前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-13 21:46:21

專利名稱：前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白複合物，特別涉及前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合 物，還涉及該複合物的製備方法和應用。
背景技術：
前列腺癌是西方國家常見的腫瘤，居男性腫瘤死亡原因第二位。儘管最近在診 斷和治療局限性前列腺癌方面有了一些進展，但仍有許多問題亟待解決，如診斷方法缺乏 特異性，不能準確區分靜止性和進展性的前列腺癌，難以對病人預後進行預測，約20% 40%的患者經過手術和放射治療後復發等。儘管雄激素阻斷療法可以使一部分患者的病情 得到緩解，但是大部分患者還是不可避免地發展到目前無法治療的雄激素非依賴性病變。 因此，發展診斷和治療前列腺癌的新方法及新藥物成為目前研究的焦點。前列腺幹細胞抗原(prostatestem cell antigen, PSCA)是 Reiter 等於 1998 年 利用特徵性差異分析法在前列腺癌細胞株中發現的一種前列腺癌相關腫瘤抗原，具有高度 的前列腺特異性，在多數前列腺癌中均有高表達，尤其在前列腺癌骨轉移腫瘤中呈100%強 表達，而在其他正常組織很少表達，其單克隆抗體在動物實驗中能有效抑制雄激素依賴及 非依賴性前列腺癌的生長。PSCA是一種細胞膜抗原，為含有123個胺基酸的糖蛋白，氨基端 為信號序列，羧基端為糖化磷脂醯肌醇(GPI)錨定序列，中間有多個糖基化位點。其與幹細 胞抗原2(SCA-2)有30%的同源性，後者是依賴於GPI錨定細胞表面的Thy21/Ly26家族抗 原成員之一。同幹細胞抗原一樣，PSCA也依賴GPI結合於細胞膜上，並可被GPI特異性磷 酸酯酶所清除。研究發現，識別PSCA的細胞毒性T細胞(CTL)可以在患者外周血中提取得 到，其可以溶解殺傷前列腺癌細胞。因此，PSCA可以作為T細胞介導的前列腺癌免疫治療 中的靶抗原，通過激活識別PSCA的CTL特異性殺傷癌細胞。熱休克蛋白(HSP)是一類廣泛存在於生物體內高度保守的蛋白質，在高溫、創傷、 感染、缺氧、重金屬中毒、氧自由基及惡性腫瘤等應激狀態下可誘導表達。HSP具有「分子 伴侶」作用，在正常狀態下，參與細胞內各種新生肽鏈的結合、裝配和跨膜轉運；在應激狀態 下，可與細胞內變性的蛋白質結合，協助其復性或將其運送至溶酶體降解以維持細胞的正 常生命代謝。許多研究結果證實，從腫瘤組織中提取的HSP可以誘導機體產生針對該腫瘤 的免疫應答，達到治療腫瘤的目的。進一步研究表明，從腫瘤組織中提取的HSP實際為抗原 肽-HSP複合物，其可通過以下幾方面誘導機體的抗腫瘤免疫(1)抗原肽-HSP複合物作為 完整抗原，被抗原遞呈細胞攝取、加工後，與主要組織相容性複合體(MHC)結合併遞呈到細 胞表面，從而活化T細胞，包括CD4+和CD8+T細胞，特別是CTL，產生抗腫瘤的特異性細胞免 疫；HSP在此處起到載體或佐劑的作用，誘導免疫應答的是其結合的抗原多肽；(2) HSP本身 具有活化巨噬細胞和樹突狀細胞的作用，從而增加共刺激因子和MHC的表達，加強機體的 抗腫瘤免疫；(3)自然殺傷細胞和Y δ T細胞是體內重要的抗腫瘤免疫細胞，對腫瘤細胞的 殺傷效應不受MHC的限制，HSP可直接作為抗原遞呈分子，將抗原肽遞呈至細胞表面，從而
3活化自然殺傷細胞和Y S T細胞，產生抗腫瘤的非特異性免疫。根據分子量大小和胺基酸 序列同源性的不同，HSP可以分為HSPllO家族、HSP90家族(83 90kD)、HSP70家族(66 78kD)、HSP60家族及小HSP家族(15 39kD)。其中，HSP70家族在細胞內含量最多，有20 餘個成員，廣泛存在於細胞內不同部位。HSP70在進化上具有高度的保守性，其氨基端有 ATP結合區並具有ATP酶活性，較羧基端具有更高的保守性，而羧基端是結合多肽或特殊蛋 白的部位，具有易變性。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種PSCA與HSP的複合物，能夠激活識別 PSCA的特異性CTL，誘導強有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐劑，在同種間應用不受 MHC的限制；目的之二在於提供所述PSCA與HSP的複合物的製備方法；目的之三在於提供 所述PSCA與HSP的複合物在醫藥方面的應用。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案1、PSCA與HSP的複合物，由PSCA與HSP70以非共價鍵結合而成，所述PSCA具有 SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列，HSP70具有SEQ ID No. 8所示的胺基酸序列。