植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法的製作方法
2023-06-13 16:28:06 2
專利名稱：植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法。詳細地說，涉及使用從可以產生好氧性細菌纖維單胞菌屬、厭氧性細菌梭菌屬及/或植物性纖維分解酶的微生物中獲得的植物性纖維分解酶進行的稻草和稻殼等的植物性廢棄物處理法。
背景技術：
稻子耕種或小麥生產、玉米和甘蔗等穀物生產、和豆類生產中，作為由排出的植物纖維形成的廢棄物的處理方法，有在田地焚燒的方法，在焚燒爐中通過重油或輕油等燃料焚燒的方法，或者在植物性廢棄物中混合鋸屑或米糠等堆積製成肥料的方法。然而，用焚燒爐處理的方法需要大量的燃料和運輸費，另外在田地焚燒的方法由於產生的煤煙引起環境汙染(稻草公害)的問題，所以正在討論要禁止焚燒處置。對植物性廢棄物的堆肥化所採取的方法有，通過植物性廢棄物中混合稻草或鋸屑、米糠等，散布熟石灰堆積在原野中使其自然腐蝕的方法；通過在切碎植物性廢棄物的破碎物中混合鋸屑、稻殼、雞糞等調節水分後，加入發酵菌或處理過的堆肥等，在容器中攪拌等進行發酵堆肥化的方法。然而，隨著農業的現代化和機械化，由於植物性廢棄物的堆肥化處理和達到熟化的期間長所以具有不能實施的傾向。因此，該廢棄物儘管認定是有效的資源但仍需要不斷地產業廢棄化。
作為前述以外的植物廢棄物的處理方法，有通過微生物的固定化物處理植物性廢棄物的方法。植物性廢棄物其結構上的原因所以難分解，其主要原因是植物性廢棄物中的纖維素及/或半纖維素引起的。因此，為了處理植物性纖維有效地利用，作為第一階段，即使部分地水解這些纖維素及/或半纖維素也是必要的。作為分解這些纖維素和/或半纖維素的方法，已知有使用由多種菌混合物形成的稻杆等的分解劑的處理方法。特開平8-157285號公報中記載了將膠質、纖維素或半纖維素中的至少一種通過黴菌類或細菌類生產的植物性纖維分解酶分解，製成液狀堆肥的植物性廢棄物的液狀堆肥化的方法。然而，該方法為確保處理廠必須設置處理設備，需要將植物性廢棄物輸送到該處理廠的勞動力。特開平7-2613號公報中記載了在田地直接散布的農藥用細菌製劑。但用該製劑的植物性廢棄物的分解從散布在田地到其效果發現之前，特別是到植物性廢棄物的腐敗熟化，需要很長時間。這是因為通過增殖的微生物產生的植物性纖維分解酶植物性廢棄物得到分解的緣故，即，是因為用該製劑的植物性廢棄物的分解必須要求土壤中該微生物的增殖。
在日本穀倉地帶東北、北海道等寒冷地區中，為了有效地利用已存在的微生物製劑和石灰、氮製劑，該製劑投入田地的作業1次不充分，必須要2次。另外，在稻子耕種中不能分解的廢棄物通過植入田地後發酵產生氣體，阻礙苗的固定和根的生長。
本發明的目的在於，解決現有技術中難於解決的前述處理費用的問題、能量問題、環境問題及處理需要的時間等問題，不依賴於微生物的生存條件，並且不需要輸送含有植物性纖維的廢棄物的植物性廢棄物處理法。
發明內容
本發明通過提供不含有微生物、含有微生物產生的植物性纖維分解酶的植物性纖維分解劑，進一步，通過提供作用於植物性廢棄物的該植物性纖維分解劑形成的植物性廢棄物處理法，解決了前述課題。
本發明的植物性纖維分解劑可以基於以下說明的本發明的實施方式得到，另外，本發明的植物性廢棄物處理法也是可以基於以下本發明的實施方式進行實施。以下，對本發明進行詳細地說明。
具體實施例方式
