生物螢光顯微檢測儀器的製作方法

2023-06-13 05:16:51

專利名稱：生物螢光顯微檢測儀器的製作方法
技術領域：
本發明涉及顯微檢測儀器設計及製造領域，尤其是涉及ー種生物螢光顯微檢測儀器。
背景技術：
全內反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術各有優缺點全內反射顯微成像具有很高的軸向解析度，但其橫向解析度較低；共聚焦顯微成像具有很高的橫向解析度，但其軸向解析度較差。如何在一臺顯微鏡中同時利用全內反射顯微成像高的軸向解析度和共聚焦顯微成像高的橫向解析度尤為重要。
發明專利申請CN201080024155.9中提出了將全內反射螢光圖像和共焦圖像簡單且正確地重合的圖像處理裝置、程序和顯微鏡，該發明中包含了兩套顯微鏡，一套是全內反射顯微鏡，另ー套是共聚焦顯微鏡，但兩套顯微鏡是分開工作的，通過光路切換的方法先獲得一套顯微鏡的圖像，再獲得另一套顯微鏡的圖像，最後計算機再利用兩套圖像中的基準點將兩套圖像進行了重合。該方法雖然生成了全內反射螢光圖像和共焦圖像的重合圖像，由於兩種顯微鏡是先後工作的，在物理上並不能同時得到三維高解析度圖像；另外該發明要先後操作兩個顯微鏡拍攝圖像，並要對圖像進行重合，顯微鏡結構比較複雜，控制系統的構成也比較複雜。

發明內容
本發明的目的是提供ー種集成全內反射顯微成像技術和共聚焦顯微成像技術的生物螢光顯微檢測儀器，該生物螢光顯微檢測儀器在橫向及軸向上具有很高的解析度。本發明的技術方案是生物螢光顯微檢測儀器包括激發光照明単元、激發光和螢光隔離單元、雷射掃描単元、顯微成像単元、螢光探測單元及控制單元；所述激發光照明單元包括雷射光源、第一擴束鏡及第ニ擴束鏡；所述第一擴束鏡及第ニ擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位於所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發光和螢光隔離單元包括激發光濾色片、二色鏡及螢光濾色片；所述雷射掃描單元包括可繞X軸做往返旋轉運動的X掃描振鏡組件及可繞Y軸做往返旋轉運動的Y掃描振鏡組件；所述顯微成像単元包括掃描透鏡、筒鏡、環形光束整形組件及顯微物鏡，所述環形光束整形組件包括設於所述顯微物鏡入瞳位置的環形濾光片，所述環形濾光片具有將雷射截止的內環區域和透射雷射的環帶區域，且所述內環區域和環帶區域均可透射螢光；所述內環區域的半徑不小於剛好能發生全內反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述顯微物鏡的入瞳位置與所述X掃描振鏡組件的反射面和Y掃描振鏡組件的反射面沿光軸線的中間位置相共軛；所述螢光探測單元包括成像鏡頭及光電倍增管，所述成像鏡頭與所述光電倍増管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位於所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處於共軛位置上；所述光電倍増管可探測螢光，並將所述螢光轉換成電信號；所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發光濾色片、二色鏡、雷射掃描單元、掃描透鏡、筒鏡、環形濾光片及顯微物鏡依次沿始於所述雷射光源的光軸線設置；且所述顯微物鏡、環形濾光片、筒鏡、掃描透鏡、雷射掃描單元、二色鏡、螢光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始於由待觀察對象激發的螢光光軸線設置；所述控制単元，與所述雷射掃描單元和所述光電倍増管均電性連接，用於同步採集所述電信號與所述雷射掃描單元的位置坐標並進行關聯，以生成待觀察對象區域圖像。下面對上述技術方案進ー步解釋所述環帶區域的寬度可調節。所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡。
