用於純化蛋白質的方法

2023-06-13 19:49:56 2

專利名稱：用於純化蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及重組微生物生物質加工和酶的純化領域。更具體地，提供了利用微量過濾改進部分地純化和/或濃縮具有過氧水解活性的棲熱袍菌屬(Thermotoga sp.)乙醯木聚糖酯酶的能力的方法。
背景技術：
過氧羧酸組合物可為有效的抗微生物劑。已經描述了使用過氧羧酸清潔、滅菌和/ 或消毒硬質表面、織物、肉製品、活植物組織和醫療器械以殺滅不良微生物生長的方法(美國專利公開6，545, 047 ;美國專利公開6，183,807 ;美國專利公開6，518，307 ;美國專利申請公布2003-0026846 ;和美國專利公開5，683，724)。過氧羧酸也已被用於多種漂白應用中，包括但不限於木漿漂白/去木質化和衣物洗滌護理應用(歐洲專利1040222B1 ;美國專利公開5，552，018 ;美國專利公開3，974，082 ;美國專利公開5，296，161 ;和美國專利公開5，364，554)。在Imin至5min反應時間內和中性至鹼性pH下，所期望的過氧羧酸有效濃度可以根據產品的應用而變化(例如，對於中性PH下的醫療器械消毒而言大約500ppm至lOOOppm，對於衣物漂白或消毒應用而言大約30ppm至80ppm)。結構上被歸類為糖酯酶家族7 (CE-7)的成員的酶，已被用作過水解酶(perhydrolases),於鹼性至酸性pH範圍(從大約pH 10至大約pH 5)在水中催化過氧化氫(或替代性的過氧化物試劑)與羧酸的烷基酯的反應，以產生有效濃度的過氧羧酸，所述過氧羧酸用於諸如消毒(例如醫療器械、硬質表面、紡織品)、漂白(例如木漿或紙漿加工/去木質化、紡織品漂白和衣物洗滌護理應用)、以及其他衣物洗滌護理應用如脫色、除臭、和消毒的應用(公布於DiCosimo等人的美國專利申請2008-0176783、2008-0176299、
2009-0005590、和2010-0041752中)。CE-7酶類已被發現具有針對酯類尤其是醇、二醇和三醇的乙醯基酯類的過水解的高的特異性活性。DiCosimo等人的公布的美國專利申請
2010-0087529描述了來源於幾種棲熱袍菌屬的幾種變體CE-7過水解酶，所述變體CE-7過水解酶當被用於從羧酸酯類製備過氧羧酸時具有較高的過水解特異性活性和/或改進的針對過水解的選擇性。公布的美國專利申請2010-0087529中描述的變體中的一種，海棲熱袍菌(Thermotoga maritima) C277S,表現出相對於海棲熱袍菌(T. maritima)野生型酶顯著改進的特異性活性。酶的重組微生物生產經常包括用以從生物質的其他組分部分或完全地純化和/或濃縮所述重組酶的一個或多個下遊的生物質處理步驟。然而，當在微量過濾膜上過濾或濃縮蛋白質製備物時遇到了很大的困難。過濾的目的是使包含過水解酶的溶液通過膜，同時在保留物中保留大於O. 2微米或O. 45微米的微粒。蛋白質經常至少部分地被膜保留而不是通過膜，而膜的孔隙率是使得所述蛋白質應當自由地通過它。可以不利地影響回收和/或濃縮所期望的酶催化劑的能力的生物質組分之一，是DNA在細胞勻漿中的存在。然而，外源的脫氧核糖核酸酶(DNAse)的添加可能不是高性價比的，尤其是對於工業規模的發酵，並且哺乳動物來源的DNAse的使用在代加工發酵中可能是不合乎期望的。有待解決的問題是提供容易的和高性價比的方法來獲得包含具有過水解活性(perhydrolytic activity)的重組酶的濃縮物,優選不包括外源的脫氧核糖核酸酶的使用的方法。發明概沭通過提供適用於處理包含至少一種具有過水解活性的嗜熱酶的微生物細胞勻漿的兩階段熱處理方法，已解決了上述問題。經熱處理的微生物細胞勻漿中的不溶性組分被移除，而所得到的包含過水解酶的溶液隨後被濃縮，以產生包含所述過水解酶的濃縮物。 