一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備方法

2023-06-02 12:59:41 1

一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種白禿馬勃菌絲體中水溶性多糖的製備方法，其步驟為：將白禿馬勃菌接種於固體斜面培養基，恆溫培養，得斜面種子；取培養後的斜面接種到一級液體種子培養基中培養；將培養後的一級液體種子接種到二級液體種子中培養；將培養後的二級液體種子接種發酵；將菌絲體與發酵液分離，清水衝淨，烘乾後研磨得到菌絲體乾粉；將菌絲體乾粉進行浸提或超聲浸提，濃縮液體，加入乙醇沉澱收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉澱物，將多糖粗沉澱物用熱水溶解，除去游離蛋白質以及小分子雜質，濃縮，加入乙醇沉澱，經乾燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精製提取物。本發明方法易行，製備操作簡便，低溫、短時、高效。
【專利說明】一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於生物工程與【技術領域】，更具體涉及一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備方法。
【背景技術】
[0003]白禿馬勃中文別名白馬勃，是擔子菌綱、灰包目、灰包科、馬勃屬的藥用真菌，是我國著名的藥用真菌之一，主要分布於我國河北、山西、遼寧、黑龍江、陝西、甘肅、新疆等地區。子實體小，扁球形，近球形，梨形，淺棕灰色，並有發達的根狀的菌絲索。外包被薄，粉狀，有斑紋，內包被堅實而脆。孢子體蜜黃色到淺茶色，孢子球形，淺青黃色，直徑4~5μπι。光滑或有極細的小疣，常殘留有小柄。孢絲同色，稀有的橫隔，粗細均勻，4.5~6μπι。幼時可食用，老後藥用。白馬勃含有賴氨酸、蛋氨酸等人體必需的八種胺基酸以及馬勃素、麥角甾醇、類脂、抗敗血酸、脫氫抗敗血酸和白馬勃多糖等，其活性成分具收斂性消炎止血，散熱解毒利咽喉，抗腫瘤，提高人體免疫力等功效。由於其優良的食療保健作用，國際市場對該菌的需求不斷增加。馬勃多糖主要通過大禿馬勃、黃硬皮馬勃、褐皮馬勃、黃硬皮馬勃、梨形馬勃等子實體中提取或通過液體深層發酵培養製備胞外多糖。但白馬勃的傳統生產方法是固體栽培，這種方法周期長、佔地面積大，又受季節和原料的限制，使得其子實體活性多糖物質產量低，難以推廣，從而使其不能得到充分的利用。從白禿馬勃菌絲體中提取水溶性活性多糖目前仍不見文獻報導，其它馬勃多糖提取則以子實體為材料，經熱水浸提，用Sevag法脫蛋白，乙醇沉澱製備多糖，這些方法存在著提取效率低、用時長等問題。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種白禿馬勃菌絲體的培養方法。本發明的目的還在於提供一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法。
[0005]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種白禿馬勃菌絲體的培養方法，包括如下步驟:
(O將白禿馬勃菌接種於PDA固體斜面培養基，於26°C恆溫培養5~7天，得到斜面種子。所述的PDA固體斜面培養基包含如下質量百分含量組分:馬鈴薯18~22%，葡萄糖
1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白腖0.5~0.7%，七水硫酸鋅0.01~0.03%,七水硫酸鎂0.04~0.07%,磷酸二氫鉀0.05~0.15%，瓊脂粉1.0~2.0%，餘量為水。
[0006](2)取上述斜面種子接種到裝有一級液體種子培養基的三角瓶中，加入玻璃珠，於26°C、13 0r/min培養72~96小時。所述的一級液體種子培養基包含如下質量百分含量組分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黃豆粉1.0~2.5%，蛋白腖1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸鎂1.0~2.5%，七水硫酸鋅0.1~0.3%，磷酸二氫鉀1.5~2.5%，餘量為水。[0007](3)將培養72~96小時後的一級液體種子接種到裝有二級液體種子培養基的三角瓶中，加入玻璃珠，於26°C、150r/min培養60~72小時。所述的二級液體種子培養基與一級液體種子培養基相同。
[0008](4)將培養60~72小時後的二級液體種子接種到裝有發酵培養基A的三角瓶中，於28°C、180r/min培養96小時。所述的發酵培養基A包含如下質量百分含量組分:馬鈴薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白腖0.6~1.2%，七水硫酸鎂0.2~0.6%，磷酸二氫鉀0.3~
0.6%，碳酸鈣0.2~0.6%，餘量為水。
[0009](5)將菌絲體與發酵液分離，用水衝洗乾淨，烘乾後得到白禿馬勃菌絲體。
[0010]步驟(2)優選為取斜面種子3~5環接種到裝有IOOmL —級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，於26°C、130r/min培養72~96小時。
[0011]步驟(3)優選為將一級液體種子按10% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL 二級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，於26°C、150r/min培養60~72小時。
[0012]步驟(4)優選為將二級液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL發酵培養基A的250mL三角瓶中，於28°C、180r/min培養96小時。
[0013]步驟(4)還可以為:將培養60~72小時後的二級液體種子接種到裝有發酵培養基B的IOL發酵罐中，發酵罐裝料係數為0.7，罐壓為0.04~0.07MPa，於28°C、220r/min培養72小時後放罐。所述的發酵培養基B包含如下質量百分含量組分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黃豆 粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸鋅
1.0~2.0%，七水硫酸鎂1.5~3.0%，磷酸二氫鉀2.0~3.0%，餘量為水。
[0014]步驟(5)中所述的烘乾優選為50°C烘乾。
