天然活性蛋白質和肽的分離純化方法
2023-06-13 19:50:06 1
專利名稱：天然活性蛋白質和肽的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及天然活性蛋白質和肽的分離純化方法，屬於生物製品加工領域。
我國是農業大國，動物皮、卵清、大豆或玉米等天然原料相當豐富，它們都富含蛋白質。就現有的應用水平來說，還處在初級階段，造成了資源的極大浪費和環境的汙染，經濟效益低下。
由天然蛋白質原料提取的活性蛋白質和肽是分子量大小不同片段的混合物，研究表明天然蛋白質和肽具有很多生理功能，某些天然肽片段具有特殊的生物活性和功能。天然蛋白質肽和其他蛋白質一樣，不同分子結構和分子大小的蛋白質肽，也具有不同的生物活性，其應用也各不相同。因此，按不同的應用目的將其進行分離純化，是對天然蛋白質和肽深度開發和利用的核心技術，是將天然蛋白質和肽製備技術進行升級的關鍵。若能利用現代分離手段，分離純化出不同級分的活性蛋白質和肽，將其進一步深加工為具有特殊功能的醫藥保健、生物醫學材料、美容整形品等，其社會效益、經濟效益將更顯著。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
天然活性蛋白質和肽的分離純化方法1、將富含蛋白質的天然原料，經脫脂、清洗並進行勻漿，稱取勻漿後的原料100份和去離子水100～250份加入到生化反應器中，調節pH＝5～8，升溫70～90℃，保溫攪拌10～30分鐘，然後迅速降溫至30～50℃，加入複合蛋白酶0.02～0.5份，攪拌均勻後，進行酶解反應，獲得蛋白質和肽的混合物，採用經OMEGA技術處理的聚醚碸超低蛋白質吸附膜和切向流超濾技術，將蛋白質和肽的混合物按分子量的大小進行分級；2、採用離子交換色譜分離模式，其分離純化的條件色譜柱陰離子交換柱，有效孔徑10～30nm；流動相A0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，B0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；流速50～100毫升/分；梯度經10～30分鐘流動相由0.001～0.5摩爾/升Tris-HCl(pH＝6.0～8.0)到0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；柱溫20～25℃；進樣量50～100毫升；紫外檢測260nm。
3、離子交換色譜的操作步驟如下
(1)色譜柱的平衡0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，衝洗至基線平穩；(2)上樣50～100毫升；(3)淋洗0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基線平穩；(4)洗脫0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)，線性梯度洗脫，並收集相應的餾分；(5)清洗分別用0.5M NaOH和1.5M NaCl進行清洗和再生；4、將所收集到的各餾分，經過透析、分別冷凍保存。
本發明具有如下優點1、由於在低溫操作，可以保證天然蛋白和肽的的活性回收；2、離子交換色譜具有濃縮作用，可在較高流速下進行操作；3、採用離子交換樹脂填料和一般酸鹼鹽緩衝液作為洗脫劑，其運行成本低，而且產品回收率高；4、由於離子交換色譜的介質材料，以及含鹽的緩衝流動相十分類似於蛋白質穩定存在的生理液條件，有利於增加活性回收率；5、採用離子交換色譜分離純化技術，無相變發生，無致熱源導入，不使用有機溶劑，不改變溶液pH值和離子強度，這些都有利於天然蛋白和肽活性的保留；6、整個工藝無三廢產生，為環境友好的綠色工藝，其產品是安全綠色的。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用於對本發明進行進一步的說明，但不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容作出一些非本質的改進和調整。
實施例1、天然活性膠原蛋白和肽的分離純化(1)將動物皮用3％ Na2CO3溶液進行脫脂，用去離子水漂洗3次，進行勻漿，稱取勻漿後的原料100千克與去離子水150千克混合，加入到生化反應器中；調節pH＝7，溫度85℃，攪拌保持10分鐘，迅速降溫至40℃；加入複合蛋白酶20克，攪拌均勻後酶解，獲得蛋白質和肽的混合物，根據天然活性蛋白質和肽不同的用途，採用經OMEGA技術處理的聚醚碸超低蛋白質吸附膜和切向流超濾技術，將蛋白質和肽的混合物按分子量的大小進行分級；(2)採用離子交換色譜分離模式，其分離純化的條件色譜柱陰離子交換柱，有效孔徑25nm；流動相A0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，B0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；流速50～100毫升/分；梯度經10～30分鐘流動相由0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)到0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；柱溫20～25℃；進樣量50～100毫升；紫外檢測260nm。