進一步，由PSCA與HSP70以摩爾比為1 1結合而成。2、所述PSCA與HSP的複合物的製備方法，是在濃度為0. 01mol/L、pH為7. 2 7. 4 的磷酸鹽緩衝液即PBS中，分別加入PSCA與HSP70，混合均勻，43°C孵育30分鐘，再37°C孵 育1小時，即得PSCA與HSP70的複合物。進一步，按摩爾比為1 1加入PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的濃度 均為3 6 μ g/mLo3、所述PSCA與HSP的複合物在製備抗前列腺癌疫苗中的應用。本發明的有益效果在於本發明提供的PSCA與HSP的複合物，能夠激活識別PSCA 的特異性CTL，誘導強有力的抗前列腺癌免疫；PSCA中包含MHC I類和II類分子的多個表 位，可以激發廣譜的⑶8+和⑶4+T細胞，還包含T細胞和B細胞表位，可以激發T細胞和 B細胞的抗腫瘤應答；由於HSP結構上的高度保守，不具有多態性，在同種內相互使用不受 MHC的限制；HSP具有免疫佐劑的作用，省略了常規蛋白免疫需要免疫佐劑的麻煩；該複合 物的製備方法簡單，可以用於製備抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治療領域有著良好的 開發應用前景。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1為蛋白免疫印跡(Western Blot)鑑定PSCA ；圖 2 為 Western Blot 鑑定 HSP70 ；圖 3 為 Western Blot 鑑定 PSCA-HSP70 複合物；圖4為酶聯免疫斑點(ELISP0T)法檢測PSCA-HSP70複合物激發CTL分泌IFN- γ 的能力；圖5為51Cr釋放法檢測PSCA-HSP70複合物激發CTL對結腸癌細胞CT26的特異性殺傷效應。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。一、PSCA-HSP70複合物的製備1、PSCA 的製備(I)PSCA cDNA 全長的克隆根據GenBank登錄號為NM_005672的PSCA基因序列，設計併合成如下引物以擴增 PSCA cDNA 全長:F1 :5，-atgaaggctgtgctgcttgccctgt-3，(SEQ ID No. 3) ,Rl :5，-cgagctg gccgggtccccagagc-3，(SEQ ID No. 4)；提取前列腺癌細胞 LNCaP 的總 RNA，逆轉錄為 cDNA， 再以該cDNA為模板、Fl和Rl為上下遊引物進行PCR擴增，PCR條件為94°C預變性3分 鍾，然後94°C變性30秒、56°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30個循環，最後72°C延伸5分 鍾；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，與克隆載體pGEM-T Easy連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB平板篩選陽 性克隆，提取陽性克隆質粒，委託上海生工公司測定質粒序列，將插入了 PSCA cDNA全長序 列(SEQ ID No. 1)的陽性克隆質粒命名為pGEM-PSCA。(2) PSCA基因重組真核表達載體的構建根據PSCA cDNA全長序列和真核表達載體pcDNA3. 1的多克隆位點，設計併合成如 下引物以擴增兩端帶有酶切位點的PSCA cDNA全長F2 ^'-ccggtaccatgaaggctgtgctgctt gccctgt-3，(SEQ ID No. 5)，下劃線部分為 Kpn I 酶切位點；R2 ^'-cctctagacgagctggccgg gtccccagagc-3』(SEQ ID No. 6)，下劃線部分為Xba I酶切位點；以質粒pGEM-PSCA為模板、 Fl和Rl為上下遊引物進行PCR擴增，PCR條件與步驟(1)相同；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳 鑑定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化後，用Kpn I和Xba I進行雙酶切，雙酶切產物經凝膠 回收試劑盒切膠回收純化後，與同樣經Kpn I和Xba I雙酶切的真核表達載體pcDNA3. 1在 T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青 黴素的LB平板篩選陽性克隆，提取陽性克隆質粒，用Kpn I和Xba I進行雙酶切鑑定，並委 託上海生工公司測定質粒序列，將插入了 PSCA cDNA全長序列的陽性克隆質粒命名為PSCA 基因重組真核表達載體pcDNA3. 