[0015]上述培養基的pH均優選為自然pH。
[0016]一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，包括如下步驟:
(I)將通過上述方法得到的白禿馬勃菌絲體研磨粉碎，加入去離子水進行浸提或超聲，濃縮液體，加入乙醇沉澱收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉澱物。
[0017](2)將白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉澱物用熱水溶解，再用Sevag法反覆除去游離蛋白質，直至檢測不到蛋白質，濃縮，再用乙醇沉澱，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉澱物。
[0018](3)將去蛋白質後的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉澱物經透析方法分離，除去小分子雜質，得到多糖分子量在3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃菌水溶性活性多糖精製提取液，加入乙醇沉澱，得到精製沉澱物。
[0019](4)將精製沉澱物乾燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精製提取物。
[0020]步驟(2)中所述的Sevag法具體為=Sevag溶液為三氯乙酸和正丁醇按體積比5:1混合，Sevag溶液和粗多糖溶液按體積比1:2混合，振蕩25分鐘，靜置60分鐘，去除蛋白沉澱，反覆進行4~6次。
[0021]步驟(2)中所述的乾燥優選為加熱恆溫乾燥。
[0022]上述方法中濃縮優選為將提取液濃縮至原體積的1/2~1/4，濃縮採用在50~55 0C > 0.08~0.09MPa下的減壓濃縮。
[0023]上述方法中醇析沉澱所用的乙醇優選為體積分數為75%~95%乙醇，用量為濃縮液的2~4倍體積量。
[0024]本發明方法得到的白禿馬勃水溶性活性多糖呈白色，易溶於熱水，不易溶於正丁醇、丙酮等有機溶劑。
[0025]本發明相對於現有技術具有如下優點和效果:本發明所使用的培養基及發酵工藝是 申請人:經過無數次的試驗得出的最佳條件，通過本發明方法培養白禿馬勃菌絲，其產量高達11.7g/L，提取得到的白禿馬勃水溶性多糖的產量高達153.57mg/L，純度高達99.86%。
【具體實施方式】
[0026]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0027]下述實施例中培養基的pH均為自然pH (5~6)。
[0028]實施例1
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備，其步驟是:
(I)將白禿馬勃菌接種於PDA固體斜面培養基，於26°C恆溫培養6天，得到斜面種子。所述PDA固體斜面培養基中各組分及含量分別為(％):馬鈴薯20，葡萄糖2.0,酵母粉1.4，蛋白腖0.6，七水硫酸鋅0.02，七水硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.10，瓊脂粉1.0，餘量為水。
[0029](2)取上述斜面種子3~5環，接種到裝有IOOmL —級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加12顆玻璃珠，於26°C、130r/min培養96小時。所述的一級液體種子培養基中各組分及其含量分別為(％):玉米粉4.0,葡萄糖2.0，黃豆粉1.0，蛋白腖2.0，酵母粉2.0，七水硫酸鎂1.5，七水硫酸鋅0.1，磷酸二氫鉀2.0，餘量為水。
[0030](3)將培養96小時後的一級液體種子按10% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL 二級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加12顆玻璃珠，於26°C、150r/min培養60小時。所述的二級液體種子培養基與一級液體種子培養基相同。
[0031](4)將培養60小時後的二級液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL發酵培養基A的250mL三角瓶中發酵，於28°C、180r/min培養96小時。所述的發酵培養基A各組分及含量分別為(％):馬鈴薯20，蔗糖2.0，蛋白腖0.6，七水硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀
0.3，碳酸鈣0.2，餘量為水。
[0032](5)將菌絲體與發酵液分離，用純淨水衝洗乾淨，於50°C烘乾後研磨得到1.166g菌絲體乾粉。
[0033](6)將上述白禿馬勃菌絲體乾粉加入到其40倍質量的去離子水中，在50或51或52或53°C浸提3小時，重複3次，合併3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉澱析出，收集得11.43mg白禿馬勃菌絲體多糖粗沉澱物。
[0034](7)向多糖粗沉澱物中加入熱去離子水溶解，使之充分復溶，用Sevag法去除蛋白，重複進行，直到檢測不出蛋白質；減壓濃縮(條件同(6))後，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，沉澱接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌絲體多糖沉澱物10.74mg。
[0035](8)將去蛋白質後的多糖沉澱溶於熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精製液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，靜置析出精製沉澱物10.2Img0[0036](9)將精製沉澱物50°C恆溫乾燥得到白禿馬勃精製多糖固體10.12mg，該多糖顏色為白色，純度為99.54%ο
[0037](10)本發明白禿馬勃多糖測定採用苯酚-硫酸法，測定方法如下:
精確稱葡萄糖0.1Og (預先在105°C烘乾至恆重)於小燒杯中，用少量去離子水溶解後定量轉移到100mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度線，搖勻，其濃度為1.0mg/mL，分吸取OmL、0.02mL,0.04mL、0.06mL,0.08mL,0.lOmL.0.12 mL 於比色管中，補加蒸餾水至 2.0mL，接著加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻後立即滴加5.0mL濃硫酸(物質的量濃度為18.4mol ,L-1),混合均勻後25°C保溫20min，測定各溶液在490nm處的吸光度值，繪製標準曲線。取白禿馬勃多糖樣品，按照標準液配製的方法配製樣品液，測定吸光度，從標準曲線計算多糖含量。
