一種分離不同組織來源細胞的方法
2023-06-13 03:20:46 1
專利名稱：一種分離不同組織來源細胞的方法
技術領域：
本發明涉及特定細胞的分離方法，特別是涉及一種分離不同組織來源細胞的方法。
背景技術：
目前，分離組織原代細胞的方法主要有機械法和灌流法，但是兩種方法都存在著 明顯的優缺點。通過機械法消化組織分離原代細胞，雖然僅需要簡單的手術器械，且方法簡便易 行，易操作易掌握，但是由於在機械分離組織的過程中，細胞需要承受較大的機械力，因此， 分離出來的細胞往往生長緩慢，需要較長時間恢復狀態。此外，機械裁剪的組織在消化的過 程中，不易消化完全，使得得到的細胞數極少。通過灌流法分離組織來源的細胞，雖然能夠使組織得到充分的消化，但是此方法 需要的手術器械較多，方法不易掌握，且需要經過長時間的練習。此外，由於膠原酶滯留在 組織中，無法觀察組織消化的情況，不易把握消化的時間。但是，使用該方法分離出來的細 胞狀態較好。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡單易行的分離不同組織來源細胞的方法。為解決上述技術問題，本發明採取以下技術方案一種分離不同組織來源細胞的 方法，是將混有膠原酶的組織置於裝有磁力攪拌棒的容器內，再將容器放置在磁力攪拌器 上，打開磁力攪拌器電源，在60-200rpm下調整溫度至35_37°C，然後在此溫度、60-200rpm 下消化10-40分鐘，得到組織原代細胞。在上述方法中，所述組織的來源是多種多樣的，如脂肪組織、肝臟組織、肺組織、腦 組織和胰腺組織等組織。所述膠原酶的選擇也是多種多樣的，如Collagenase IXollagenase IV,Dispase 酶或胰酶等，優選為CollagenaselV。所述膠原酶的濃度可為0. 05% -0. 1% (V/V)，優選為 0. 075%。添加膠原酶的作用為分解組織，從而使組織中的細胞和基質分離。為獲得更好的分離效果，所述待分離組織中還混有l_2mL 1% -3% (V/V)BSA和/ 或0. 1 % -0. 3% (V/V)青黴素和鏈黴素(購自Gibcol公司)。所述BSA的濃度優選為2%， 所述雙抗的濃度優選為0. 2%。添加BSA的作用為保護和基質分離後的細胞，添加雙抗的作 用為防止汙染。所述消化過程還可分成三次進行，第一次消化10分鐘，以後每次消化8分鐘，反覆 消化3次，具體消化時間可視消化情況而定。消化完成後，可將經消化的組織用吸管輕輕吹打，使消化下來的細胞徹底從組織 團快上掉下來，以免損壞細胞。如果經觀察發現組織分解較徹底，自然分層，還可用100-300目濾網進行過濾，然後在800-1500rpm下離心5_10分鐘，移出上層液體後再在800-1500rpm下離心5_10分鐘， 棄上層液體。移出上層液體後，如果見沉澱混有紅細胞，可用PBS吹洗後離心；移出上層液 體後，如果見沉澱仍混有較多紅細胞，還可加入紅細胞裂解液和/或0. 1% -0. 3% (V/V)青 黴素和鏈黴素，吹勻後在室溫下靜置5-20分鐘，離心，移出上層液體；此外，還可將細胞沉 澱用PBS吹洗，然後離心，移出上層液體，得到經純化的組織原代細胞。用上述方法分離得到的不同組織來源的原代細胞也屬於本發明的保護範圍。本發明提供了一種分離組織原代細胞的方法。該方法具有以下優點1)需要的器 械較簡單，方法簡單易操作，易迅速掌握；2)能夠全程觀察消化組織的狀態，容易把握膠原 酶消化的程度，因此，能夠較好地把握膠原酶消化的時間，並且及時終止消化，使分離出來 的細胞有較好的狀態；幻磁力攪拌能夠更好的使組織得到充分的消化，所產生的剪切力較 柔和，細胞受力均勻，不易破壞細胞，因此分離得到的細胞狀態較好。基於上述優點，本發明 為特定組織原代細胞的分離提供了一條新途徑，具有較高的實際應用價值。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為分離的脂肪組織細胞圖2為分離的肝臟組織細胞圖3為分離的胎兒肝臟組織來源的原代基質細胞
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。本發明方法涉及的起始原料 是那些已經離體的具有商業來源的各種組織，本方法的要旨是提供從這些組織中獲取原代 細胞的過程。實施例中獲取各種組織的步驟僅作為實驗室實驗的一種來源，不構成對本發 明的限定。實施例1、分離脂肪組織原代細胞以脂肪組織(脂肪組織來源於吸脂手術中取出的組織)為例，用本發明的方法分 離脂肪組織原代細胞，具體方法包括以下步驟1)將50mL吸脂組織加入無菌50mL離心管中，1300rpm離心2分鐘，離心後吸出下