在一個實施方案中,提供了方法,所述方法包括a)提供包含可溶性和不溶性組分的微生物細胞勻漿，其中所述微生物細胞勻漿包含重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶；b)使所述微生物細胞勻漿在40°C至65°C的溫度範圍內經受至少4小時但不超過24小時範圍的第一熱處理；c)使來自步驟b)的經熱處理的微生物細胞勻漿在75°C至85°C的溫度範圍內經受5分鐘至4小時範圍的第二熱處理；d)通過離心或過濾從進行步驟b)和步驟c)之後獲得的微生物細胞勻漿移除不溶性組分，以獲得包含重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶的溶液；以及e)通過過濾、蒸發或蛋白質沉澱和再溶解的組合，濃縮步驟d)的包含嗜熱酶的溶液，從而獲得包含具有過水解活性的重組嗜熱酶的濃縮物。在另一個實施方案中，步驟a)的微生物細胞勻眾是大腸桿菌(Escherichiacoli)細胞勻漿。在另一個實施方案中，外源的核酸酶不存在於步驟a)至d)中。在另一個實施方案中，固體組分從進行步驟b)和步驟c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟d)中使用過濾進行。在另一個實施方案中，固體組分從進行步驟b)和步驟c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟d)中使用具有O. 45微米至O. 20微米範圍尺寸排阻限的膜進行。在另一個實施方案中，步驟d)中使用的膜保留具有大於O. 2微米的平均直徑的不溶性微粒。在另一個實施方案中，不溶性組分從進行步驟b)和步驟c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟d)中使用離心進行。在另一個實施方案中，步驟d)中產生的溶液的濃縮在步驟e)中使用過濾進行。在另一個實施方案中，步驟d)中產生的溶液的濃縮在步驟e)中使用具有IOOkDa至30kDa範圍的尺寸排阻限的膜進行。在另一個實施方案中，步驟d)中產生的溶液的濃縮在步驟e)中使用蒸發進行。在另一個實施方案中，步驟d)中產生的溶液的濃縮在步驟e)中使用蛋白質的沉澱和再溶解的組合進行。在另一個實施方案中，所述重組生產的嗜熱酶包括CE-7特徵基序，所述基序包括對應於SEQ ID NO 8的胺基酸位置118-120的RGQ基序；
對應於SEQ ID NO 8的胺基酸位置186-190的GXSQG基序；和對應於SEQ ID NO 8的胺基酸位置303-304的HE基序。在另一個實施方案中，所述具有過水解活性的嗜熱酶是來源於棲熱袍菌屬的乙醯木聚糖酯酶。在另一個實施方案中，所述嗜熱酶包含選自SEQ ID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的胺基酸序列。附圖概沭圖IA至1D。不同處理步驟之後的細胞裂解物上層清液的層析譜(

圖1A)粗製細胞裂解物，(圖1B)在50°C孵育後的細胞裂解物，(圖1C)在50°C孵育和在75°C熱處理後的細胞裂解物，和(圖1D)在75°C熱處理後的細胞裂解物(沒有50°C的孵育)。所有的層析譜具有相同的垂直標度，從-100至+4500mAU。圖2A至2C。不同處理步驟之後的細胞裂解物上層清液的層析譜(圖2A)均質化和在50°C孵育，(圖2B)在50°C孵育和均質化，和(圖2C)在50°C孵育然後均質化，隨後在75°C熱處理。所有的層析譜均具有相同的垂直標度，從-100至+4500mAU。圖3第I階段溫度45°C，進行8h ;第2階段處理75°C，進行2h。圖4第I階段溫度50°C，進行8h ;第2階段處理75°C，進行2h。圖5第I階段溫度55°C，進行8h ;第2階段處理75°C，進行2h。圖6沒有對細胞勻漿的熱處理。圖7至21。針對用於表5中所列熱處理的其餘條件的SEC層析譜，全部展示了在級分42-mL至46-mL的DNA的減少，和在級分82_mL至86_mL的過水解酶的保留。圖22SEC層析譜(對照)顯示了單一階段熱處理(75°C )的效應。圖23SEC層析譜(對照)顯示了單一階段熱處理(85°C )的效應。牛物序列簡述下面的序列遵循37C. F.R. § § I. 821-1. 825 ( 「對包含核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求-序列規則」)，並且符合世界智慧財產權組織(WIPO)ST. 25標準(1998)以及歐洲專利公約(EPC)和專利合作條約(PCT)的序列表要求(規則5. 2和49.5(a-bis)以及行政規程的208節和附錄C)。用於核苷酸和胺基酸序列數據的符號和格式遵循在37C. F. R. § I. 822中所列出的規定。表I.具有過水解活性的CE-7糖酯酶和它們相關的序列鑑定號的不完全列表。列表中的成員來源於嗜熱微生物(例如棲熱袍菌)。I核酸1序列胺基酸序列 酶！D(SEQ ID (SEQID參考文獻