1-PSCA。(3) PSCA基因工程菌的構建將PSCA基因重組真核表達載體pcDNA3. I-PSCA用Sal I酶切使線性化，用電穿 孔法轉化畢赤酵母GSl 15感受態細胞，轉化產物塗布於MD平板，30°C培養3 4天，挑取 白色酵母菌落，分別點接於MD和匪平板，30°C培養3 6天(每天向匪平板中添加甲醇 100 μ L)，挑取MD平板上生長明顯快於匪平板的酵母菌落，點接於含有濃度為4mg/mL的 G418的YPD平板，30°C培養7天，所得酵母菌即為高拷貝PSCA基因工程菌。(4) PSCA的誘導表達將高拷貝PSCA基因工程菌於30°C培養至0D600為2，按10%接種量接入BMGY培 養基中，30°C培養24小時，5000g離心5分鐘，棄上清，細菌沉澱用無菌水洗滌2次，重懸於
5等體積的BMMY培養基中，30°C誘導表達3天(每24小時補加誘導劑甲醇至最終體積百分濃 度為0. 5% )，4°C、6000g離心5分鐘，收集上清，加入質量百分濃度為80%的硫酸銨溶液使 蛋白質沉澱，離心棄上清，蛋白質沉澱用濃度為0. 02mol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩衝液(PBS) 透析脫鹽，再用瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)柱進行分離純化，用濃度為lmol/L的氯化鈉溶 液線性梯度洗脫，收集含有PSCA的洗脫液，適當濃縮後用葡聚糖凝膠(S印hdexG-25)柱脫 鹽，即得純化的PSCA (序列如SEQ ID No. 2所示)。Western Blot鑑定取純化的PSCA，加入內參β-actin和上樣緩衝液，100 °C 加熱3 5分鐘，用質量百分濃度為12%的分離膠、質量百分濃度為5%的積層膠進行 SDS-PAGE，電泳完畢後，將分離產物電轉移至PVDF膜上，用質量百分濃度為5%的脫脂奶粉 溶液封膜，加入鼠抗人PSCA單克隆抗體和鼠抗人β -actin單克隆抗體，溫度37°C孵育1小 時，洗膜，再加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育1小時，洗膜，顯色；同時 設置陰性對照(不加入純化的PSCA)；結果見圖1，其中1泳道為純化的PSCA，2泳道為陰 性對照，可見1泳道除內參β -actin條帶外，還有一明顯的蛋白條帶，而2泳道未見相應條
市ο2、HSP70 的製備(1) HSP7OcDNA 全長的克隆根據GenBank登錄號為NM 005345的HSP70基因序列和酵母表達載體pRSET_A的 多克隆位點，設計併合成如下引物以擴增兩端帶有酶切位點的HSP70cDNA全長F3 :5’tt￡g atccatgtccaagggacctgca-3『 (SEQ ID No. 9)，下劃線部分為 BamH I 酶切位點；R3 :5，_gg巡 atRRttaatcaacctcttcaat-3』 (SEQ ID No. 10)，下劃線部分為 Nco I 酶切位點；提取 IfepG2 細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，再以該cDNA為模板、F3和R3為上下遊引物進行PCR擴增， PCR條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性30秒、58°C退火30秒，72°C延伸2. 5分鐘， 共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，用凝膠回收試劑 盒進行切膠回收純化。(2)HSP70基因重組酵母表達載體的構建將純化的PCR產物用BamH I和Nco I進行雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒 切膠回收純化後，與同樣經BamH I和Nco I雙酶切的酵母表達載體pRSET_A在T4DNA連接 酶的作用下進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨苄青黴素的LB 平板篩選陽性克隆，提取陽性克隆質粒，用BamH I和Nco I進行雙酶切鑑定，並委託上海生 工公司測定質粒序列，將插入了 HSP70cDNA全長序列(SEQ ID No. 7)的陽性克隆質粒命名 為HSP70基因重組酵母表達載體pRSET-HSP70。(3)HSP70基因工程菌的製備將HSP70基因重組酵母表達載體pRSET-HSP70用Sal I酶切使線性化，用電穿孔法 轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，轉化產物塗布於MD平板，30°C培養3 4天，挑取白色酵 母菌落，分別點接於MD和匪平板，30°C培養3 6天(每天向匪平板中添加甲醇100 μ L)， 挑取MD平板上生長明顯快於匪平板的酵母菌落，點接於含有濃度為4mg/mL的G418的YPD 平板，30°C培養7天，所得酵母菌即為高拷貝HSP70基因工程菌。