層吸脂麻醉藥；2)將脂肪組織用等體積的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS，pH7. 3，Gibcol公司)洗滌脂肪 組織後，1300rpm離心2分鐘，離心後吸出下層洗滌液棄除；3)加入Collagenase IV膠原酶(sigma公司)，並將膠原酶濃度調整至0. 075% (V/V，0. 05%-0. 均可)，再加入 2% (V/V，l%-3%均可)BSA 1. 5mL(l_2mL 均可)和 0. 2% (V/V,0. 1% -0.3%均可)青黴素和鏈黴素。4)將混有Collagenase IV膠原酶的脂肪組織置於裝有磁力攪拌棒(德國IKA公 司)的三角燒杯(英達爾科儀製造有限公司)內，使用密封條纏繞三角燒杯杯口，檢查密封 完全後，把溫度計和三角燒杯放入250mL燒瓶(英達爾科儀製造有限公司)中。注意事先 調整好水量，不要沒過三角燒杯，並注意使溫度均勻。5)將燒瓶放置在磁力攪拌器(德國IKA公司)上，打開磁力攪拌器電源，調整溫度，使其緩慢加到35-37°C。注意在此升溫過程中，轉速不可過快，否則會打碎細胞，基本 上與燒杯上的標誌平行即可，一定要注意監控。6)待溫度達到37°C (35-37°C均可)時開始計時，在60_200rpm下，第一次消化10 分鐘，後兩次各為8分鐘(可視消化情況而定，10-40分鐘均可)，反覆消化3次。7)待消化完成後，把三角燒瓶取下，關上磁力攪拌器，用吸管輕輕吹打(使消化下 來的細胞徹底從組織團快上掉下來)，以免損壞細胞。8)經觀察發現脂肪組織分解較徹底，自然分層，用200目(100-300目均可)濾網 過濾後，IlOOrpm(800-1500rpm均可)離心5分鐘(5-10分鐘均可)，移出上層油脂後離心， 1 IOOrpm (800-1500rpm均可)離心5分鐘(5-10分鐘均可)。9)移出上層液體，見沉澱混有紅細胞，用IOmL PBS(pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後 離心，IlOOrpm離心5分鐘。10)移出上層液體，見沉澱仍有較多紅細胞，加入IOmL紅細胞裂解液(購自 BectonDickinson，BD公司)和0.2% (V/V，0. 1 %-0. 3%均可)青黴素和鏈黴素，吹勻後室 溫下靜置10分鐘(5-20分鐘均可)，IlOOrpm離心5分鐘，移出上層液體。12)用IOmL PBS (pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後離心，IlOOrpm離心5分鐘，移出上 層液體，用添加有10%胎牛血清(Gibcol公司)的IOmLa-MEM(Gibcc)I公司)吹勻細胞，等 分，接種至3個培養瓶內(可根據細胞濃度由低到高分為1、2、3號)。13)將培養瓶置於孵養箱中，在37°C、5% CO2下培養3天。培養結束後，在Olympus 倒置顯微鏡(Olympus)下觀察細胞形態，結果細胞呈成纖維細胞樣(見圖1)，表明用本發明 的方法得到了細胞形態較好的脂肪組織原代細胞。實施例2、分離肝臟組織原代細胞肝臟組織的獲取用一把大鑷子從鼠盆裡取出一隻生後2-3天的SD大鼠(購自中 國人民解放軍軍事醫學科學院動物實驗中心)，置於0. 新潔爾滅(購自德州樂康消毒制 品有限公司)溶液中浸泡20-30S後拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定(位置擺正)，用另 一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開皮，充分撕拉 開，再用酒精棉球消毒，開腹腔取肝臟。然後將取出的肝臟放在下述步驟1)準備的一個裝有DMEM培養基的圓皿中，用剪 子和鑷子把圓皿中的肝臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個預先裝有DMEM培養 基的圓皿中，將其剪成Imm3的碎塊。以下以肝臟組織為例，用本發明的方法分離肝臟組織原代細胞，具體方法包括以 下步驟1)把兩個5mL注射器分別插入DMEM培養基(購自Gibcol公司)和Collagenase IV膠原酶(購自Gibcol公司)中，分別向兩個圓皿中加入5mL DMEM培養液。2)向放有組織的平皿中加入Collagenase IV膠原酶(sigma公司)，並將膠原酶濃 度調整至 0.1% (V/V，0. 05%-0. 均可)，再加入 3% (V/V，l%-3%均可)BSA 2mL(l_2mL 均可)和0.3% (V/V,0. 1% -0.3%均可)青黴素和鏈黴素(購自Gibcol公司)。