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海柄熱袍_――18養同未決的美國條
L8R/L125Q/Q176L/V183 D/F247時代理人檔案號
_1/C277S/P292L____CL503S
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K77E/A266EC277S/時代理人檔案號
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F27Y/I i49V/A266V/C2 7S/I295時代理人檔案號
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L195Q/C277S時代理人.擋案號
___CL5035
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YI丨0F/C277S時代理人檔案號
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萊廷格熱袍菌(K Ieliingae )—25 US 2010-0087529
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萊廷格熱袍菌C277V——26 US 2010-0087529
表廷格熱抱菌 C277S——27 LJS 2010-0087529
萊廷格熱袍菌 C2T7T-----28 US 2010-0087529
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棲熱袍菌屬 RQ2(a)WT .35— 36 US 2009-0005590
柄熱袍菌屬 RQ2(a) C277A____37__US 2010-0087529
棲熱袍菌屬 RQ2(a)C:277V-----38 HS 2010-0087529
"^棲熱袍菌屬 RQ2(a)C277S ...........................................—-.......................................................... 39US 2010-0087529
^柄熱爽L菌屬 RQ2(a)C277T^二40 US 2010-0087529
柄熱袍菌屬 RQ2 WT I S I 42 I US 2009-0005590 棲熱袍菌屬 RQ2 (b) C278A-----43US 2010-0087529
:柄熱抱_ 屬 RQ2 (b) C278V—44US 2010-00875291 =針對在大腸桿菌中的重組表達最優化的密碼子。提供了編碼野生型多肽序列的多核苷酸序列。WT =野生型CE-7糖酯酶。SEQ ID NO :47、48、50、和51是實施例I中使用的引物核酸序列。SEQ ID NO 49是使用PCR引物SEQ ID NO -Al和SEQ ID NO 48製備的多核苷酸的核酸序列。SEQ ID NO 52是使用PCR引物SEQ ID NO 50和SEQ ID NO 51製備的多核苷酸的核酸序列。·
