一種用液相色譜法分離測定恩替卡韋及其光學異構體的方法
2023-06-02 15:18:51
專利名稱：一種用液相色譜法分離測定恩替卡韋及其光學異構體的方法
技術領域：
本發明屬於分析化學領域，具體涉及用液相色譜法分離測定恩替卡韋及其光學異
構體的方法。
背景技術：
恩替卡韋是一種抗B肝病毒藥，主要用於抑制B肝病毒的複製，其分子式為 C12H15N503.，其結構式為: 恩替卡韋分子中含有3個手性碳原子，通過不對稱合成生成不同的手性異構體， 在藥物合成過程中需要對光學異構體進行質量控制。含多個手性碳原子的對映異構體的 分離已知是手性藥物合成和製劑過程中質量控制的難點，因此，實現恩替卡韋及其手性異 構體的分離在恩替卡韋的合成和製劑的研究、生產過程的質量控制方面具有重要的現實意 義。 2008年蔣銀妹"恩替卡韋分散片的處方工藝和質量標準研究"(瀋陽藥科大學學 位論文)，公開了以Daicel ChiralpakAD-H手性色譜柱為分離柱，以無水乙醇(含O. 1%三 氟乙酸)-正己烷(40 : 60)為流動相，柱溫3(TC時可將恩替卡韋對映異構體進行分離。經 驗證，該方法可以將恩替卡韋對映異構體分離，但是因為流動相中含有改性劑三氟乙酸，造 成基線漂移，無法準確測定成品中對映異構體的含量，不能有效控制恩替卡韋原料的質量； 同時由於手性色譜柱固定相對改性劑具有記憶效應，色譜柱使用說明書上明確表示為保證 色譜柱的性能良好，在每次使用完改性劑後需採用無水乙醇(色譜級)以0.5ml/min的流 速衝洗3小時之後再使用常規衝洗方法進行保存，這樣多次反覆會不但操作繁瑣而且損害 柱子的使用壽命。 經反覆試驗，本發明人發現，用直鏈澱粉-三(3，5-二甲基苯基-氨基甲酸酯)為 填料的手性色譜柱，以正己烷-低級醇溶液為流動相，無需加酸性改性劑即可將恩替卡韋 手性異構體進行有效分離，該方法下基線平穩，主峰峰形較好，有利於定量分析；由於此條 件較為溫和(不含改性劑)，色譜柱在使用完後直接採用採用常規的衝洗方法即可，節約時間成本，同時可以保證色譜柱具有相對較長的使用壽命。
發明內容
本發明的目的在於提供一種分離測定恩替卡韋及其手性異構體的高效液相色譜 方法，從而實現恩替卡韋手性異構體的分離與測定，有效地控制恩替卡韋的產品質量。
為實現本發明的目的，在一實施方案中，本發明所述的用液相色譜法分離測定恩 替卡韋及其光學異構體的方法，其特徵在於以三(3，5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直鏈澱 粉為填料的手性色譜柱，以正己烷-低級醇溶液為流動相。這裡所說的液相色譜方法包括 高效液相色譜法或高效液相色譜法_質譜法聯用。 上述所說的以三(3，5_ 二甲基苯基)_氨基甲酸酯直鏈澱粉為填料的手性色譜柱 選自牌號為Daicel CHIRALPAK AD、Daicel CHIRALPAK AD-H和Daicel CHIRALPAK IC的色譜柱。 上述所說的低級醇選自以下化合物甲醇、無水乙醇、丙醇、異丙醇，優選為無水乙
醇或異丙醇。 上述本發明的方法，其流動相正己烷-低級醇的體積比為25 : 75 75 : 25.，優 選體積比為60 : 40，更優選的是正己烷-無水乙醇或異丙醇的體積比為60 : 40。
上述本發明所述的用液相色譜法分離測定恩替卡韋及其光學異構體的方法，還進 一步包括以下步驟 (1)稱取恩替卡韋樣品適量，用無水乙醇溶解樣品，配製成每lml含恩替卡韋 0. lmg 5mg的樣品溶液； (2)設置流動相流速為0. 5 2. Oml/min，流動相的流速優選為1. 3ml/min ;檢測 波長為205nm 260nm，優選檢測波長為254nm，色譜柱的柱溫箱溫度為25°C 45。C，最佳 柱溫箱溫度為40°C ; (3)取(1)的樣品溶液2 50iU注入色譜儀，完成恩替卡韋與光學異構體的分離
其中 高效液相色譜儀的型號無特別要求，本發明採用的色譜儀為Agilent 1100型高 效液相色譜儀。色譜柱優選Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mmX4. 6mm)