[0038]實施例2
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備，其步驟是:
(O白禿馬勃菌絲體乾粉的製備同實施例1步驟(1)~(5)。
[0039](2)將上述白禿馬勃菌絲體乾粉加入到其40倍質量的去離子水中，在50或51或52或53°C超聲6min，重複3次，合併3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉澱析出，收集得13.99mg白禿馬勃菌絲體多糖粗沉澱物。
[0040](3)向多糖粗沉澱物中加入熱去離子水溶解，使之充分復溶，用Sevag法去除蛋白，重複進行，直到檢測不出蛋白質。減壓濃縮(條件同(2))後，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，沉澱接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌絲體多糖沉澱物13.57mg。
[0041](4)將去蛋白質後的多糖沉澱溶於熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精製液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，靜置析出精製沉澱物13.43mg。
[0042](5)將精製沉澱物50°C恆溫乾燥得到白禿馬勃精製多糖固體13.36mg,該多糖顏色為白色，純度為99.81%。
[0043]實施例3
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備，其步驟是:
(I) 二級液體種子的製備同實施例1步驟(1)~(3)，不同的是(3)中一級液體種子接種後培養的時間是72小時。
[0044](2)將培養72小時後的二級液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有發酵培養基B的IOL發酵罐中，發酵罐裝料係數為0.7，罐壓為0.04或0.05或0.06或0.07MPa,於28°C、220r/min培養72小時後放罐。所述的發酵培養基B各組分及含量分別為(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黃豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸鋅1.0，七水硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀2.0,餘量為水。
[0045](3)將菌絲體與發酵液分離，清水衝淨，於50°C烘乾後研磨得到80.64g菌絲體乾粉。
[0046](4)將上述白禿馬勃菌絲體乾粉加入40倍質量的去離子水，在50或51或52或53°C浸提 3小時，重複3次，合併3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95%(V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉澱析出，收集得0.887g白禿馬勃菌絲體多糖粗沉澱物。
[0047](5)向多糖粗沉澱物中加入熱去離子水溶解,使之充分復溶,用Sevag法去除蛋白，重複進行，直到檢測不出蛋白質。減壓濃縮(條件同(4))後，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，沉澱接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌絲體多糖沉澱物0.834g。
[0048](6)將去蛋白質後的多糖沉澱溶於熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精製液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，靜置析出精製沉澱物0.809g。
[0049](7)將精製沉澱物50°C恆溫乾燥得到白禿馬勃精製多糖固體0.802g,該多糖顏色為白色，純度為99.62%。
[0050]實施例4
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的製備，其步驟是:
(I)二級液體種子的製備同實施例1步驟(1)~(3)，不同的是(3)中一級液體種子接種後培養的時間是72小時。
[0051](2)將培養72小時後的二級液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有發酵培養基B的IOL發酵罐中，發酵罐裝料係數為0.7，罐壓為0.04或0.05或0.06或0.07MPa,於28°C、220r/min培養72小時後放罐。所述的發酵培養基B各組分及含量分別為(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黃豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸鋅1.0，七水硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀2.0,餘量為水 。
[0052](3)將菌絲體與發酵液分離，清水衝淨，於50°C烘乾後研磨得到80.36g菌絲體乾粉。
[0053](4)將上述白禿馬勃菌絲體乾粉加入到其40倍質量的去離子水中，在50或51或52或53°C超聲6min，重複3次，合併3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉澱析出，收集得1.125g白禿馬勃菌絲體多糖粗沉澱物。
[0054](5)向多糖粗沉澱物中加入熱去離子水溶解，使之充分復溶，用Sevag法去除蛋白，重複進行，直到檢測不出蛋白質。減壓濃縮(條件同(4))後，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，沉澱接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌絲體多糖沉澱物1.091g。
[0055](6)將去蛋白質後的多糖沉澱溶於熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精製液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉澱，靜置析出精製沉澱物1.080g。