SEQ ID NO :53_60是用於製備海棲熱袍菌變體C277V、C277A、C277S、和C277T的寡核苷酸的序列。發明詳沭包括兩個熱處理步驟的本發明的方法被用於幫助純化和/或濃縮具有過水解活性的嗜熱酶，使得所述酶通過膜的濾過性能夠容易地或更加容易地實現。在本公開中，使用了大量的術語和縮寫。除非另外特別說明，下述定義適用。如本文所用，在本發明的元件或組分之前的詞語「一個」、「一種」和「這個」旨在表明元件或組分的實例(即出現的事物)數量為非限制性的。因此，應將「一個」、「一種」和「這個」理解為包括一個(種)或至少一個(種)，並且元件或組分的詞語單數形式也包括複數指代，除非有數字明顯表示其為單數。術語「包含」是指如權利要求中提及的所述特徵、整數、步驟或組分的存在，但它不預先排除一種或多種其他特徵、整數、步驟、組分或其組的存在或添加。術語「包含」旨在包
括由術語「基本上由......組成」和「由......組成」涵蓋的實施方案。類似地，術語「基
本上由......組成」旨在包括由術語「由......組成」涵蓋的實施方案。如本文所用，修飾成分或反應物的量使用的術語「約」是指可以通過例如以下方式而發生的用數字表示的量的變化在真實世界中用於製備濃縮物或使用溶液的一般測量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；通過用於製備組合物或執行方法的成分的製造、來源或純度中的差異；等。術語「約」還包括由於相對於由特定起始混合物所得組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語「約」來修飾，權利要求包括量的等同量。當存在時，所有範圍是包括端值在內的和可以組合的。例如，當列出範圍「I至5」時，所列範圍應被視為包括範圍「 I至4」、「 I至3」、「 1-2」、「 1-2&4-5」、「 1-3&5」等等。如本文所用，術語「過氧羧酸」與過酸、過氧酸、過羧酸和過氧性酸同義。如本文所用，術語「過乙酸」縮寫為「PAA」，並與過氧乙酸、乙過氧酸以及CAS登記號79-21-0的所有其他同義詞同義。如本文所用，術語「酶催化劑」和「過水解酶催化劑」是指包含具有過水解活性的酶(即，多肽)的催化劑。如本文所用，將術語「過水解」或「過水解反應」被定義為所選的底物與過氧化氫的源反應形成過氧羧酸。通常，無機過氧化物與所選底物在具有過水解活性的催化劑存在下反應以產生過氧羧酸。如本文所用，術語「化學過水解」包括其中將底物(例如過氧羧酸的前體)與過氧化氫源組合的過水解反應，其中在不存在酶催化劑的情況下形成過氧羧酸。如本文所用，術語「酶促過水解」指選擇底物與過氧化氫源反應以形成過氧羧酸，其中所述反應由具有過水解活性的酶催化劑催化。如本文所用，術語「過氧化水解酶活性」是指每單位質量(例如毫克)蛋白、幹細胞重量或固定的催化劑重量的酶催化劑活性。如本文所用，「一個酶活性單位」或「一個活性單位」或「U」被定義為，在指定溫度每分鐘產生I μ mo I過氧羧酸產物(例如過乙酸)所需的過水解活性的量。「一個酶活性單位」在本文中也被用於指在指定溫度每分鐘水解I μ mo I過氧羧酸產物(例如過乙酸)所需的過氧羧酸水解活性的量。如本文所用，屬於「外源的核酸酶」是指催化DNA主鏈中磷酸二酯鍵的水解裂解的 非內源的酶的添加和/或存在。發酵生物質的處理經常包括可商購獲得的脫氧核糖核酸酶，例如來自牛胰腺的脫氧核糖核酸酶I (DN25 ；Sigma Aldrich, St. Louis,MO)，向所屬生物質的外源性添加，以幫助DNA的降解。然而，外源的核酸酶的添加可以增加生物質處理的成本，並且哺乳動物來源的DNAse的使用在代加工發酵中可能是不可取的。在一個實施方案中，外源性的脫氧核糖核酸酶在本發明的方法中沒有被使用。微生物細胞勻漿的製備本發明的方法包括使微生物細胞勻漿(包含重組生產的過水解酶)經受兩個不同的熱處理步驟。如本文所用，術語「微生物細胞勻漿」包含在裂解宿主細胞後獲得的可溶的和不溶性的組分，所述宿主細胞被用於重組生產具有過水解活性的酶。勻漿通常包含充分含水的基質，而勻漿的相對濃度可以在開始第一熱處理步驟之前被調節至所期望的濃度。微生物宿主細胞可以使用任何數量的本領域已知的方法裂解，例如化學的、酶學的、機械裂解(例如，弗氏壓碎器或乳品勻化器)或它們的任何組合。在第一熱處理步驟之前，微生物細胞和/或微生物細胞勻漿可以被調節PH和/或可以包括緩衝液的添加。在優選的方面，所述微生物細胞勻漿的PH可以在第一熱處理之前被調節至約6. 5至約7. 5的pH。在另一方面，可以包括磷酸鹽或碳酸氫鹽緩衝液。在另一個實施方案中，硫酸鎂也可以存在於所述微生物細胞勻漿中，優選以O. I至IOmM範圍的濃度，更優選為2mM。兩階段熱處理 本發明的方法包括兩個不同的熱處理步驟。如本文所用，術語「熱處理」、「熱處理期」、「經熱處理的」、和「加熱」被用於描述使
