噬菌蛭弧菌的提純及其製劑的生產方法
2023-06-13 19:18:36
專利名稱：噬菌蛭弧菌的提純及其製劑的生產方法
技術領域：
本發明屬於生物製品技術領域，涉及一種噬菌蛭弧菌的提純及其生物製劑的生產方法。
現有技術中用於製造噬菌蛭弧菌生物製劑的蛭弧菌，是從自然環境中分離、並在菌種保藏單位保藏，由於從自然環境分離蛭弧菌的過程中，蛭弧菌的雜菌很難去除，因此其生物製劑中含有一定數量的雜菌，從而影響產品質量。並且菌種耐溫能力差，需經耐溫培養，從而造成生產成本的升高。中國專利局公開的申請號為93111749.6專利申請，公開了一種名稱為生物制菌王及其生產方法的專利申請文件，提供了一種利用噬菌蛭弧菌生產的生物製劑和該生物製劑的生產方法，該生產方法，是用蛭弧菌常規培養方法製取培養物，選擇25-30攝氏度的環境中在自來水雙層瓊脂平皿上噬斑典型的噬菌蛭弧菌，挑取噬菌斑，浸泡於滅菌自來水中4-6小時，然後，取上清液再制瓊脂平皿，調高溫度3-5攝氏度，並反覆數次；選育出在37-43攝氏度的環境下能生長的噬菌蛭弧菌，最後與失活宿主菌按比例配合，在37-43攝氏度條件下培養10-24小時，校正PH值3.0-9.8，即製得噬菌蛭弧菌的生物製劑—生物制菌王。該方法在製取噬菌蛭弧菌時需對蛭弧菌進行耐溫培養，同時對噬菌蛭弧菌沒進行純化，因此，其生產成本較高，產品中含有雜菌。
本發明的目的是提供一種噬菌蛭弧菌的提純方法及對申請號為93111749.6的專利的生產方法的改進的噬菌蛭弧菌生物製劑的製備方法，從而提供一種製備高純度、無雜菌的生物製劑，且操作簡單、成本低廉、產出率高的生產方法，以克服現有技術的不足。
本發明噬菌蛭弧菌的提純方法是這樣完成的用常規方法將從菌種保藏單位索取的噬菌蛭弧菌，製成自來水瓊脂雙層平板，培養出噬菌斑(含有雜菌)後，用紫外線照射，殺滅雜菌和部分噬菌蛭弧菌，選取存活的噬菌蛭弧菌斑，即可得到純菌斑。加入滅菌無氯自來水(以下簡稱溶劑)，浸泡4-8小時，取上清液，製備平板，在24-28攝氏溫度下培養38-40小時，即可製得不含雜菌的噬菌蛭弧菌純菌種。
本發明所用的宿主菌是大腸桿菌或枯草牙孢桿菌。
本發明的噬菌蛭弧菌的生物製劑的生產方法是在申請號為93111749.6的專利申請的基礎上改進而實現的1、宿主菌滅活懸液的製備，取在菌種保藏單位採購的大腸桿菌或枯草牙孢桿菌，按常規方法培養復壯後，測定菌數，用滅菌蒸餾水稀釋成1000億/ml的菌懸液，在121攝氏度，經30分鐘高壓滅活。2、噬菌蛭弧菌種子母液製備，取經提純的噬菌蛭弧菌種，經培養復壯後，測定菌數，用溶劑製成種子母液，濃度為105～7個/ml為宜。3、成品製備，將溶劑、經滅活的宿主菌懸液、種子母液按比例混合，其比例為每千克混合液中含宿主菌4×108～12個，蛭弧菌2×108～10個，34-39攝氏度培養10-48小時，調PH值6.0-8.2，即得噬菌蛭弧菌製劑。