(4)HSP70的誘導表達將高拷貝HSP70基因工程菌於30°C培養至0D600為2，按10%接種量接入BMGY培養基中，30°C培養24小時，5000g離心5分鐘，棄上清，菌體用無菌水洗滌2次後，重懸於 等體積的BMMY培養基中，30°C誘導表達3天(每24小時補加誘導劑甲醇至最終體積百分 濃度為0. 5% )，4°C、6000g離心5分鐘，收集上清，加入質量百分濃度為80%的硫酸銨溶液 使蛋白質沉澱，離心棄上清，蛋白質沉澱用濃度為0. 02mol/L、pH為8. 0的PBS透析脫鹽， 再用Q-Sepharose柱進行分離純化，用濃度為lmol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含 有HSP70的洗脫液，適當濃縮後用S印hdex G-25柱脫鹽，即得純化的HSP70(序列如SEQID No. 8所示)。Western Blot鑑定取純化的HSP70，加入內參β-actin和上樣緩衝液，100°C 加熱3 5分鐘，用質量百分濃度為12%的分離膠、質量百分濃度為5%的積層膠進行 SDS-PAGE，電泳完畢後，將分離產物電轉移至PVDF膜上，用質量百分濃度為5%的脫脂奶粉 溶液封膜，加入鼠抗人HSP70單克隆抗體和鼠抗人β -actin單克隆抗體，溫度37°C孵育1 小時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育1小時，洗膜，顯色；同時 設置陰性對照(不加入純化的HSP70)；結果見圖2，其中1泳道為純化的HSP70，2泳道為陰 性對照，可見1泳道除內參β-actin條帶外，還有一明顯的蛋白條帶，而2泳道未見相應條
市ο3、PSCA_HSP70複合物的製備在濃度為0. 01mol/L、pH為7. 2 7. 4的PBS (由濃度為137mmol/L的NaCl、濃度 為 2. 7mmol/L 的 KCl、濃度為 4. 3mmol/L 的 Na2HPO4 和濃度為 1. 4mmol/L 的 KH2PO4 組成)中， 按摩爾比為1 1加入純化的PSCA和HSP70，使PSCA和HSP70在PBS中的濃度均為3 6 μ g/mL,混合均勻，43°C孵育30分鐘，再37°C孵育1小時，即得PSCA-HSP70複合物。Western Blot鑑定取PSCA-HSP70複合物，冰上勻漿裂解30分鐘，加入鼠抗人 HSP70單克隆抗體，4°C漩渦混合過夜，加入IgG Beads，4°C漩渦混合5小時，4°C、5000r/min 離心10分鐘，收集上清，加入內參β -actin和上樣緩衝液，95°C加熱5分鐘，用質量百分濃 度為12%的分離膠、質量百分濃度為5%的積層膠進行SDS-PAGE，電泳完畢後，將分離產物 電轉移至PVDF膜上，用質量百分濃度為5 %的脫脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人PSCA單克隆 抗體和鼠抗人β -actin單克隆抗體，溫度37°C孵育1小時，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記 的兔抗鼠IgG，溫度37°C孵育1小時，洗膜，顯色；同時設置陰性對照(不加入PSCA-HSP70 複合物)；結果見圖3，其中1泳道為PSCA-HSP70複合物，2泳道為陰性對照，可見1泳道除 內參β -actin條帶外，還有一明顯的蛋白條帶，而2泳道未見相應條帶。二、PSCA-HSP70複合物的抗腫瘤活性研究效應細胞的製備將30隻6 8周齡雌性Babl/c小鼠隨機分為3組實驗組、對 照組和空白組，每組10隻；將PSCA-HSP70複合物和0VA-HSP70複合物(卵清蛋白與HSP70 按前述步驟3方法製得的複合物)分別用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS溶解製成濃度 為0. 5mg/mL的溶液；實驗組以濃度為0. 5mg/mL的PSCA-HSP70複合物溶液為免疫原，對照 組以濃度為0. 5mg/mL的0VA-HSP70複合物溶液為免疫原，空白組以濃度為0. lmol/L、pH為 7. 4的PBS為免疫原；各組於小鼠背側尾根部皮下注射免疫原，每隻100 μ L，之後每間隔1 周，以同樣方法加強免疫1次，共免疫3次；末次免疫後1周，斷頸處死小鼠，在無菌條件下 取脾臟，用100目篩網碾磨，收集細胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分 離脾淋巴細胞，用含有質量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養基調節細胞密度為1 X IO6個/mL，作為後續實驗的效應細胞。