微生物細胞勻漿經受指定的溫度或溫度範圍一段指定的時間的處理步驟。本發明的方法包括第一熱處理和第二熱處理。如本文所用，術語「第一熱處理」、「第一熱處理期」或「孵育步驟」是指包含重組生產的嗜熱酶的微生物細胞勻漿在其中經受約40°C至約65°C的溫度範圍內一段約4小時至24小時範圍的時間的處理步驟，優選採用約45°C至約55°C的溫度範圍進行約4小時至約16小時。儘管不受理論的約束，所述第一熱處理步驟的條件是經過選擇的，使得存在於勻漿中的內源的核酸酶在所述第一熱處理期的至少一部分或全部是活性的。在一個實施方案中，外源的脫氧核糖核酸酶(DNAse)不存在於所述第一和/或第二熱處理步驟中。
如本文所用，術語「第二熱處理」或「第二熱處理期」是指從所述第一熱處理得到的「經熱處理的」微生物細胞勻漿在其中隨後經受包括約75°C至約85°C的溫度範圍內一段約5分鐘至約24小時的時間的第二熱處理的處理步驟，優選採用約75°C至約85°C的溫度範圍進行約30分鐘至約4小時。不溶性組分在第二熱處理之後的移除經熱處理的微生物細胞勻漿中的不溶性組分可以使用離心或過濾與可溶性組分分離。所得到的溶液包含重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶。在一個實施方案中，所述不溶性(固體)組分從所述第二熱處理之後獲得的微生物細胞生物質的移除，包括使用具有O. 45微米至O. 20微米範圍的尺寸排阻限的膜過濾。在 優選的方面，所述膜保留了平均直徑大於O. 2微米的微粒。然後通過過濾、蒸發或蛋白質沉澱和再溶解的組合，濃縮所得到的溶液中的嗜熱酶，從而獲得包含具有過水解活性的重組嗜熱酶的濃縮物。在一個實施方案中，過濾被用於濃縮不溶性組分被移除之後的溶液。在另一個實施方案中，被用於濃縮所述溶液的過濾步驟使用具有IOOkDa至30kDa範圍的尺寸排阻限的膜。在另一個實施方案中，蒸發被用於濃縮不溶性組分在步驟(d)中被移除之後的溶液。在另一個實施方案中，蛋白質沉澱和再溶解的組合被用於從自步驟(d)獲得的溶液產生濃縮物。在一個實施方案中，具有過水解活性的重組嗜熱酶在所述濃縮物中的重量百分比(重量％)是至少2. 5重量％。在一個優選的實施方案中，具有過水解活性的重組嗜熱酶在所述濃縮物中的重量百分比(重量％)是至少5. O重量％。
_3] 具有過水解活性的糖酯酶(家族7)CE-7家族的成員包括先鋒黴素C脫乙醯酶(CAH，E. C. 3. I. I. 41)和乙醯木聚糖酯酶(AXE ；E. C. 3. I. I. 72)。CE-7酯酶家族的成員共享保守的特徵基序(Vincent等人，J. Mol.Biol. ,330 =593-606(2003)) ο如本文所用，術語「特徵基序」、「CE-7特徵基序」指具有過水解活性的酶家族中共享的保守結構。如本文所用，「結構上歸類為CE-7酶」、「結構上歸類為糖酯酶家族7酶」、「結構上歸類為CE-7碳水化合物酯酶」和「CE-7過水解酶」將用於指具有過水解活性的酶，該酶基於存在的CE-7特徵基序在結構上歸類為CE-7碳水化合物酯酶(Vincent等人，同上)。如本文定義，CE-7酯酶的「特徵基序」包含三個保守的基序(殘基位置相對於參考序列SEQ IDNO 2編號；野生型海棲熱袍菌乙醯木聚糖酯酶)a)Argll8-Glyll9-Glnl20 ；b)Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90 ;和c)His303_Glu304。在胺基酸殘基位置187的Xaa通常是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或蘇氨酸。屬於催化三聯體的三個胺基酸殘基中的其中兩個以粗體表不。在一個實施方案中，在胺基酸殘基位置187的Xaa選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和蘇氨酸。