3)將混有Collagenase IV膠原酶的肝臟組織置於裝有磁力攪拌棒(德國IKA公 司)的三角燒杯(英達爾科儀製造有限公司)內，使用密封條纏繞三角燒杯杯口，檢查密封 完全後，把溫度計和三角燒杯放入250mL燒瓶(英達爾科儀製造有限公司)中。注意事先調整好水量，不要沒過三角燒杯，並注意使溫度均勻。4)將燒瓶放置在磁力攪拌器(德國IKA公司)上，打開磁力攪拌器電源，調整溫 度，使其緩慢加到35-37°C。注意在此升溫過程中，轉速不可過快，否則會打碎細胞，基本 上與燒杯上的標誌平行即可，一定要注意監控。5)待溫度達到36°C (35-37°C均可)時開始計時，在60_200rpm下，第一次消化10 分鐘，後兩次各為9分鐘(可視消化情況而定，10-40分鐘均可)，反覆消化3次。6)待消化完成後，把三角燒瓶取下，關上磁力攪拌器，用吸管輕輕吹打(使消化下 來的細胞徹底從組織團快上掉下來)，以免損壞細胞。7)經觀察發現肝臟組織分解較徹底，自然分層，用300目(100-300目均可)濾網 過濾後，1500rpm(800-1500rpm均可)離心10分鐘(5_10分鐘均可)，移出上層油脂後離心， 800rpm(800-1500rpm均可)離心10分鐘(5-10分鐘均可)。8)移出上層液體，見沉澱混有紅細胞，用IOmL PBS(pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後 離心，IlOOrpm離心5分鐘。9)移出上層液體，見沉澱仍有較多紅細胞，加入IOmL紅細胞裂解液(購自 BectonDickinson, BD公司)和0. (V/V，0. 1% -0.3%均可)青黴素和鏈黴素(購自 Gibcol公司)，吹勻後室溫下靜置20分鐘(5-20分鐘均可)，IlOOrpm離心5分鐘，移出上
層液體。10)用IOmL PBS (pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後離心，IlOOrpm離心5分鐘，移出上 層液體，用添加有10%胎牛血清(Gibcol公司)的IOmL α -MEM(Gibcol公司)吹勻細胞， 等分，接種至3個培養瓶內(可根據細胞濃度由低到高分為1、2、3號)。11)將培養瓶置於孵養箱中，在37°C、5% CO2下培養3天。培養結束後，在Olympus 倒置顯微鏡(Olympus)下觀察細胞形態，結果細胞呈多角形(見圖幻，表明用本發明的方法 得到了細胞形態較好的肝臟組織原代細胞。實施例3、分離胎兒肝臟組織來源的原代基質細胞以胎兒肝臟組織(胎兒肝臟組織來源於流產胎兒)為例，用本發明的方法分離脂 肪組織原代細胞，具體方法包括以下步驟1)把兩個5mL注射器分別插入DMEM培養基(購自Gibcol公司)和Collagenase IV膠原酶(購自Gibcol公司)中，分別向兩個圓皿中加入5mL DMEM培養液。2)向放有組織的平皿中加入Collagenase IV膠原酶(sigma公司)，並將膠原酶濃 度調整至 0.1% (V/V，0. 05%-0. 均可)，再加入 3% (V/V，l%-3%均可)BSA 2mL(l_2mL 均可)和0.3% (V/V,0. 1% -0.3%均可)青黴素和鏈黴素(購自Gibcol公司)。3)將混有Dispase酶(請提供一種其它可用的膠原酶)的胎兒肝臟組織置於裝有 磁力攪拌棒(德國IKA公司)的三角燒杯(英達爾科儀製造有限公司)內，使用密封條纏 繞三角燒杯杯口，檢查密封完全後，把溫度計和三角燒杯放入250mL燒瓶(英達爾科儀製造 有限公司)中。注意事先調整好水量，不要沒過三角燒杯，並注意使溫度均勻。5)將燒瓶放置在磁力攪拌器(德國IKA公司)上，打開磁力攪拌器電源，調整溫 度，使其緩慢加到35-37°C。注意在此升溫過程中，轉速不可過快，否則會打碎細胞，基本 上與燒杯上的標誌平行即可，一定要注意監控。6)待溫度達到35°C (35-37°C均可)時開始計時，在60_200rpm下，第一次消化10分鐘，後兩次各為15分鐘(可視消化情況而定，10-40分鐘均可)，反覆消化3次。7)待消化完成後，把三角燒瓶取下，關上磁力攪拌器，用吸管輕輕吹打(使消化下 來的細胞徹底從組織團快上掉下來)，以免損壞細胞。8)經觀察發現胎兒肝臟組織分解較徹底，自然分層，用100目(100-300目均可) 濾網過濾後，800rpm(800-1500rpm均可)離心5分鐘(5-10分鐘均可)，移出上層油脂後離 心，1200rpm(800-1500rpm均可)離心8分鐘(5-10分鐘均可)。