鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒A進一步具體包括啟動子PGK1、鯊烯合酶編碼基因ERG9和終止子ADHlt ； 所述鯊烯合酶編碼基因ERG9表達盒B進一步具體包括啟動子TEFl、鯊烯合酶編碼基因ERG9和終止子CYCl ； 所述鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒A進一步具體包括啟動子TEF1、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl和終止子CYCl ； 所述鯊烯環氧酶編碼基因ERGl表達盒B進一步具體包括啟動子TDH3、鯊烯環氧酶編碼基因ERGl和終止子TPII。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於 所述編碼基因PgDDS的核昔酸序列為序列表中的序列I ; 所述編碼基因PgPPDS的核苷酸序列為序列表中的序列2 ； 所述編碼基因AtCPRl的核昔酸序列為序列表中的序列3 ；所述編碼基因ERG20的核昔酸序列為序列表中的序列4 ； 所述編碼基因ERG9的核昔酸序列為序列表中的序列5 ； 所述編碼基因ERGl的核昔酸序列為序列表中的序列6 ； 所述編碼基因tHMGl的核昔酸序列為序列表中的序列7 ； 所述啟動子PGKl的核苷酸序列為序列表中的序列8 ； 所述啟動子TEFl的核苷酸序列為序列表中的序列9 ； 所述啟動子TDH3的核苷酸序列為序列表中的序列10 ； 所述終止子CYCl的核苷酸序列為序列表中的序列11 ； 所述終止子ADHlt的核苷酸序列為序列表中的序列12 ； 所述終止子TPIl的核苷酸序列為序列表中的序列13。
8.由權利要求I或2所述的方法得到的重組菌I; 或由權利要求3或4所述的方法得到的重組菌2 ； 或由權利要求5-7中任一所述的方法得到的重組菌3、重組菌4、重組菌5、重組菌6、重組菌7或重組菌8。
9.權利要求8所述重組菌I、所述重組菌2或所述重組菌3-8中任意一種在生產達瑪二烯和/或原人參二醇中的應用。
10.一種生產達瑪二烯和/或原人參二醇的方法，為發酵權利要求8所述重組菌I、所述重組菌2或所述重組菌3-8中任意一種，得到達瑪二烯和/或原人參二醇。
全文摘要
本發明公開了一種生產達瑪二烯和原人參二醇的重組微生物及其構建方法。本發明提供的一種構建重組菌的方法，包括如下步驟向釀酒酵母中導入達瑪二烯合酶、原人參二醇合成酶和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因，得到重組菌1。本發明通過同源重組的手段，將達瑪二烯合酶、原人參二醇合成酶和煙醯胺腺嘌呤二核苷磷酸-細胞色素P450還原酶編碼基因均導入釀酒酵母中得到初始重組菌，發現其可產生微量的達瑪二烯和原人參二醇；再提高初始重組菌的tHMG1的活性，得到中間重組菌，其達瑪二烯和原人參二醇產量明顯提高；在中間重組菌的基礎上又提高其ERG1、ERG9和ERG20一個或者兩個或者三個的活性，發現也能構建出達瑪二烯和原人參二醇產量提高的重組菌；為人工合成達瑪二烯和原人參二醇奠定了基礎。
文檔編號C12N1/19GK102925376SQ20121045341
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月13日 優先權日2012年11月13日
發明者張學禮, 黃璐琦, 戴住波, 劉怡, 張夏楠, 施明雨, 馬延和 申請人:天津工業生物技術研究所, 中國中醫科學院中藥研究所