一種蛹蟲草菌種選育方法
2023-06-13 18:06:31
專利名稱：一種蛹蟲草菌種選育方法
技術領域：
本發明涉及一種蛹蟲草菌種選育方法。
背景技術：
現有的蛹蟲草菌種選育時，獲取孢子後， 一般通過平板劃線和塗布的方法，以將孢子稀 釋到合適的程度，待菌落形成後，作進一步的挑選。這種選育方法雖然操作簡單，但是由於 技術本身的限制，難以獲得單孢生長形成的菌落，獲得的菌落需要進行進一步的分離和挑選 。這一方法需要進行大量的重複性勞動，分離效率低，選育耗時長，難以滿足生產的需要。
也有部分採用梯度稀釋法將孢子到一定程度，然後在培養基中塗布培養以獲得單孢生長 形成的菌落。這一方法能夠獲得純種菌種，但是因為單孢的數量巨大，生長形成的菌落同樣 也是很多的，仍需要進行大量的篩選工作，挑選部分發到性狀優良的菌落進行後續的培養， 總的工作量也沒有減少多少，效率依然不高。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種簡單高效獲取具有優良性狀純種蛹蟲草單孢的方法
技術領域：
本發明採取的技術方案是 一種蛹蟲草菌種選育方法，包括以下步驟
1) 從蛹蟲草菌苔表面刮取孢子，加入到裝有無菌水的容器中，充分振蕩搖勻，稀釋至 所需倍數，製得蛹蟲草孢子懸浮液；
2) 配製缺乏營養的基本培養基，高溫滅菌後，保溫使其處於液態；
3) 配製營養豐富的加富培養基，高溫滅菌後，保溫使其處於液態，備用；
4) 在培養皿中倒入基本培養基，在培養基還處於液態時，吸取蛹蟲草孢子懸浮液加入 培養皿中，搖動培養皿使孢子懸浮液和基本培養基混合均勻；待培養皿中基本培養基凝固後 ，再倒入一層基本培養基，第二次倒入的培養基凝固後，在培養皿中倒入一層加富培養基。
5) 培養皿中的加富培養基凝固後，將培養皿置於20 25。C恆溫培養箱中倒置培養。
6) 觀察培養過程中各菌落的生長情況，選取生成快，擴張快，菌絲濃密的菌落進行後 續試驗。
本發明的有益效果是基本培養基上營養有限，性狀優良、活力高的蛹蟲草孢子能夠較快的萌發，利用其中有限的營養進行菌絲生長；性狀差、活性低的孢子萌發後，由於缺乏營 養，難以繼續生長。性狀越優良、活力越高的蛹蟲草孢子產生的菌絲生長越快，能夠較早的進入下一個基本 培養基層，搶先利用其中有限有營養，進而抑制其他蛹蟲草孢子產生的菌絲的生長。性狀越優良、活力越高的蛹蟲草孢子產生的菌絲生長越快，能夠較早的進入加富培養基 層，優先利用加富培養基的豐富營養，快速生長形成菌落；性狀較次、活力較低的蛹蟲草孢 子，其菌絲生長到加富培養基所用的時間更長，此時培養基中的營養已大量被其他性狀更為 優良的蛹蟲草菌絲利用，難以形成可觀的菌落。這樣培養時，通過培養基的層層篩選，大量性狀差、活力低的蛹蟲草孢子被淘汰掉，剩 下的為性狀優良、活力高的蛹蟲草純種，大大減少了篩選的工作量，便於後續實驗中挑選性 狀優良的菌落，有效提高了篩選效率。
具體實施方式
下面結合實例，進一步說明本發明。 一種蛹蟲草菌種選育方法，包含以下步驟1) 從蛹蟲草菌苔表面刮取孢子，加入到裝含有無菌水和蛹蟲草孢子分散劑吐溫-80的三 角瓶中，三角瓶中加入玻璃珠，使用迴旋振蕩器充分振蕩搖勻，然後稀釋至所需倍數，製得 蛹蟲草孢子懸浮液；2) 配製缺乏營養的基本培養基PDA基本培養基，其配方為水600-800ml 馬鈴薯80-100g 葡萄糖15-18g 瓊脂15-18g高溫滅菌後，45 高溫滅菌後，45'C保溫使其處於液態，臨用前每l升培養基中加入無菌的12-16ml濃度為2呢去 氧膽酸鈉溶液和l. 8-2ml濃度為10000-15000u/ml的鏈黴素溶液，混合均勻，製得PDA基本選 擇培養基；3) 配製營養豐富的加富培養基加富PDA培養基，其配方為水600-800ml馬鈴薯80-100g葡萄糖15-18g 瓊脂15-18g磷酸氫二鉀1.5-1.8g硫酸鎂0. 7-0.9g蛋白腖2-2. 5g 蠶蛹粉2-2. 5g，高溫滅菌後，保溫使其處於液態，備用；4) 在培養皿中倒入PDA基本選擇培養基，當培養基還處於液態時，吸取蛹蟲草孢子懸浮液加入培養皿中，搖動培養皿使孢子懸浮液和PDA基本選擇培養基混合均勻；待培養皿中PDA基本選擇培養基凝固後，再倒入一層PDA基本選擇培養基，第二次倒入的培養基凝固後， 在培養皿中倒入一層加富PDA培養基；三層培養基的厚度基本相同，均為l 2mm;5) 培養皿中的加富PDA培養基凝固後，將培養皿置於20 25。C恆溫培養箱中倒置培養；6) 觀察培養過程中各菌落的生長情況，選取生成快，擴張快，菌絲濃密的菌落進行後 續試驗。使用分散劑之後，孢子分散更均勻，且不易沉降，保證了孢子懸浮液的均勻性，有利於 實驗的進行；加入玻璃珠，更容易將刮取的孢子打散，使用迴旋振蕩器振蕩，振蕩均勻迅速 ，有效提高實驗效率。除了吐溫-80，也可以使用其他對孢子無毒害作用的分散劑，如維生 素E、吐溫-60等。培養基優選的保溫溫度為45 6(TC，既便於操作，也不會因為過熱對孢子造成不良影響PDA基本培養基也可以使用其他培養基代替，只要能保證蛹蟲草孢子萌發後有基本的生 長營養即可，本領域的技術人員可以很容易根據實際情況選擇不同的配方。