1、ELISP0T法檢測PSCA-HSP70複合物激發CTL分泌IFN- γ的能力採用ELISP0T檢測試劑盒進行檢測，具體操作參照試劑盒說明書在96孔培養 板中，每孔加入體積百分濃度為70%的乙醇100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入 IFN-Y捕獲抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度4°C孵育過夜，PBS洗滌，再加入質量百 分濃度為2%的脫脂奶粉溶液100 μ L，室溫封閉2小時，PBS洗滌，再加入效應細胞100 μ L， 溫度37°C孵育48小時，PBST(即含有質量百分濃度為0. 的吐溫20的PBS)洗滌，再加 入生物素標記的抗IFN- γ抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1. 5小時，PBST 洗滌，再加入鏈黴親和素標記的鹼性磷酸酶(稀釋度為1 5000) 10(^1^，溫度371孵育1 小時，PBST洗滌，拍幹培養板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應液100 μ L，室溫避光顯色 2 10分鐘至斑點形成，用蒸餾水終止反應，乾燥後檢測斑點數；同時設置陰性對照組(不 加入效應細胞)，各組斑點數以3個復孔的均值表示。結果見圖4，實驗組的斑點數(235個/IO5細胞)明顯高於其它3組(對照組為 149個/IO5細胞，空白組為10個/IO5細胞，陰性對照組為3個/IO5細胞)，表明本發明的 PSCA-HSP70複合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發CTL分泌IFN- γ。2,51Cr釋放法檢測PSCA-HSP70複合物激發CTL對腫瘤細胞的特異性殺傷效應靶細胞的製備將結腸癌細胞CT26用含有質量百分濃度為10%的胎牛血清的 RPMI 1640培養基進行培養，收集細胞，離心洗滌2次後，用含有質量百分濃度為10%的胎 牛血清的RPMI 1640培養基調節細胞密度為IX IO6個/mL，取ImL置IOmL血清瓶中，加入 100 μ Ci Na51CrO4，溫度37°C孵育90分鐘，充分洗滌細胞除去未結合的51Cr,再用含有質量 百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI1640培養基調整細胞密度為1 X IO5個/mL，作為靶細 胞。在96孔U型板中，每孔分別按效靶比(E/T)為100 1、50 1和25 1加入效 應細胞與靶細胞，每種效靶比設3個復孔，同時設最大釋放組(用濃度為2mol/L的鹽酸替 代效應細胞)和最小釋放組(用含有質量百分濃度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養基 替代效應細胞)；將96孔板500r/min離心30秒後，溫度37°C孵育4小時，1000r/min離心 10分鐘，各孔取上清100 μ L，用γ計數器測定每分鐘放射活性(cpm值)，按下述公式計算 殺傷率殺傷率(％)=[(實驗組cpm均值-最小釋放組cpm均值)/ (最大釋放組cpm均 值_最小釋放組cpm均值)]X 100%,殺傷率大於15%判為特異性殺傷。結果見圖5，實驗組在各效靶比對CT26細胞均有特異性殺傷作用，且隨著效靶比 增大，特異性殺傷作用逐漸增強，當E/T為100 1時，殺傷率為51.7%，而對照組和空白組 對CT26細胞無特異性殺傷作用，表明本發明的PSCA-HSP70複合物能夠有效激發CTL產生 對腫瘤細胞的特異性殺傷效應。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和範圍。序列表中國人民解放軍第三軍醫大學
8前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物及其製備方法和應用
10
1
372
DNA智人(homo sapiens)

CDS
⑴…..(372)
1
acgaaggctgtgctgcttgccctgttgatggcaggcttggccctgcagccaggcactgcc60
ctgctgtgctactcctgcaaagcccaggtgagcaacgaggactgcctgcaggtggagaac120
tgcacccagctgggggagcagtgctggaccgcgcgcatccgcgcagttggcctcctgacc180
gtcatcagcaaaggctgcagcttgaactgcgtggatgactcacaggactactacgtgggc240