所述控制單元還與所述雷射光源電性連接，用於控制雷射的波長和功率。本發明的優點是I.本發明提供的生物螢光顯微檢測儀器在第一擴束鏡及第ニ擴束鏡之間且位於第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，在成像鏡頭和光電倍增管之間且位於成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向解析度；同時，在位於顯微物鏡入瞳的位置設置環形光束整形組件，提高了該生物螢光顯微檢測儀器在軸向的解析度。2.本發明提供的生物螢光顯微檢測儀器由於入射雷射光束經顯微成像單元聚焦在區域面積約為艾利斑大小的點狀區域內，即只有一個面積很小厚度很薄區域內的螢光物質能夠被激發，而其它區域內的螢光物質不會被激發，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而具有很高的成像信噪比。


圖I為本發明實施例提供的生物螢光顯微檢測儀器結構示意圖。圖2為本發明實施例提供的環形濾光片的結構示意圖。圖3為本發明實施例提供的環形光束通過顯微物鏡的光路傳播示意圖。圖4為本發明實施例提供的雷射掃描單元的結構示意圖。其中激發光照明単元110、雷射光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113、照明針孔114、激發光和螢光隔離單元120、激發光濾色片121、二色鏡122、螢光濾色片123、雷射掃描單元130、X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132、顯微成像單元140、掃描透鏡141、筒鏡142、環形光束整形組件143、顯微物鏡144、環形濾光片1432、螢光探測單元150、成像鏡頭151、光電倍增管152、成像探測針孔153、控制單元160。
具體實施例方式請參考圖I至圖4。圖I中標有單向箭頭的光路為雷射傳播光路；標有雙向箭頭的光路表不為突光傳播光路。實施例生物螢光顯微檢測儀器100包括激發光照明単元110、激發光和螢光隔離單元120、雷射掃描單元130、顯微成像單元140、螢光探測單元150及控制單元160。激發光照明單元110包括雷射光源111、第一擴束鏡112、第二擴束鏡113。在第一擴束鏡112和第二擴束鏡113之間且位於第一擴束鏡112的焦點處設有照明針孔114。激發光和螢光隔離單元120包括激發光濾色片121、二色鏡122、螢光濾色片123。激發光濾色121片用於接收雷射，濾除雷射中偏離中心波長的光束，並透射雷射中中心波長處的光束。二色鏡122接收並反射經激發光濾色片121透射的雷射，並透射螢光。螢光濾色片123接收並透射經二色鏡122透射的螢光，並截止雷射。雷射掃描單元130包括X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132。X掃描振鏡組件131可繞X軸做往返旋轉運動。Y掃描振鏡組件132可繞Y軸做往返旋轉運動，隨著X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132的旋轉運動，入射雷射束反射後的角度也將隨之改變。顯微成像單元140包括掃描透鏡141、筒鏡142、環形光束整形組件143、顯微物鏡144。環形光束整形組件143包括環形濾光片1432。該環形濾光片1432設置於顯微物鏡144的入瞳位置，具有將雷射截止的內環區域A和透射雷射的環帶區域B。內環區域A和環帶區域B均可透射螢光。顯微物鏡144的入瞳位置與X掃描振鏡組件131的反射面和Y掃描振鏡組件132的反射面沿光軸線的中間位置相共軛，即X掃描振鏡組件和Y掃描振鏡組件置於零視場角位置時圖4中過M點垂直光軸的位置與顯微物鏡144入瞳位置共軛。螢光探測單元150包括成像鏡頭151、光電倍增管152。在成像鏡頭151與光電倍 增管152之間且位於成像鏡頭151的焦點處設有成像探測針孔153。待觀察對象與照明針孔114和成像探測針孔153處於共軛位置上。光電倍增管152可探測螢光，並將螢光轉換成電信號。其中，第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113、激發光濾色片121、二色鏡
