一種尼龍親和膜的製備方法和應用的製作方法

2023-06-02 10:40:56 1

專利名稱：一種尼龍親和膜的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種尼龍親和膜的製備方法和用途，特別是涉及一種以尼龍為基質、以染料Cibacron Blue F3GA為親和基的親和膜的製備方法及其在分離純化木瓜蛋白酶方面的應用。
背景技術：
木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一類巰基蛋白酶，廣泛存在於番木瓜(Caricapapaya)的根、莖、葉和果實內，其中在未成熟的乳汁中含量最豐富[1-2]。廣泛地應用於食品行業，如啤酒的澄清和肉質的嫩化以及皮革、紡織、日化和製藥工業[3-5]。木瓜蛋白酶的純化大部分是採用沉澱法，但是這種方法仍然混有其他的蛋白酶[6]，不能達到製藥工業的需求。
隨著人們對純度和安全性提出進一步的要求，色譜技術應用於木瓜蛋白酶的純化，如離子交換色譜、親和色譜[7-9]，該類填料特異性高，純化倍數高，但分離速度受粒間擴散和低的軸向速率限制，壓降大，分離時間長，處理量小，不能使用高的加料速度。而膜分離是一種根據分子的大小進行分離的技術，特點是表面積大、擴散路徑短、操作壓低、處理量大，但傳統膜分離技術只有分離相對分子質量相差10倍以上的物系，不能滿足生化分離的需要。
參考文獻[1]M.Azarkan，A.E.Moussaoui，D.W.Wuytswinkel，G.Dehon，Y.Looze.J.Chromatogr.B，2003，790229-238. Deng Jing(鄧靜)，Wu Huachang(吳華昌)，Zhou Jian(周健).G.X.Light Ind.(廣西輕工業)，2003，35-7. Q.H.Chen，GQ.He，Y.C.Jiao，H.Ni.Food Chem.，2006，98624-629.. S.S.Khaparde，R.S.Singhal.Bioresource Technol.，2001，781-4. F.S.Ian，M.Paul，S.Geisela.Bums，1999，25636-639. S.Nitsawang，H.K.Rajni，P.Kanasawud，Enzyme Microb.Tech.，2006，in press. D.Tombaccini，A.Mocali，E.Weber，F.Paoletti.Anal.Biochem.，2001，289231-238. E.Govrin，A.Levine.Protein Expres.Purif.，1999，15247-350. W.J.Syu，S.H.Wu，K.T.Wang.J.Chromatogr.，1983，262346-351. L.Yang，W.W.Hsiao，P.Chen，J.Membr.Sci.197(2002)185.