下面詳細說明本發明的實施例1、將從菌種保藏單位採購的噬菌蛭弧菌製成自來水瓊脂雙層平板，培養出噬菌斑(含有雜菌)後，用40W的紫外線燈照射20-200分鐘，殺滅雜菌和部分噬菌蛭弧菌，選取存活的噬菌蛭弧菌斑，加入滅菌無氯自來水(以下簡稱溶劑)，浸泡4-8小時，取上清液，再用常規方法製備平板，在24-28攝氏溫度下培養38-40小時，即可製得不含雜菌的噬菌蛭弧菌純菌種。
2、實施例1中的紫外線照射劑量可以是用40W的紫外線燈照射40分鐘。
3、本發明的生物製劑的生產方法是1、宿主菌滅活懸液的製備，取在菌種保存單位採購的大腸桿菌或枯草牙孢桿菌，按常規方法培養復壯後，測定菌數，用滅菌蒸餾水稀釋成1000億/ml的菌懸液，在121攝氏度，經30分鐘高壓滅活。2、噬菌蛭弧菌種子母液製備，取經提純的噬菌蛭弧菌種，經培養復壯後，測定菌數，用溶劑製成種子母液，濃度為107個/ml。3、成品製備，將溶劑、經滅活的宿主菌懸液、種子母液按比例混合，其比例為每千克製劑中含宿主菌4×1010個，含噬菌蛭弧菌，2×106個，於37攝氏度培養30小時，調PH值為7.2，即得噬菌蛭弧菌製劑。
權利要求
1.一種噬菌蛭弧菌的提純，是將現有的含雜菌的噬菌蛭弧菌經培養後，製成噬菌斑，用紫外線直接照射，選取存活的噬菌斑，再用常規方法培養出純菌種。
2.根據權利要求1所述的一種噬菌蛭弧菌的提純，其特徵是紫外線的照射劑量為用40W的紫外線燈照射20-200分鐘，選取存活的菌種。
3.根據權利要求2所述的一種噬菌蛭弧菌的提純，其特徵是紫外線的照射劑量為用40W的紫外線燈照射40分鐘，選取存活的菌種。
4.一種噬菌蛭弧菌製劑的生產方法如下1)宿主菌滅活懸液的製備，取在菌種保存單位採購的大腸桿菌或枯草牙孢桿菌，按常規方法培養復壯後，測定菌數，用滅菌蒸餾水稀釋成1000億/ml的菌懸液，在121攝氏度，經30分鐘高壓滅活；2)噬菌蛭弧菌種子母液製備，取經提純的噬菌蛭弧菌種，經培養復壯後，測定菌數，用溶劑製成種子母液，濃度為105-107/ml為宜；3)成品製備，將溶劑、經滅活的宿主菌懸液、種子母液按比例混合，其比例為每千克混合液中含宿主菌4×108～12個，含噬菌蛭弧菌2×108～10個，34-39攝氏度培養10-48小時，調PH值6.0-8.2，即得噬菌蛭弧菌製劑。
5.根據權利要求4所述的一種噬菌蛭弧菌製劑的生產方方法，其特徵是成品製備中，每千克混合液中含宿主菌4×1010個，含噬菌蛭弧菌2×109個，調PH值為7.2。
6.根據權利要求4或5所述的一種噬菌蛭弧菌的生產方法，其特徵是宿主菌是大腸桿菌或枯草牙孢桿菌。
全文摘要
一種噬菌蛭弧菌的提純及其製劑的生產方法,屬於生物技術領域,涉及噬菌蛭弧菌的菌種提純及其生物製劑的生產方法,其特徵是採用紫外線照射的方法殺滅噬菌蛭弧菌中的雜菌,獲得純噬菌蛭弧菌菌種,用提純的菌種生產噬菌蛭弧菌的生物製劑,可以不經耐溫培養,而得到能在43攝氏度環境下生長的菌蛭弧菌的生物製劑,且不含雜菌。
文檔編號C12N1/20GK1271773SQ99112188
公開日2000年11月1日 申請日期1999年4月22日 優先權日1999年4月22日
發明者徐鋼, 闕寧寧 申請人:徐鋼