[0056](7)將精製沉澱物50°C恆溫乾燥得到白禿馬勃精製多糖固體1.075g,該多糖顏色為白色，純度為99.86%ο
[0057]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於包括如下步驟: (O將白禿馬勃菌接種於PDA固體斜面培養基，於26°C恆溫培養5~7天，得到斜面種子；所述的PDA固體斜面培養基包含如下質量百分含量組分:馬鈴薯18~22%，葡萄糖1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白腖0.5~0.7%，七水硫酸鋅0.01~0.03%,七水硫酸鎂0.04~0.07%,磷酸二氫鉀0.05~0.15%，瓊脂粉1.0~2.0%，餘量為水； (2)取上述斜面種子接種到裝有一級液體種子培養基的三角瓶中，加入玻璃珠，於26°C、130r/min培養72~96小時；所述的一級液體種子培養基包含如下質量百分含量組分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黃豆粉1.0~2.5%，蛋白腖1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸鎂1.0~2.5%，七水硫酸鋅0.1~0.3%，磷酸二氫鉀1.5~2.5%，餘量為水； (3)將培養72~96小時後的一級液體種子接種到裝有二級液體種子培養基的三角瓶中，加入玻璃珠，於26°C、150r/min培養60~72小時；所述的二級液體種子培養基與一級液體種子培養基相同； (4)將培養60~72小時後的二級液體種子接種到裝有發酵培養基A的三角瓶中，於28°C、180r/min培養96小時；所述的發酵培養基A包含如下質量百分含量組分:馬鈴薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白腖0.6~1.2%，七水硫酸鎂0.2~0.6%，磷酸二氫鉀0.3~0.6%，碳酸鈣0.2~0 .6%，餘量為水； (5)將菌絲體與發酵液分離，用水衝洗乾淨，烘乾後得到白禿馬勃菌絲體。
2.根據權利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於:步驟(2)為取斜面種子3~5環接種到裝有IOOmL —級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，於26°C、130r/min培養72~96小時。
3.根據權利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於:步驟(3)為將一級液體種子按10%的接種量接種到裝有IOOmL 二級液體種子培養基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，於26°C、150r/min培養60~72小時。
4.根據權利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於:步驟(4)為將二級液體種子按6%的接種量接種到裝有IOOmL發酵培養基A的250mL三角瓶中，於28°C、180r/min培養96小時。
5.根據權利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於:步驟(4)為將培養60~72小時後的二級液體種子接種到裝有發酵培養基B的IOL發酵罐中，發酵罐裝料係數為0.7，罐壓為0.04~0.07MPa,於28°C、220r/min培養72小時後放罐；所述的發酵培養基B包含如下質量百分含量組分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黃豆粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸鋅1.0~2.0%，七水硫酸鎂1.5~3.0%，磷酸二氫鉀2.0~3.0%,餘量為水。
6.根據權利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養方法，其特徵在於:步驟(5)中所述的烘乾為50°C烘乾。
7.一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特徵在於:包括如下步驟: (I)將通過權利要求1~6任一項所述的方法得到的白禿馬勃菌絲體研磨粉碎，加入去離子水進行浸提或超聲，濃縮液體，加入乙醇沉澱收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉澱物；(2)將白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉澱物用熱水溶解，再用Sevag法反覆除去游離蛋白質，直至檢測不到蛋白質，濃縮，再用乙醇沉澱，得到去蛋白質後的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉澱物； (3)將去蛋白質後的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉澱物經透析方法分離，除去小分子雜質，得到多糖分子量在3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃菌水溶性活性多糖精製提取液，加入乙醇沉澱，得到精製沉澱物； (4)將精製沉澱物乾燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精製提取物。
8.根據權利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的乾燥為加熱恆溫乾燥。
9.根據權利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特徵在於:所述的方法中濃縮為將提取液濃縮至原體積的1/2~1/4，濃縮採用在50~55°C、0.08~0.09MPa下的減壓濃縮。
10.根據權利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特徵在於: 所述的方法中醇析沉澱所用的乙醇為體積分數為75%~95%乙醇，用量為濃縮液的2~4倍體積量。
【文檔編號】C12P19/04GK103993051SQ201410241551
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月3日 優先權日:2014年6月3日
【發明者】張華山, 陽飛, 王偉平, 蘇正定 申請人:湖北工業大學