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種尼龍親和膜的製備方法和應用，以彌補現有技術的不足或缺陷，滿足生產和生活的需要。
為了解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案之一是一種尼龍親和膜的製備方法，包括如下步驟(1)尼龍膜先在0.1-10M鹽酸重水解10-72h，然後以10％-25％的戊二醛活化處理，活化後的尼龍膜置於0.5％-5％的殼聚糖溶液中進行化學鍵合，然後在70-120℃的烘箱中烘乾，即得殼聚糖改性的尼龍膜；(2)把殼聚糖改性處理後的尼龍膜2-10g置於濃度為5.0-30mg/ml的50-350mlCibacron Blue F3GA染料溶液中，60℃反應0.5-3h，然後加入20-50ml濃度為20％NaCl溶液，繼續反應1.0-3.0h，然後加入5.0-20ml濃度為20％的NaCO3溶液進行固色反應，反應2-10h後，取出，依次以熱水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去離子水進行洗滌，得到所述的尼龍親和膜，4℃保存，備用。
為了解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案之二是所述的尼龍親和膜的用於分離純化木瓜蛋白酶，包括如下步驟10-20張尼龍親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩衝液和洗脫液，首先以0.05M、pH為7.0的磷酸緩衝液平衡10-20min，流速為0.1-1.0ml/min；隨後以蠕動泵送入15-50ml的1.0-5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液通過膜橋，然後以0.05M、pH7.0磷酸緩衝液洗去未吸附上的蛋白質；最後以0.05M、pH為8.0磷酸緩衝液配製的1.0M NaSCN進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶。
本發明的有益效果是與傳統的膜分離、親和色譜相比，本發明製備的尼龍親和膜不僅具有純化倍數高、壓降小，分析時間短、生物大分子在分離過程中變性機率小，允許較快的加料速度等特點，而且比柱親和色譜更易實現規模化純化分離。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細闡述。
實施例1尼龍膜先在0.1M鹽酸重水解72h，然後以10％的戊二醛活化處理，活化的尼龍膜然後置於0.5％的殼聚糖溶液中進行化學鍵合，然後在70℃的烘箱中烘乾，即得殼聚糖改性的尼龍膜。尼龍膜上鍵合的殼聚糖含量按文獻[10]公開的方法進行測試，測試結果殼聚糖的含量為89.6mg/g膜。
把殼聚糖改性處理後的尼龍膜2g置於濃度為5.0mg/ml的50mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反應0.5h，然後加入20ml濃度為20％NaCl溶液，繼續反應1.0h，然後加入5.0ml濃度為20％的NaCO3溶液進行固色反應，反應2h後，取出，依次以熱水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去離子水進行洗滌，4℃保存，備用。
親和膜組成膜堆對木瓜蛋白酶進行分離純化包括如下步驟10張上述方法製備的親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩衝液和洗脫液等。首先以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)平衡10min，流速0.1ml/min；接著送樣，15ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然後以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白質。最後以0.05M磷酸緩衝液(pH8.0)配製的1.0MNaSCN.進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在95％。
實施例2尼龍膜先在10M鹽酸重水解10h，然後以25％的戊二醛活化處理，活化的尼龍膜然後置於5％的殼聚糖溶液中進行化學鍵合，然後在120℃的烘箱中烘乾，即得殼聚糖改性的尼龍膜。尼龍膜上鍵合的殼聚糖含量按文獻[10]公開的方法進行測試，測試結果殼聚糖的含量為90.6mg/g膜。
把殼聚糖改性處理後的尼龍膜10g置於濃度為30mg/ml的350mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反應3h，然後加入50ml濃度為20％NaCl溶液，繼續反應3.0h，然後加入20ml濃度為20％的NaCO3溶液進行固色反應，反應10h後，取出，依次以熱水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去離子水進行洗滌，4℃保存，備用。
親和膜組成膜堆對木瓜蛋白酶進行分離純化包括如下步驟20張上述方法製備的親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩衝液和洗脫液等。首先以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)平衡20min，流速0.1-1.0ml/min；接著送樣，50ml的5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然後以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白質。最後以0.05M磷酸緩衝液(pH8.0)配製的1.0M NaSCN.進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在93％。
實施例3尼龍膜先在5M鹽酸重水解50h，然後以15％的戊二醛活化處理，活化的尼龍膜然後置於3％的殼聚糖溶液中進行化學鍵合，然後在100℃的烘箱中烘乾，即得殼聚糖改性的尼龍膜。尼龍膜上鍵合的殼聚糖含量按文獻[10]公開的方法進行測試，測試結果殼聚糖的含量為89.2mg/g膜。
把殼聚糖改性處理後的尼龍膜5g置於濃度為20mg/ml的200mlCibacronBlue F3GA染料溶液中，60℃反應2h，然後加入30ml濃度為20％NaCl溶液，繼續反應2h，然後加入10ml濃度為20％的NaCO3溶液進行固色反應，反應5h後，取出，依次以熱水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去離子水進行洗滌，4℃保存，備用。
親和膜組成膜堆對木瓜蛋白酶進行分離純化包括如下步驟15張上述方法製備的親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩衝液和洗脫液等。首先以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)平衡15min，流速0.5ml/min；接著送樣，30ml的3.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然後以0.05M磷酸緩衝液(pH7.0)洗去未吸附上的蛋白質。最後以0.05M磷酸緩衝液(pH8.0)配製的1.0MNaSCN.進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶。得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在90％。
實施例4本發明的尼龍親和膜對木瓜蛋白酶的吸附性能測試包括如下步驟精確稱取一定量按上述方法製備的尼龍親和膜，置於0.05M，不同pH值的緩衝液配製的木瓜蛋白酶溶液(2.0mg/ml)中，室溫震蕩不同時間後，測量吸附前後蛋白質溶液在280nm下的吸光度，按下式計算吸附量Q＝[(ci-ct)Vs]/m式中Q-吸附量；ci-吸附前濃度；ct-吸附後濃度； Vs-溶液體積；m-膜質量測試結果為在pH值8.0，25℃，吸附時間3h，木瓜蛋白酶原始濃度為4.0mg/ml，吸附量可達到235.3mg/g。
權利要求
1.一種尼龍親和膜的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)尼龍膜先在0.1-10M鹽酸重水解10-72h，然後以10％-25％的戊二醛活化處理，活化後的尼龍膜置於0.5％-5％的殼聚糖溶液中進行化學鍵合，然後在70-120℃的烘箱中烘乾，即得殼聚糖改性的尼龍膜；(2)把殼聚糖改性處理後的尼龍膜2-10g置於濃度為5.0-30mg/ml的50-350mlCibacron Blue F3GA染料溶液中，60℃反應0.5-3h，然後加入20-50ml濃度為20％NaCl溶液，繼續反應1.0-3.0h，然後加入5.0-20ml濃度為20％的NaCO3溶液進行固色反應，反應2-10h後，取出，依次以熱水，甲醇、2M NaCl，6M尿素，去離子水進行洗滌，得到所述的尼龍親和膜，4℃保存，備用。
2.一種如權利要求1所述的尼龍親和膜的應用，其特徵在於，用於分離純化木瓜蛋白酶。
3.根據權利要求2所述的尼龍親和膜的應用，其特徵在於，尼龍親和膜分離純化木瓜蛋白酶包括如下步驟10-20張尼龍親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入緩衝液和洗脫液，首先以0.05M、pH為7.0的磷酸緩衝液平衡10-20min，流速為0.1-1.0ml/min，隨後以蠕動泵送入15-50ml的1.0-5.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液通過膜橋，然後以0.05M、pH7.0磷酸緩衝液洗去未吸附上的蛋白質；最後以0.05M、pH為8.0磷酸緩衝液配製的1.0M NaSCN進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶。
全文摘要
本發明公開了一種尼龍親和膜的製備方法，包括如下步驟(1)在尼龍膜上化學鍵合殼聚糖，以降低尼龍膜對蛋白質的非特異性吸附，即得殼聚糖改性的尼龍膜；(2)把殼聚糖改性處理後的尼龍膜與親和基染料Cibacron Blue F3GA的鍵合，得到所述尼龍親和膜；尼龍親和膜用於分離純化木瓜蛋白酶。本發明的有益效果是與傳統的膜分離、親和色譜相比，本發明製備的尼龍親和膜不僅具有純化倍數高、壓降小，分析時間短、生物大分子在分離過程中變性機率小，允許較快的加料速度等特點，而且比柱親和色譜更易實現規模化純化分離。
文檔編號C12N9/50GK1935339SQ20061011607
公開日2007年3月28日 申請日期2006年9月15日 優先權日2006年9月15日
發明者朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學