對CE-7糖酯酶家族中的保守基序的進一步分析指示存在附加的保守基序(在SEQID NO :2的胺基酸位置272-274的LXD)，其可用於進一步確定CE-7糖酯酶家族成員。在另一個實施方案中，上文定義的特徵基序包括第四保守基序，稱為Leu272-Xaa273_Asp274.在胺基酸殘基位置273的Xaa通常是異亮氨酸、纈氨酸、或甲硫氨酸。第四基序包括屬於催化三聯體(Serl88-Asp274-His303)的天冬氨酸殘基(粗體)。包含CE-7特徵基序和/或基本上相似結構的過水解酶適合用於本發明的方法中，只要所述酶不被本發明的方法的第二溫度處理條件永久地或充分地滅活(即，失去過水解活性)。用於鑑定基本上類似生物分子的方法是本領域眾所周知的(例如序列比對方案、核酸雜交、保守特徵基序的存在等)。在一個方面，所述酶催化劑可以包含與本文提供的序列具有至少40%、優選至少50%、更優選至少60%、甚至更優選至少70%、更加優選至少80%、更加優選至少90%同一性，並且最優選至少95%胺基酸同一性的基本上類似的酶。
如本文所用，術語「先鋒黴素C脫乙醯酶」和「先鋒黴素C乙醯水解酶」是指催化先鋒黴素如先鋒黴素C和7-氨基頭孢燒酸(Mitsushima, Kenji,等人，Appl. Environ.Microbiol. (1995)61(6) :2224-2229)的脫乙醯作用的酶(E. C. 3. I. I. 41)。如本文所述，提供了具有明顯的過水解活性的若干種先鋒黴素C脫乙醯酶。如本文所用，「乙醯木聚糖酯酶」是指催化乙醯化的木聚糖和其他乙醯化的糖類的脫乙醯作用的酶(E. C. 3. I. I. 72 ；AXE)。如本文所述，提供了具有顯著過氧化水解酶活性的歸類為乙醯木聚糖酯酶的幾種酶。包含CE-7特徵基序的CE-7糖酯酶家族的成員，具有針對從羧酸酯底物和過氧化物源如過氧化氫產生過氧羧酸的優異的過水解活性(公布於DiCosimo等人的美國專利申請公布2008-0176783中)。來源於從嗜熱微生物(例如棲熱袍菌屬的成員)獲得的天然存在的乙醯木聚糖酯酶的變體酶的宿主也已被生產。表I中提供了來源於棲熱袍菌屬乙醯木聚糖酯酶的過水解酶的非限制性列表。具有過水解活性的嗜熱酶如本文所用，術語「具有過水解活性的嗜熱酶」或「嗜熱過水解酶」將指具有過水解活性的糖酯酶家族7酶(先鋒黴素脫乙醯酶和乙醯木聚糖酯酶)，其中本發明的熱處理方法不會顯著地影響所述酶的過水解活性。在一個實施方案中，如果使酶經受所述第二熱處理步驟(即，暴露於升高的溫度中一段指定的時間)沒有不利地影響所述酶的過水解活性，則該酶催化劑將被認為是溫度穩定的(即，「嗜熱酶」)。在另一個實施方案中，如果將酶在75°C至85°C的溫度範圍內暴露一段5分鐘至4小時的熱處理期沒有顯著地降低所述酶的過水解活性，則該酶催化劑可以被認為是「溫度穩定的」(即，嗜熱的)。在一個實施方案中，具有過水解活性的嗜熱酶是來源於嗜熱微生物如棲熱袍菌細菌屬中的物種的乙醯木聚糖酯酶。在另一個優選的實施方案中，所述嗜熱酶可以是來自嗜熱微生物的乙醯木聚糖酯酶的變體，只要該變體在暴露於所述第二熱處理中使用的條件之後保持了過水解活性。在另一個優選的方面，具有過水解活性的嗜熱酶是來自海棲熱袍菌、那不勒斯棲熱袍菌、萊廷格熱袍菌、Thermotoga petrophila、和棲熱袍菌屬RQ2的乙醯木聚糖酯酶或它們的變體。酶的非限制性列表提供於表I中。在另一個實施方案中，具有過水解活性的嗜熱酶包含選自SEQ ID NO :2、3、4、5、6、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和 46 的胺基酸序列。在一個優選的實施方案中，所述嗜熱酶在微生物宿主細胞中被重組表達。