所謂的本說明書中的植物性纖維分解酶是，具有在土壤中分解植物性纖維作用的微生物產生的酶類，例如，可以舉出纖維素酶、キシラ一ゼ、果膠酶、木聚糖酶、支鏈澱粉酶、葡糖苷酶等。本說明書中的微生物只要是產生植物性纖維分解酶的就不作特別的限制，優選至少產生纖維素酶及/或木聚糖酶的微生物。例如，屬於纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、杆狀菌屬(Bacillus)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、生孢噬纖維菌屬(Sporocytophaga)、醋弧菌屬(Acetivibrio)、梭菌(Clostridium)、Bacteriodes、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、密螺旋體(Treponema)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、Thermonospola屬、毛殼菌屬(Chaetomium)、腐質黴屬(Humicola)、Myceliophthola、孢子絲菌屬(Spototrichium)、踝節菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根黴屬(Thielavia)、支頂孢屬(Acremonium)、Agricus屬、鏈格孢屬(Alternaria)、麴黴屬(Aspergillus)、球二孢屬(Botryodiplodia)、鐮孢屬(Fusarium)、耙菌屬(Irpex)、漆斑菌屬(Myrothecium)、鏈孢黴屬(Neurospora)、薄膜革菌屬(Pellicularia)、青黴屬(Penicillium)、Pestalotiopsis屬、灰側耳菌屬(Pleurotus)、多孔菌屬(Polyporus)、臥孔菌屬(Poria)、密孔菌屬(pycnoporus)、Pyricularia屬、根黴屬(Rhizopus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、小核菌屬(Sclerotium)、Scytalidium屬、Termitomyces屬、栓菌屬(Trametes)、木黴屬(Trichoderma)等的微生物，可以舉出產生植物性纖維分解酶的微生物。這些微生物中，優選屬於纖維單胞菌屬或梭菌屬的微生物產生的植物性纖維分解酶，進一步優選纖維單胞菌屬產生的植物性纖維分解酶。作為具體的優選種，可舉纖維單胞菌sp.K32A(通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所中的委託號FERM BP-6766)菌株及噬纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)ATCC 35296菌株。從在田地具有植物性纖維分解酶功能來看，植物性纖維分解酶優選中溫菌產生的。這裡的中溫菌是指在高溫區域(55℃以上)和在低溫區域(0℃以下)均不能增殖的微生物。另外，因為可以通過纖維素酶或木聚糖酶活性法測定(Walfgang，H.，Analitical Biochem.，第164卷，72～77頁，1987年；Wood，T.M.等，Methods of Enzymology，第160卷，87～112頁，1988年)，所以本領技術人員可以適宜選擇產生植物性纖維分解酶的適當的微生物。進一步，作為本說明書中的植物性纖維分解酶也包括，通過轉基因技術製作含有微生物產生的植物性纖維分解酶基因的微生物或培養細胞等的轉化體，培養該轉化體得到的酶。
在植物性纖維分解酶中存在從植物性纖維末端分解的外源酶和從纖維內部分解的內源酶。本發明中這兩種植物性纖維分解酶都優選。作為本發明中的植物性纖維分解酶優選在10℃～60℃，更優選在15℃～55℃具有酶活性的酶。酶活性可以用本領域技術人員周知的方法測定。例如纖維素酶、キシラ一ゼ、內源葡聚糖酶活性及木聚糖酶活性等的植物性纖維分解酶也可以用前述的現有方法(Walfgang，H.，1987年Analitical Biochem.，第164卷，72頁～77頁；Wood，T.M.等Methods of Enzymology，第160卷，87～112頁，1988年)測定。