(3)離子交換色譜的操作步驟如下a.色譜柱的平衡0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，衝洗至基線平穩；b.上樣50～100毫升；c.淋洗0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基線平穩；d.洗脫0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)，線性梯度洗脫，並收集相應的餾分；e.清洗分別用0.5M NaOH和1.5M NaCl進行清洗和再生；(4)將所收集到的各餾分，經過透析、分別冷凍保存。
2、天然活性大豆、玉米蛋白和肽的分離純化(1)將經過嚴格檢驗的大豆或玉米，進行清洗、壓榨、脫脂並勻漿，稱取勻漿後的原料100千克與去離子水100千克混合，加入到生化反應器中；調節pH＝7，升溫至40℃；加入複合蛋白酶25克，攪拌均勻後酶解，獲得蛋白質和肽的混合物，根據天然活性蛋白質和肽不同的用途，採用經OMEGA技術處理的聚醚碸超低蛋白質吸附膜和切向流超濾技術，將蛋白質和肽的混合物按分子量的大小進行分級；(2)採用離子交換色譜分離模式，其分離純化的條件
色譜柱陰離子交換柱，有效孔徑10nm；流動相A0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，B0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；流速50～100毫升/分；梯度經10～30分鐘流動相由0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)到0.1～1.0摩爾/升 NaCl(pH＝6.0～8.0)；柱溫20～25℃；進樣量50～100毫升；紫外檢測260nm。
(3)離子交換色譜的操作步驟如下a.色譜柱的平衡0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，衝洗至基線平穩；b.上樣50～100毫升；c.淋洗0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基線平穩；d.洗脫0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)，線性梯度洗脫，並收集相應的餾分；e.清洗分別用0.5M NaOH和1.5M NaCl進行清洗和再生；(4)將所收集到的各餾分，經過透析、分別冷凍保存。
權利要求
1.天然活性蛋白質和肽的分離純化方法，其特徵在於(1)將富含蛋白質的天然原料，經脫脂、清洗並進行勻漿，稱取勻漿後的原料100重量份和去離子水100～250重量份加入到生化反應器中，調節pH＝5～8，升溫70～90℃，保溫攪拌10～30分鐘，然後迅速降溫至30～50℃，加入複合蛋白酶0.0～0.5重量份，攪拌均勻後，進行酶解反應，獲得蛋白質和肽的混合物，採用經OMEGA技術處理的聚醚碸超低蛋白質吸附膜和切向流超濾技術，將其按分子量的大小進行分級後，再進行離子交換色譜模式的分離純化；(2)採用離子交換色譜分離模式，其分離純化的條件色譜柱陰離子交換柱，有效孔徑10～30nm；流動相A0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，B0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；流速50～100毫升/分；梯度經10～30分鐘流動相由0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)到0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)；柱溫20～25℃；進樣量50～100毫升；紫外檢測260nm。(3)離子交換色譜的操作步驟如下a.色譜柱的平衡0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，衝洗至基線平穩；b.上樣50～100毫升；c.淋洗0.001～0.5摩爾/升磷酸鹽緩衝液(pH＝6.0～8.0)，淋洗至基線平穩；d.洗脫0.1～1.0摩爾/升NaCl(pH＝6.0～8.0)，線性梯度洗脫，並收集相應的餾分；e.清洗分別用0.5M NaOH和1.5M NaCl進行清洗和再生色譜柱；(4)將所收集到的各餾分，經過透析、分別冷凍保存。
全文摘要
天然活性蛋白質和肽的分離純化方法，其特點是將富含蛋白質的天然原料，經脫脂、清洗並進行勻漿，稱取勻漿後的原料100重量份和去離子水100～250重量份加入到生化反應器中，調節pH＝5～8，升溫70～90℃，保溫攪拌10～30分鐘，然後迅速降溫至30～50℃，加入複合蛋白酶0.02～0.5重量份，攪拌均勻後，進行酶解反應，獲得蛋白質和肽的混合物，採用經OMEGA技術處理的聚醚碸超低蛋白質吸附膜和切向流超濾技術，將其按分子量的大小進行分級後，再通過離子交換色譜分離模式純化，即陰離子交換柱，磷酸鹽緩衝系統，色譜柱的平衡、上樣、淋洗、洗脫等工序，獲得不同分子量和不同分子結構的純天然活性蛋白和肽。
文檔編號C12P21/00GK1403582SQ0213346
公開日2003年3月19日 申請日期2002年7月12日 優先權日2002年7月12日
發明者謝君, 張義正, 張銘讓, 張強, 徐寧, 舒子斌 申請人:成都心友生物技術有限責任公司