aagaagaacatcacgtgctgtgacaccgacttgtgcaacgccagcggggcccatgccctg300
cagccggctgctgccatccttgcgctgctccctgcactcggcctgctgctctggggaccc360
ggccagctctag372
2
123
PRT
智人(homo
2
sapiens)
Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu 15
Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr 20
Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu 35
Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg lie Arg 50
Val lie Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn 65
Asp Tyr Tyr Val Gly 80
Leu Cys Asn Ala Ser 95
lie Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly 110
Gly Gln Leu
Lys Lys Asn lie Gly Ala His Ala
Met Ala Gly Leu Ala Leu 1015
Ser Cys Lys Ala Gln Val 2530
Asn Cys Thr Gln Leu Gly 4045
Ala Val Gly Leu Leu Thr 5560
Cys Val Asp Asp Ser Gln 7075
Thr Cys Cys Asp Thr Asp 8590
Leu Gln Pro Ala Ala Ala 100105
Leu Leu Leu Trp Gly Pro 1151200095]3
0096]25
0097]DNA
0098]人工序列
0099]
0100] 引物 Fl
0101]3
0102]atgaaggctg tgctgcttgc cctgt25
0103]4
0104]23
0105]DNA
0106]人工序列
0107]
0108] 引物 Rl
0109]4
0110]cgagctggcc gggtccccag age23
0111]5
0112]33
0113]DNA
0114]人工序列
0115]
0116] 引物 F2
0117]5
0118]ccggtaccat gaaggctgtg ctgcttgccc tgt33
0119]6
0120]31
0121]DNA
0122]人工序列
0123]
0124] 引物 R2
0125]6
0126]cctctagacg agctggccgg gtccccagag c31
0127]7
0128]1926
0129]DNA
0130] 智人(homo sapiens)
0131]
0132]CDS
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Leu Phe Val His Gln Ser Ala Leu Gly Thr Gly Asp Ala Ala Lys Lys Ala Leu Gly Asp
Phe Glu Glu Asp Lys lie Ala Leu Gly Lys Val Asn Pro Asn Ala Glu Glu Glu Leu Lys
Glu Glu Lys Leu Leu Asn lie Leu Val Gln Leu Asn Arg Gly Asn Glu Asp Ser Lys Cys
Gly 290 Leu 305 Ala 320 Val 335 Leu 350 Pro 365 Leu 380 Asp 395 Met 410 Thr 425 lie 440 Leu 455 Gly 470 lie 485 Lys 500 lie 515 Glu 530 Tyr 545 Gly 560 Gln
lie Cys Leu Leu Gln Asp Met Val Thr Gln Gln Leu Val Leu lie Glu Val Ala Lys Glu
Asp Ser Arg Val Asp Glu Gly Ala Ala lie Val Gly Pro Asn Thr Arg Gln Phe lie Val
Phe Asp Asp Gly Phe Ala Asp Pro Leu Phe Tyr Arg Gln Val lie Met Arg Asn Ser lie
Tyr Leu Ala Gly Phe Val Lys Leu lie Thr Glu Phe lie Thr Thr Val Glu Met Glu Ser