122、雷射掃描單元130、掃描透鏡141、筒鏡142、環形濾光片1432、顯微物鏡144依次沿始於雷射光源111的光軸線設置；顯微物鏡144、環形濾光片1432、筒鏡142、掃描透鏡141、雷射掃描單元130、二色鏡122、螢光濾色片123、成像鏡頭151、成像探測針孔153、光電倍增管152依次沿始於待觀察對象激發的螢光光軸線設置。雷射光源111發射的準直雷射依次經第一擴束鏡112、照明針孔114、第二擴束鏡113擴束後形成平行的雷射束；該平行雷射束依次經激發光濾色片121、二色鏡122、雷射掃描単元130、掃描透鏡141、筒鏡142後經環形光束整形組件143整形為環形光束，該環形光束經顯微物鏡144聚集於待觀察對象處，並激發待觀察對象產生螢光；該螢光光束依次經顯微物鏡144、環形濾光片1432、筒鏡142、掃描透鏡141、雷射掃描單元130、二色鏡122、螢光濾色片123、成像鏡頭151後聚焦於成像探測針孔153處，光電倍增管152探測該螢光束並將其轉換成電信號。控制單元160與雷射掃描單元130、光電倍增管152電性連接，控制單元160將光電倍增管152輸出的微弱電信號進行放大，並對放大後的電信號進行實時採樣，同時控制X掃描振鏡組件131、Y掃描振鏡組件132沿X、Y軸往返旋轉，使得經顯微物鏡144形成的聚焦雷射點在X、Y方向能夠移動。控制單元160將採集到電信號和雷射掃描單元130Χ、Y方向的位置坐標關聯起來，生成了ー個區域中螢光物質的圖像。控制單元160還電性連接於雷射光源111，用於控制入射雷射波長和功率。在該生物螢光顯微檢測儀器100中，顯微物鏡144為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡，由於環形光束的內環半徑(圖2中A區域的半徑)不小於顯微物鏡144剛好能發生全內反射時入瞳位置處光束的臨界半徑，且蓋玻片200和油300的折射率大致相同，這樣進入顯微物鏡144的環形光束在蓋玻片200和待觀察對象所在的組織溶液400的交界處發生全反射，不能透過蓋玻片200進行傳播，但會在蓋玻片200和組織溶液400的交界處形成隱失場(圖3中C區)，隱失波能夠激發界面附近的螢光分子，產生螢光。調整環形濾光片1432環帶區域B的寬度可以改變穿出蓋玻片200的隱失場的分布深度，從而可以改變螢光物質在Z軸方向的激發深度，可以實現Z軸方向不同解析度的調節。隱失波的頻率與入射光頻率相同，其強度(単位面積和單位時間的能量)隨離開界面的垂直距離呈指數衰減I (z) = I (O) e_z/d可以看出，透射電磁場的振幅隨進入樣品的深度z減小得非常快，這種電磁場只存在於界面附近ー薄層內。d是理論滲透深度，等於從界面處到隱失波強度衰減到界面處數值Ι/e的距離，d可表示為d = ( λ 0/4 31) Cn12Sin2 θ -η22)_1/2d與入射角(Θ )、波長λ ^以及組織溶液400折射率(η2)和蓋玻片200的折射率(Ii1)有夫。d隨入射角増大而減小，大小與入射光波長為同一數量級或更小。由於隱失場 的獨特特性，使螢光激發的區域非常靠近分界面(約IOOnm)。這樣不會激發距分界面更遠區域的螢光，從而可實現背景噪聲極小的螢光成像，使得生物螢光顯微檢測儀器100在軸向具有很高的解析度。在該生物螢光顯微檢測儀器100中，通過照明針孔114及成像探測針孔153的聯合使用，實現點對點的照明和點對點的成像。當不考慮噪聲的情況下，光學上常用點擴散函數描述系統成像解析度，對於雷射掃描共焦系統來說，系統最終的點擴散函數由下式描述PSFtot (x, y, z) = PSFill (x, y, z) · PSFdet (x, y, z)其中PSFill對應照明雷射點在物方的點擴散函數，PSFdet對應成像探測光路的點擴散函數。