9)移出上層液體，見沉澱混有紅細胞，用IOmL PBS(pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後 離心，IlOOrpm離心5分鐘。10)移出上層液體，見沉澱仍有較多紅細胞，加入IOmL紅細胞裂解液(購自 BectonDickinson, BD公司)和0. 1 % (V/V，0. 1% -0.3%均可)青黴素和鏈黴素(購自 Gibcol公司)，吹勻後室溫下靜置5分鐘(5-20分鐘均可)，IlOOrpm離心5分鐘，移出上層 液體。12)用IOmL PBS (pH7. 3，Gibcol公司)吹洗後離心，IlOOrpm離心5分鐘，移出上 層液體，用添加有10%胎牛血清(Gibcol公司)的IOmL α -MEM(Gibcol公司)吹勻細胞， 等分，接種至3個培養瓶內(可根據細胞濃度由低到高分為1、2、3號)。13)將培養瓶置於孵養箱中，在37°C、5% CO2下培養3天。培養結束後，在Olympus 倒置顯微鏡(Olympus)下觀察細胞形態，結果胎兒肝臟來源的基質細胞呈成纖維細胞樣 (見圖3)，表明用本發明的方法得到了細胞形態較好的胎兒肝臟組織來源的原代基質細 胞。
權利要求
1.一種分離不同組織來源細胞的方法，是將混有膠原酶的組織置於裝有磁力攪拌棒的 容器內，再將容器放置在磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器電源，在60-200rpm下調整溫度至 35-37°C，然後在此溫度、60-200rpm下消化10-40分鐘，得到組織原代細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述膠原酶為CollagenaseI、 Collagenase IV、Dispase 酶或胰酶。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述膠原酶的濃度為0.05% -0. 1%。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述待分離組織中還混有l_2mL -3% BSA和/或0. -0.3%青黴素和鏈黴素(購自Gibcol公司)。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述消化過程還可分成三次進行，第一次 消化10分鐘，以後每次消化8分鐘。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於消化完成後，可將經消化的組織用吸管輕 輕吹打。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特徵在於如果組織分解較徹底，自然分 層，還可用100-300目濾網進行過濾，然後在800-1500rpm下離心5-10分鐘，移出上層液體 後再在800-1500rpm下離心5_10分鐘，棄上層液體。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於移出上層液體後，如果見沉澱混有紅細 胞，可用PBS吹洗後離心；移出上層液體後，如見沉澱仍混有較多紅細胞，還可加入紅細胞 裂解液和/或0. 1% -0.3%雙抗，吹勻後在室溫下靜置5-20分鐘，離心，移出上層液體；此 外，還可將細胞沉澱用PBS吹洗，然後離心，移出上層液體，得到經純化的組織原代細胞。
9.用權利要求1-8任一項所述方法分離得到的不同組織來源的原代細胞。
全文摘要
本發明公開了一種分離不同組織來源細胞的方法。該方法是將混有膠原酶的組織置於裝有磁力攪拌棒的容器內，再將容器放置在磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器電源，在60-200rpm下調整溫度至35-37℃，然後在此溫度、60-200rpm下消化10-40分鐘，得到組織原代細胞。本發明具有以下優點1)需要的器械較簡單，方法簡單易操作，易迅速掌握；2)能夠全程觀察消化組織的狀態，容易把握膠原酶消化的程度，使分離出來的細胞有較好的狀態；3)磁力攪拌能夠更好的使組織得到充分的消化，所產生的剪切力較柔和，細胞受力均勻，不易破壞細胞，因此分離得到的細胞狀態較好。
文檔編號C12N5/077GK102093979SQ200910250329
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月14日 優先權日2009年12月14日
發明者南雪, 師偉, 滕越, 王韞芳, 白慈賢, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所