宿主菌株的實例包括但不限於細菌、真菌或酵母物種例如麴黴屬(AspergiIIus)、木黴屬(Trichoderma)、糖酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅髮夫酵母屬(Phaffia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、農桿菌屬(Agrobacterium)、赤細菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、著色菌屬(Chromatium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、卩遼纖維菌屬(Cytophaga)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基單胞菌屬·(Methylomonas)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基抱囊菌屬(Methylocystis)、產鹼菌屬(Alcaligenes)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、聚球藍細菌屬(Synechococcus)、魚渥藍細菌屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲燒桿菌屬(Methanobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和粘球菌屬(Myxococcus)。在一個優選的實施方案中，細菌宿主菌株包括埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、和假單胞菌屬(Pseudomonas)。在另一個優選的方面,所述細菌宿主細胞是大腸桿菌。羧酸酯底物具有過水解活性的CE-7酶能夠使用多種羧酸酯底物(在適當的過氧化物源的存在下)來生產一種或多種過酸，如過乙酸。羧酸酯底物的實例可包括但不限於一種或多種具有下列分子式的酯[XJmR5其中X =式R6C(O)O的酯基R6 = Cl至C7的直鏈的、支鏈的或環狀的烴基部分，其任選地用羥基或Cl至C4烷氧基取代，其中當R6 = C2至C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵；R5 = Cl至C6的直鏈的、支鏈的或環狀的烴基部分，其任選地用羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵；m是從I至R5中碳原子數量範圍的整數；並且其中所述酯具有在25°C至少5ppm的水中溶解度。在另一個實施方案中，R6為任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代的C1-C7支鏈的烴基部分，任選地包含一個或多個醚鍵。在另一個優選的實施方案中，R6為任選地被輕基取代的C2-C7直鏈的烴基部分和/或任選地包含一個或多個醚鍵。如本文所用，術語「烴基」和「烴基部分」指直鏈、支鏈或環狀排列的碳原子，碳原子通過碳-碳單鍵、雙鍵或三鍵和/或醚鍵連接且相應地被氫原子取代。此類烴基可以是脂族的和/或芳族的。經基基團的實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、環丙基、環丁基、戊基、環戊基、甲基環戊基、己基、環己基、苄基和苯基。在一個實施方案中，烴基部分是直鏈的、支鏈的或環狀的碳原子排列，碳原子通過碳-碳單鍵和/或醚鍵連接，並且相應地被氫原子取代。在另一個實施方案中，適合的底物還包括符合下列分子式的一種或多種甘油酯
權利要求
1.方法，其包括 (a)提供包含可溶性和不溶性組分的微生物細胞勻漿，其中所述微生物細胞勻漿包含重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶； (b)使所述微生物細胞勻漿在40°C至65°C的溫度範圍內經歷至少4小時但不超過24小時範圍的第一熱處理期； (c)使來自步驟(b)的經熱處理的微生物細胞勻漿在75°C至85°C的溫度範圍內經歷5分鐘至4小時範圍的第二熱處理期； (d)通過離心或過濾從進行步驟(b)和步驟(C)之後獲得的微生物細胞勻漿移除所述不溶性組分，以獲得包含重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶的溶液；以及 (e)通過過濾、蒸發或蛋白質沉澱和再溶解的組合，濃縮步驟(d)的包含嗜熱酶的溶液，從而獲得包含具有過水解活性的重組嗜熱酶的濃縮物。