本說明書中的植物性纖維分解劑是指含有前述植物性纖維分解酶的植物性纖維分解劑，特別優選含有纖維素酶及/或木聚糖酶中的至少一種。該分解劑的形狀不作特別的限定，例如可以是液狀、粉末狀或顆粒狀等。另外，該分解劑優選含有前述的內源型和外源型這二者的酶。植物性纖維分解劑通過培養可產生前述植物性纖維分解酶的微生物得到。該微生物的培養在使用適合各自的微生物的培養基，適合的條件下實施。它們的培養基和培養條件可以由本領域技術人員適宜選擇及設定。例如，作為培養基的碳源，可以使用濾紙、纖維素粉末等各種纖維質原料，作為氮源，可以使用硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨等胺鹽，硝酸鹽及蛋白腖、肉提取物、玉米浸液、玉米麩質粗粉、棉籽油、脫脂大豆等有機物。也可以添加其他的微量的無機金屬類、維生素類、生長促進因子，例如添加含有硫銨、生物素的酵母提取物等。這些培養基成分只要在不阻礙微生物發育的濃度內就可以，碳源通常使用0.025～0.5重量％較合適。氮源通常使用0.05～1重量％較合適。培養基通常調整在pH6.5～8.5，滅菌後使用。培養溫度的範圍只要是微生物能發育的溫度就可以，可以通過本領域技術人員適宜設定。液體培養，例如培養好氧性微生物時，可以使用前述培養基在通常的振搖培養或通氣攪拌培養下進行。培養厭氧性微生物時，液體培養也是用通常的方法，例如通過在前述培養基上添加適當濃度的還原劑保持在低的氧化還原電位，在20～40℃振搖培養24小時～1周來進行。作為還原劑，可以使用0.03～0.05％L-半胱氨酸鹽酸、0.01～0.2％巰基乙酸鈉、0.001％甲醛次硫酸鈉或0.1％抗壞血酸。為了得到酶，培養到作為培養基的碳源的所使用物例如破碎的濾紙消失為止。
培養結束後，由培養上清或者通過離心分離或過濾培養上清得到粗酶液，可以使用這些培養上清或粗酶液作為本發明的植物性纖維分解劑。或者，可以是通過超濾法對培養上清濃縮的濃縮物，也可以是通過適當採用硫銨鹽析法、溶劑沉澱法、透析法或冷凍乾燥法等常法的粗酶粉末。另外，也可以將通過在粗酶液中加入アビセル等纖維素使纖維素酶活性成分等吸附後溶出吸附的成分得到的精製酶液作為植物性分解劑使用。
本說明書中的植物性廢棄物是，稻子耕種或小麥生產、玉米、甘蔗等穀物、豆類或薯類等生產中排出的含有植物性纖維的廢棄物。具體來說，作為植物性廢棄物，例如有稻草、稻殼、麥杆、甘蔗渣(甘蔗榨完的粕、玉米芯)及薯類的蔓等，進一步有落葉和木片等。
本說明書中的植物性廢棄物處理法，除了使用前述植物纖維分解劑以外，不作特別的限制，例如，可以對農作物收穫後殘留在田地的植物性廢棄物通過直接散布植物性纖維分解劑在野外實施。從使植物性纖維分解劑高效率起作用的觀點看，在該分解劑發生作用前預先破碎植物性廢棄物較好。作為植物性廢棄物的破碎法，可舉例如通過コンバイン收穫的同時切斷稻稈等的方法，使用鎖鋸等切斷樹木的方法，使用對樹木薄片化的破碎裝置的破碎方法，或者通過設置了粉碎器具或切斷用刃的處理裝置裁斷和粉碎的方法。另外，植物性廢棄物處理優選在20℃～50℃的溫度條件下實施。在利用大棚栽培等溫室下使用本發明的植物性纖維分解劑時，優選室內加溫到40℃～50℃。在野外的一般田地中，也可與市售的微生物製劑、石灰氮製劑等犁入劑，有機質肥料，化學肥料，堆肥和/或土壤改良劑並用。
實施例以下，舉實施例對本發明進行說明，本發明並不限於這些實施例。
實施例1在纖維單胞菌sp.K32A的前培養中使用50mL的L-Broth(酵母提取物5g/L，蛋白腖10g/L，氯化納5g/L)。在該前培養基中接種該K32A的單菌落，用旋轉振蕩機(商品名G10 Gyrotory shaker，New Brunswick scientific制)在37℃振蕩培養(250rpm，振幅10mm)一夜，進行前培養，得到前培養液。然後，使用添加了0.05％アビセル(商品名)的1/5PYT培養基(酵母提取物1g/L，胰化蛋白腖1g/L，蛋白腖1g/L)250mL作為本培養的培養基，在該本培養培養基中接種1％前培養液，37℃下振蕩培養(250rpm，振幅10mm)，進行本培養(約72小時)，直到基質アビセル消失。培養結束後，離心分離(6000rpm，10分鐘)，得到培養上清。過濾滅菌培養上清，加入硫酸銨(80％)直到飽和為止，沉澱上清中的蛋白質。將沉澱的蛋白質溶解在50mM嗎啉丙烷磺酸(以下，簡稱為M0PS)、10mM CaCl2和1mM NaN3的緩衝液，透析，將其作為粗酶液。調製的粗酶液中的蛋白質濃度為2mg/mL。