Thr 295 Phe 310 Lys 325 Ser 340 Asn 355 Ala 370 Ser 385 Ser 400 Lys 415 Thr 430 Gly 445 Glu 460 Glu 475 Ala 490 Asn 505 Gln 520 Arg 535 Lys 550 Ala 565 Trp
Ser Arg Leu Thr Gly Tyr Glu Leu Arg Tyr Glu Leu Val Thr Asp Glu Val Ser Asp Leu
lie Ser Asp Arg Arg Gly Asn Gly Asn Ser Arg Ser Thr Asp Lys Ala Ser Ala Lys Asp
Thr Thr Lys lie Asp Ala Val Leu Ser Asp Ala Gly Phe Lys Gly Glu Ala Val Lys Ala
Arg Leu Ala Pro Leu Ala Gln Glu Thr Asn Met lie Asp Ser Arg Lys Lys Glu Lys Asn
Ala 300 Glu 315 Gln 330 Lys 345 Asn 360 Val 375 Asp 390 Thr 405 lie 420 Gln 435 Thr 450 Pro 465 lie 480 Thr 495 Leu 510 Tyr 525 Asn 540 Asp 555 Val 570 Thr
575580585
Leu Ala Glu LysAsp GluPhe Glu His Lys ArgLysGluLeuGlu
590595600
Gln Val Cys AsnPro Ilelie Ser Gly Leu TyrGlnGlyAlaGly
605610615
Gly Pro Gly ProGly GlyPhe Gly Ala Gln GlyProLysGlyGly
620625630
Ser Gly Ser GlyPro Thrlie Glu Glu Val Asp
635640
9
26
DNA
人工序列

引物 F3
9
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10
26
DNA
人工序列

引物 R3
10
ggccatggtt aatcaacctc ttcaat
26
26
1權利要求
前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物，其特徵在於由前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白70以非共價鍵結合而成，所述前列腺幹細胞抗原具有SEQID No.2所示的胺基酸序列，熱休克蛋白70具有SEQ ID No.8所示的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物，其特徵在於由 前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白70以摩爾比為1 1結合而成。
3.權利要求1所述前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物的製備方法，其特徵在 於在濃度為0. 01mol/L、pH為7. 2 7. 4的磷酸鹽緩衝液即PBS中，分別加入前列腺幹細 胞抗原和熱休克蛋白70，混合均勻，43°C孵育30分鐘，再37°C孵育1小時，即得前列腺幹細 胞抗原與熱休克蛋白的複合物。
4.根據權利要求3所述前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物的製備方法，其特徵 在於按摩爾比為1 1加入前列腺幹細胞抗原和熱休克蛋白70，使前列腺幹細胞抗原和 熱休克蛋白70在PBS中的濃度均為3 6 μ g/mL。
5.權利要求1所述的前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物在製備抗前列腺癌疫 苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白的複合物及其製備方法和應用，該複合物由前列腺幹細胞抗原與熱休克蛋白70以非共價鍵結合而成，能夠激活特異性CTL，誘導強有力的抗前列腺癌免疫，且不需要任何佐劑，在同種間應用不受MHC的限制；同時，前列腺幹細胞抗原中包含MHC I類和II類分子的多個表位，可以激發廣譜的CD8+和CD4+T細胞，還包含T細胞和B細胞表位，可以激發T細胞和B細胞的抗腫瘤應答；該複合物的製備方法簡單，可以用於製備抗前列腺癌疫苗，在前列腺癌免疫治療領域有著良好的開發應用前景。
文檔編號A61K47/42GK101912603SQ20091025105
公開日2010年12月15日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學