由於照明針孔114的作用，入射雷射光束通過各單元後在蓋玻片200與待觀察對象交界處形成一個很小的點狀照明區域(照明方點擴散函數)，成像探測針孔153的使用對成像探測方點擴散函數進ー步整形，使得整個生物螢光顯微檢測儀器100的成像點擴散函數由照明方點擴散函數和探測方點擴散函數的乘積組成，由於乘積後的成像點擴散函數強度分布範圍變窄，因而系統具有很高的橫向解析度。在該生物螢光顯微檢測儀器100中由於入射雷射光束經顯微成像単元140聚焦在區域面積約為艾利斑大小的點狀區域內，即只有一個面積很小厚度很薄區域內的螢光物質能夠被激發，而其它區域內的螢光物質不會被激發，即從源頭上消除了雜散光的來源，因而系統具有很高的成像信噪比。當然本發明的生物螢光顯微檢測儀器還可具有多種變換及改型，並不局限於上述實施方式的具體結構。總之，本發明的保護範圍應包括那些對於本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
權利要求
1.一種生物螢光顯微檢測儀器，其特徵在於，包括激發光照明單元、激發光和螢光隔離單元、雷射掃描單元、顯微成像單元、突光探測單元及控制單元； 所述激發光照明單兀包括雷射光源、第一擴束鏡、第二擴束鏡；第一擴束鏡、第二擴束鏡之間設有照明針孔，且所述照明針孔位於所述第一擴束鏡的焦點處；所述激發光和螢光隔離單元包括激發光濾色片、二色鏡、螢光濾色片；所述雷射掃描單元包括可繞X軸做往返旋轉運動的X掃描振鏡組件、可繞Y軸做往返旋轉運動的Y掃描振鏡組件；所述顯微成像單元包括掃描透鏡、筒鏡、環形光束整形組件、顯微物鏡，所述環形光束整形組件包括設於所述顯微物鏡的入瞳位置的環形濾光片，所述環形濾光片具有將雷射截止的內環區域和透射雷射的環帶區域，該內環區域和環帶區域均可透射螢光；所述內環區域的半徑不小於剛好能發生全內反射時所述顯微物鏡入瞳位置的臨界半徑；所述顯微物鏡的入瞳位置與所述X掃描振鏡組件的反射面和Y掃描振鏡組件的反射面沿光軸線的中間位置相共軛；所述螢光探測單元包括成像鏡頭、光電倍增管，該成像鏡頭與所述光電倍增管之間設有成像探測針孔，所述成像探測針孔位於所述成像鏡頭的焦點處；待觀察對象與所述照明針孔和成像探測針孔處於共軛位置上；所述光電倍增管可探測螢光，並將所述螢光轉換成電信號； 所述第一擴束鏡、照明針孔、第二擴束鏡、激發光濾色片、二色鏡、雷射掃描單元、掃描透鏡、筒鏡、環形濾光片及顯微物鏡依次沿始於所述雷射光源的光軸線設置，且所述顯微物鏡、環形濾光片、筒鏡、掃描透鏡、雷射掃描單元、二色鏡、螢光濾色片、成像鏡頭、成像探測針孔及光電倍增管依次沿始於由待觀察對象激發的螢光光軸線設置； 所述控制單元與雷射掃描單元、光電倍增管均電性連接，用於同步採集所述電信號與所述雷射掃描單元的位置坐標並進行關聯，以生成待觀察對象區域圖像。
2.根據權利要求I所述的生物螢光顯微檢測儀器，其特徵在於，所述環帶區域的寬度可調節。
3.根據權利要求I所述的生物螢光顯微檢測儀器，其特徵在於，所述顯微物鏡為無窮遠消像差型大數值孔徑的浸油物鏡。
4.根據權利要求I所述的生物螢光顯微檢測儀器，其特徵在於，所述控制單元還與所述雷射光源電性連接，用於控制雷射的波長和功率。
全文摘要
本發明提供的生物螢光顯微檢測儀器包括激發光照明單元、激發光和螢光隔離單元、雷射掃描單元、顯微成像單元、螢光探測單元及控制單元。激發光照明單元的第一擴束鏡及第二擴束鏡之間且位於第一擴束鏡的焦點處設有照明針孔，螢光探測單元的成像鏡頭和光電倍增管之間且位於成像鏡頭的焦點處設有成像探測針孔，有效提高了該儀器的橫向解析度；同時，在顯微成像單元的顯微物鏡入瞳的位置設置環形光束整形組件，提高了該生物螢光顯微檢測儀器的軸向解析度。
文檔編號G02B21/36GK102818795SQ201210255748
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者張運海, 張欣, 黃維, 昌劍, 薛曉君 申請人:蘇州生物醫學工程技術研究所