在該粗酶液5mL中加入作為基質的1g稻草或稻殼，在表1和表2記載的溫度下分別反應72小時或1周。反應結束後離心(3500rpm，2000xg下15分鐘)，在得到的沉澱物中加入滅菌水，用離心機(商品名KN-70，クボタ制)離心(3500rpm，15分鐘)，洗滌3次，冷凍乾燥後用天平測定沉澱物的重量。將從初期重量中減去反應後重量的重量佔初期重量的百分率作為除去率。結果示於表1和表2。
表1
表2
實施例2在含有10mM CaCl2和1mM NaN3的50mM MOPS緩衝液(pH7.0)中加入作為基質的1％稻殼50mL中，作為蛋白質質量，加入實施例1得到的K32A的粗酶液1mg，在50℃下保溫24小時。保溫後，離心分離，冷凍乾燥沉澱成分，將乾燥重量與對照組(沒有加粗酶液)進行比較。其結果，加入粗酶液的重量與對照組比較減少了30～32％。通過目視觀察離心分離前的溶液時，觀察到稻殼一部分溶解。
實施例3在添加0.1％磷酸處理過的アビセル厭氧調製的1/5PTY培養基250mL中接種噬纖維梭菌(ATCC 35296)的單菌落，在37℃下振蕩培養(250rpm，振幅10mm)，培養約72小時。培養結束後，離心分離(6000rpm，10分鐘)，得到培養上清。然後，過濾滅菌培養上清，加入硫酸銨(80％)直到飽和為止，沉澱上清中的蛋白質。將沉澱的蛋白質溶解在50mM磷酸-12mM檸檬酸緩衝液中，透析，將其作為粗酶液。調製的粗酶液中的蛋白質濃度為2mg/mL。
在該粗酶液5mL中加入基質1g稻草或稻殼，在表3和表4記載的溫度下分別反應72小時或1周。反應結束後離心(3500rpm，2000xg下15分鐘)，在得到的沉澱物中加入滅菌水，用離心機(商品名KN-70，クボタ制)離心(3500rpm，15分鐘)，洗滌3次，冷凍乾燥後用天平測定沉澱物的重量。將從初期重量中減去反應後重量的重量佔初期重量的百分率作為除去率。結果示於表3和表4。
表3
表4
本發明提供一種用比現有技術少的勞動力處理植物性廢棄物的有效的植物性廢棄物處理法。採用本發明，可以在田地等野外處理植物性廢棄物，可以解決現有技術中難於解決的前述處理費用的問題、能量問題、環境問題及處理需要的時間等問題，不依賴於微生物的生存條件處理植物性纖維廢棄物。
權利要求
1.植物性纖維分解劑，其中不含有微生物、而含有微生物產生的植物性纖維分解酶。
2.權利要求1所述的植物性纖維分解劑，其中，前述微生物是屬於纖維單胞菌屬的微生物。
3.權利要求1所述的植物性纖維分解劑，其中，前述微生物是屬於梭菌屬的微生物。
4.植物性廢棄物處理法，其特徵在於，所述方法由將不含有微生物、而含有微生物產生的植物性纖維分解酶作用於植物性廢棄物形成。
5.權利要求4所述的處理法，其中，植物性廢棄物選自稻草、稻殼、麥杆、甘蔗渣、薯類的蔓、落葉或木片。
6.權利要求4所述的處理法，其包括在前述植物性纖維分解劑作用前破碎植物性廢棄物的工序。
7.權利要求4所述的處理法，其在20℃～50℃的溫度條件下實施。
8.權利要求4所述的處理法，其在田地實施。
全文摘要
本發明涉及植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法。本發明提供一種不含有微生物、而含有微生物產生的植物性纖維分解酶，及簡便處理該廢棄物的方法，解決了現有技術中難於解決的前述處理費用的問題、能量問題、環境問題及處理需要的時間等問題。
文檔編號C12N9/14GK1486364SQ01821871
公開日2004年3月31日 申請日期2001年12月28日 優先權日2001年1月10日
發明者亦野浩 申請人:株式會社美你康