2.權利要求I的方法，其中所述重組生產的具有過水解活性的嗜熱酶包含糖酯酶家族7 (CE-7)特徵基序，所述CE-7特徵基序包括 (a)對應於SEQID NO 8的胺基酸位置118-120的RGQ基序； (b)對應於SEQID NO 8的胺基酸位置186-190的GXSQG基序；和 (c)對應於SEQID NO :8的胺基酸位置303-304的HE基序。
3.權利要求2的方法，其中所述具有過水解活性的嗜熱酶是來源於棲熱袍菌屬的乙醯木聚糖酯酶。
4.權利要求3的方法，其中所述嗜熱酶包含選自SEQID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的胺基酸序列。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中步驟(a)的微生物細胞勻漿是大腸桿菌細胞勻漿。
6.權利要求1-4中任一項的方法，其中在步驟(a)至(d)中不存在外源的核酸酶。
7.權利要求I的方法，其中所述第一熱處理期為4小時至不超過16小時的範圍，溫度範圍為45°C至55°C。
8.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中所述第二熱處理期為30分鐘至4小時的範圍，溫度範圍為75°C至85°C。
9.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中在所述微生物細胞勻漿中存在硫酸鎂。
10.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中具有過水解活性的重組嗜熱酶在所述濃縮物中的重量百分比(重量％)為至少2. 5重量％。
11.權利要求10的方法，其中具有過水解活性的重組嗜熱酶在所述濃縮物中的重量百分比(重量％ )為至少5. O重量％。
12.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中固體組分從進行步驟(b)和步驟(c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟(d)中使用過濾進行。
13.權利要求12的方法，其中固體組分從進行步驟(b)和步驟(c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟(d)中使用具有O. 45微米至O. 20微米範圍的尺寸排阻限的膜進行。
14.權利要求13的方法，其中所述膜保留平均直徑大於O.2微米的微粒。
15.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中固體組分從進行步驟(b)和步驟(c)之後獲得的微生物細胞勻漿的移除在步驟(d)中使用離心進行。
16.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中在步驟(d)中產生的溶液的濃縮在步驟(e)中使用過濾進行。
17.權利要求16的方法，其中在步驟(d)中產生的溶液的濃縮在步驟(e)中使用具有IOOkDa至30kDa範圍的尺寸排阻限的膜進行。
18.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中在步驟(d)中產生的溶液的濃縮在步驟(e)中使用蒸發進行。
19.權利要求1-4或7中任一項的方法，其中在步驟(d)中產生的溶液的濃縮在步驟(e)中使用蛋白質的沉澱和再溶解的組合進行。
全文摘要
提供了兩階段的熱處理方法，以改進包含具有過水解活性的酶的重組微生物生物質的可加工性。更具體地，提供了處理包含具有過水解活性的棲熱袍菌屬乙醯木聚糖酯酶的重組微生物生物質的方法，使得微量過濾可以被用於部分純化和/或濃縮蛋白質製備物。所述乙醯木聚糖酯酶可以被用於生產適用於多種應用如清潔、殺菌、消毒、漂白、木漿處理、和紙漿處理應用中的過氧羧酸。
文檔編號C12N9/18GK102906256SQ201180025443
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月23日 優先權日2010年3月26日
發明者R.迪科西莫, A.本-巴薩, R.R.佐蘭茲 申請人:納幕爾杜邦公司