柱溫優選40。C 流動相優選正己烷-無水乙醇(60 : 40)
進樣量10iU 在另一具體實施方案中，本發明的本發明所述的用液相色譜法分離測定恩替卡韋 及其光學異構體的方法，其特徵在於以三(3，5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直鏈澱粉為填 料的手性色譜柱，以正己烷-低級醇溶液為流動相，其體積比為25 : 75 75 : 25，其方法 包括以下步驟 (1)稱取恩替卡韋樣品適量，用低級醇(如無水乙醇)溶解樣品，配製成每lml含 恩替卡韋0. lmg 5mg的樣品溶液； (2)設置流動相流速為0. 5 2. Oml/ ，流動相的流速優選為1. 3ml/min ;檢測
4波長為205nm 260nm，優選檢測波長為254nm，色譜柱的柱溫箱溫度為25°C 45。C，最佳 柱溫箱溫度為40°C ; (3)取(1)的樣品溶液2 50iU，優選lOiU注入色譜儀，完成恩替卡韋與光學
異構體的分離測定。
其中 高效液相色譜儀的型號無特別要求，本發明採用的色譜儀為Agilent 1100型高 效液相色譜儀。 在上述的具體實施方案中，三(3，5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直鏈澱粉為填 料的手性色譜柱選自牌號為Daicel CHIRALPAK AD、 Daicel CHIRALPAK AD-H禾PDaicel CHIRALPAKIC的色譜柱，優選Daicel CHIRALPAKAD ;低級醇選自以下化合物甲醇、無水乙 醇、丙醇、異丙醇，優選為無水乙醇或異丙醇，更優選無水乙醇；其流動相正己烷-低級醇的 體積比為25 : 75 75 : 25.，優選體積比為60 : 40，更優選的是正己烷-無水乙醇或異 丙醇的體積比為60 : 40。 在上述的具體實施方案中，步驟(1)中的低級醇最好與流動相的低級醇相同，優 選無水乙醇。 本發明採用CHIRALPAK AD手性色譜柱，能夠有效分離測定恩替卡韋的光學異構 體；選用無水乙醇為溶劑溶解樣品，保證了溶液的穩定性；選擇進樣體積為10iU，柱溫為 4(TC，提高了色譜峰的對稱性。本發明解決了分離測定恩替卡韋的光學異構體的定量測定 問題，從而有效保證了恩替卡韋的質量可控。
圖1 :空白溶劑的高效液相色譜圖 圖2 :恩替卡韋原料和恩替卡韋對映異構混合液的高效液相色譜圖
圖3 :恩替卡韋原料的高效液相色譜圖
圖4 :輔料空白的高效液相色譜圖
圖5 :恩替卡韋片的高效液相色譜圖
具體實施例方式
實施例1 儀器和條件 高效液相色譜儀Agilent 1100型高效液相色譜儀 色譜柱Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mmX4. 6mm) 柱溫40。C 流動相正己烷-無水乙醇(60 : 40) 流速1.3ml/min 檢測波長254nm 進樣量10iU 實施步驟 分別取恩替卡韋原料25mg和恩替卡韋對映異構體12. 5mg，置同一 50ml量瓶中，加無水乙醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。 分別取試劑空白溶液和供試品溶液，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色 譜圖，結果見圖l和圖2。 圖2中保留時間為3. 807分鐘的色譜峰為恩替卡韋對映異構體的色譜峰；5. 963
分鐘的色譜峰為恩替卡韋的色譜峰，由圖可以看出，恩替卡韋與其對映異構體能夠達到基
線分離度。 實施例2 儀器和條件 高效液相色譜儀Agilent 1100型高效液相色譜儀
色譜柱Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mmX4. 6mm)
柱溫40。C 流動相正己烷-無水乙醇(60 : 40)
流速1.3ml/min
檢測波長254nm
進樣量10iU