加富PDA培養基也可以使用其他培養基代替，只要營養豐富、適宜蛹蟲草菌絲生長即可 ，本領域的技術人員可以很容易根據實際情況選擇不同的配方。除了去氧膽酸鈉、鏈黴素，微生物抑制劑也可以是一般的活性抗生素，如四環素、氯黴 素、青黴素，但不能使用對蛹蟲草孢子抑制作用太強化學殺菌劑，如人工合成的醯基化抗生 素。基本培養基上營養有限，性狀優良、活力高的蛹蟲草孢子能夠較快的萌發，利用其中有 限的營養進行菌絲生長；性狀差、活性低的孢子萌發後，由於缺乏營養，難以繼續生長；培 養基中加入了微生物抑制劑，能夠抑制培養基中細菌的黴菌的生長，避免雜菌感染，影響試 驗結果；同時微生物抑制劑對蛹蟲草孢子的萌發也有一定的抑制作用，這樣活力低、性狀差 的孢子就難以萌發。性狀越優良、活力越高的蛹蟲草孢子產生的菌絲生長越快，能夠較早的進入下一個基本 培養基層，搶先利用其中有限有營養，進而抑制其他蛹蟲草孢子產生的菌絲的生長。性狀越優良、活力越高的蛹蟲草孢子產生的菌絲生長越快，能夠較早的進入加富培養基 層，優先利用加富培養基的豐富營養，快速生長形成菌落；性狀較次、活力較低的蛹蟲草孢 子，其菌絲生長到加富培養基所用的時間更長，此時培養基中的營養已大量被其他性狀更為 優良的蛹蟲草菌絲利用，難以形成可觀的菌落。這樣培養時，通過培養基的層層篩選，大量性狀差、活力低的蛹蟲草孢子被淘汰掉，剩 下的為性狀優良、活力高的蛹蟲草純種，大大減少了篩選的工作量，便於後續實驗中挑選性 狀優良的菌落，有效提高了篩選效率。
權利要求
1.一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於包含以下步驟1)從蛹蟲草菌苔表面刮取孢子，加入到裝有無菌水的容器中，充分振蕩搖勻，稀釋至所需倍數，製得蛹蟲草孢子懸浮液；2)配製缺乏營養的基本培養基，高溫滅菌後，保溫使其處於液態；3)配製營養豐富的加富培養基，高溫滅菌後，保溫使其處於液態，備用；4)在培養皿中倒入基本培養基，當培養基還處於液態時，吸取蛹蟲草孢子懸浮液加入培養皿中，搖動培養皿使孢子懸浮液和基本培養基混合均勻；待培養皿中基本培養基凝固後，再倒入一層基本培養基，第二次倒入的基本培養基凝固後，在培養皿中倒入一層加富培養基。5)培養皿中的加富培養基凝固後，將培養皿置於20～25℃恆溫培養箱中倒置培養。6)觀察培養過程中各菌落的生長情況，選取生成快，擴張快，菌絲濃密的菌落進行後續試驗。
2.根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於所述缺乏營養的基本培 養基包括PDA基本培養基，PDA基本培養基的配方為水600-800ml 馬鈴薯80-100g 葡萄糖15-18g 瓊脂15-18g。
3.根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於所述營養豐富的加富培 養基包括加富PDA培養基，加富PDA培養基的配方為水600-800ml 馬鈴薯80-100g 葡萄糖15-18g 瓊脂15-18g 磷酸氫二鉀1.5-1.8g 硫酸鎂0. 7-0.9g蛋白腖2-2. 5g蠶蛹粉2-2. 5g。
4.根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於步驟l)中加入蛹蟲草 孢子分散劑。
5. 根據權利要求4所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於所述分散劑包括吐溫 -80、維生素E，吐溫-60。
6 .根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於步驟l)中容器中加入 玻璃珠，使用迴旋振蕩器振蕩均勻。
7. 根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於步驟2)中保溫處於液態的基本培養基，臨用前加入一種或多種無菌的微生物抑制劑，混合均勻，製得基本選擇培養基。
8. 根據權利要求7所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於選用的微生物抑制劑包括去氧膽酸鈉、鏈黴素、四環素、氯黴素、青黴素。
9. 根據權利要求l所述的一種蛹蟲草菌種選育方法，其特徵在於所述培養基的保溫溫度 為45 60。C。
全文摘要
本發明公開了一種蛹蟲草菌種選育方法。本發明中，將蛹蟲草孢子懸浮液與缺乏營養的基本培養基混合均勻，待其凝固後，再倒上一層基本培養基，第二層培養基也凝固了，在其上再倒上一層營養豐富的培養基，然後倒置培養，在培養過程中挑選性狀優良的蛹蟲草單孢菌落。本發明從培養開始，就通過培養基的層層篩選，將大量性狀差、活力低的蛹蟲草孢子淘汰掉，剩下性狀優良、活力高的蛹蟲草純種，大大減少了篩選的工作量，便於後續實驗中挑選性狀優良的菌落，有效提高了篩選效率。
文檔編號A01G1/04GK101627701SQ20091030566
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月14日 優先權日2009年8月14日
發明者呂尚廉, 鄭傑輝, 坤 項 申請人:鄭傑輝;項 坤