實施步驟 取恩替卡韋原料25mg，置50ml量瓶中，加無水乙醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，作為 供試品溶液。 取供試品溶液，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結果見圖3。
圖3證明，恩替卡韋的光學純度達到原料藥要求，本法可以用於恩替卡韋的質量 實施例3 儀器和條件 高效液相色譜儀Agilent 1100型高效液相色譜儀 色譜柱Daicel CHIRALPAK AD手性柱(250mmX4. 6mm) 柱溫40。C 流動相正己烷-無水乙醇(60 : 40) 流速1.3ml/min 檢測波長254nm 進樣量10iU 實施步驟 取恩替卡韋片適量，約相當於恩替卡韋12. 5mg，置25ml量瓶中，加無水乙醇超聲
處理使溶解，並用乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。 取供試品溶液，按上述條件進行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，並同法進行空白
輔料試驗，結果見圖4、圖5。 圖4證明，空白輔料不幹擾本品的測定，圖5證明本法可以用於恩替卡韋片的質量 從圖l-圖4表明本發明的方法，可以清楚地將恩替卡韋與其手性異構體分離，同 時基線未發生漂移，有利於定量計算，可以準確地計算出手性異構體的含量，從有效控制恩替卡韋的產品質』
權利要求
一種採用高效液相色譜法(HPLC)分離測定恩替卡韋及其對映異構體的方法，其特徵在於採用三(3，5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直鏈澱粉為填料的手性色譜柱，以正己烷-低級醇溶液為流動相，正己烷-低級醇溶液體積比為25∶75～75∶25。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的手性色譜柱選自牌號為Daicel CHIRALPAKAD、Daicel CHIRALPAK AD-H禾卩Daicel CHIRALPAK IC的色譜柱。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的正己烷_低級醇溶液體積比為 60 : 40。
4. 根據權利要求1或3所述的方法，其特徵在於所述的低級醇選自甲醇、無水乙醇、丙 醇和異丙醇。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的低級醇為無水乙醇或異丙醇。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的方法還進一步包含以下步驟a) 供試品溶液的配製取恩替卡韋或含恩替卡韋的製劑適量，加無水乙醇溶解樣品， 配製成每1ml含恩替卡韋0. lmg至5mg的樣品溶液作為供試品溶液；b) 設置流動相的流速為0. 5 2. 0ml/min，設置檢測波長為205nm至260nm，設置色譜 柱的柱溫為25。C至45。C ;c) 取a)的樣品溶液設置進樣量為5 100 1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，完成 恩替卡韋與光學異構體的分離測定。
7. 根據權利要求6所述的方法，所述的步驟b)的柱溫為4(TC。
8. 根據權利要求6所述的方法，所述的步驟b)的檢測波長為254nm。
全文摘要
本發明涉及一種用液相色譜法分離測定恩替卡韋及其光學異構體的方法，該方法以三(3，5-二甲基苯基)-氨基甲酸酯直鏈澱粉為填料的手性色譜柱，以正己烷-低級醇溶液為流動相，正己烷-低級醇溶液體積比為25∶75～75∶25，可以定量測定恩替卡韋的光學異構體含量，從而有效控制產品質量。
文檔編號G01N30/02GK101701942SQ20091010476
公開日2010年5月5日 申請日期2009年9月3日 優先權日2009年9月3日
發明者何偉, 張道林, 李卉, 石瑞娜 申請人:重慶醫藥工業研究院有限責任公司