一種禽流感h9亞型滅活疫苗及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-02 05:52:51

一種禽流感h9亞型滅活疫苗及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種禽流感H9亞型滅活疫苗，由2株H9亞型禽流感病毒經滅活後和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，HZ株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ?ID?NO:2所示。其通過製備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液和FJ株毒液，製備油相溶液，製備水相溶液以及乳化製得。本發明利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株製備一種免疫原性強、交叉保護性好的滅活疫苗，能夠應用於預防雞H9亞型禽流感疾病中。該疫苗接種雞後，抗體效價高，使得雞對不同地方流行的H9亞型毒株攻毒保護力好，並且安全性高、效力穩定。
【專利說明】一種禽流感H9亞型滅活疫苗及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於動物用生物製品【技術領域】，具體涉及一種禽流感H9亞型滅活疫苗及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]禽流感(Avian Influenza，Al)，是由流感病毒屬的A型流感病毒引起的禽類感染和疾病的總稱。雞、火雞、鴨和鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染，而對家養的雞和火雞引起的危害最為嚴重，候鳥、觀賞鳥、散禽攜帶病毒遷徙可能是禽流感世界性流行的主要原因，豬等也可作為「混合器」傳播本病。
[0003]根據禽流感病毒AIV對禽類致病性的差異，可將AIV分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H9亞型禽流感屬於低致病性流感病毒，是目前我國雞群中存在的AIV主要亞型，該病毒發病後雖然致死率不高(一般不超過30%)，但常導致呼吸道症狀，蛋雞的產蛋下降，並使雞群易繼發嚴重的呼吸道疾病，影響家禽生產性能。目前其流行特點是:H9亞型仍是當前流行的主要亞型；H9亞型已發生變異；H9亞型成散發或地方性流行；H9亞型呈現出條件性致病的特性；H9亞型對肉仔雞危害日益嚴重。
[0004]AIV遺傳變異極為頻繁，血清亞型眾多。研究發現，AIV可通過基於的點突變、基因重組和節段重排而發生不同程度的變異，從而使流感病毒的抗原性和致病性發生改變。AIV的變異主要發生在HA和NA基因上，尤其是HA基因，其分子機理主要有:抗原漂移、抗原轉變、RNA重組和缺損性病毒顆粒的產生等。近些年，隨著反向遺傳學的發展，禽流感遺傳變異和其機制逐步得到證實。就H5亞型而言，根據當前H5亞型的變異情況，採用反向遺傳技術獲得了 Rec-l、Rec-4、Rec-5和Rec_6疫苗株，在高致病性禽流感的防控方面取得了一定的成績。關於H9亞型的變異研究也一直在進行中。劉巖對1998-2002年間分離的H9亞型禽流感病毒的抗原性變異進行了研究，經交叉HI試驗、雞胚中和試驗、細胞中和試驗、交叉攻毒保護試驗及HA基因分析，證明了 H9亞型禽流感病毒已經發生了抗原性漂移。而姜北宇等人的研究則表明，1998-2008年在北京及河北省分離的4株H9亞型禽流感流行毒株間大多產生了較好的交叉保護力，用1998-2006年分離的流行毒株製備的滅活疫苗能夠保護2008年流行毒株的攻擊。可見，對於H9亞型禽流感病毒流行毒株抗原性是否發生變異的問題，不同報導得出的試驗結論存在較大的差異。
[0005]疫苗免疫仍是目前防控H9亞型禽流感有效辦法之一。隨著H9亞型禽流感滅活疫苗單苗或者聯苗的廣泛應用，近些年來，在免疫壓力的作用下，開始出現以前使用的疫苗毒株對現地分離毒株的免疫保護力下降，許多養殖單位根據自身免疫需要紛紛採用現地流行毒株製成滅活疫苗來防控H9亞型禽流感的發生，但這些疫苗不能正規生產、銷售和大面積推廣，並且不能保證其安全性。因此，針對疫病現在的流行特點，重新篩選安全、有效、穩定的禽流感H9亞型病毒株製備H9亞型滅活疫苗顯得非常必要。
【發明內容】
[0006]為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株製備成一種免疫原性強、交叉保護性好的滅活疫苗，用於預防雞H9亞型
禽流感。
[0007]為解決上述問題，本發明所採用的技術方案如下: [0008]一種禽流感H9亞型滅活疫苗，由2株H9亞型禽流感病毒經滅活後和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，其保藏登記號分別為CGMCC N0.8355和CGMCC N0.8354 ；HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQ IDNO: 2所示。HZ株和FJ株於2013年10月15日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，該中心於2013年10月18日收到上述保藏菌株，保藏日期為2013年10月18日，該中心地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵編100101。
[0009]一種禽流感H9亞型滅活疫苗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟:
[0010]I)製備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:將H9亞型禽流感病毒HZ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收穫24~96小時內死亡及96小時後仍存活的HA ^ 81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒HZ株毒液；
[0011]2)製備H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:將H9亞型禽流感病毒FJ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收穫24~96小時內死亡及96小時後仍存活的HA ^ 81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒FJ株毒液；
[0012]3)滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入終濃度為0.2%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時；
[0013]4)滅活H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入終濃度為0.1%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時；
[0014]5)製備油相溶液:將白油和司本-80按照體積比為18~20:1混合均勻，加熱溶解後經121°C滅菌20分鐘；
[0015]6)製備水相溶液:將滅活的HZ株毒液和滅活的FJ株毒液按照體積比為6:4混合均勻，加入佔混合毒液體積比0.75%的高壓滅菌的吐溫-80，用磁力攪拌器混勻攪拌至吐溫完全溶解；
[0016]7)乳化:將油相溶液和水相溶液按照體積比為I~2:1混合均勻，在乳化攪拌機中攪拌，即製成所述禽流感H9亞型滅活疫苗。
[0017]作為本發明的進一步技術方案，步驟5)中的白油和司本-80按照體積比為18.5:1混合。
[0018]作為本發明的進一步技術方案，步驟7)中的油相溶液和水相溶液按照體積比為
1.5:1混合。
[0019]一種禽流感H9亞型滅活疫苗在預防雞禽流感疾病中的應用。
[0020]相比現有技術，本發明的有益效果在於:利用2株不同地方分離的H9亞型禽流感毒株製備成一種免疫原性強、交叉保護性好的滅活疫苗，用於預防雞H9亞型禽流感。該疫苗接種雞後，抗體效價高，使得雞對不同地方流行的H9亞型毒株攻毒保護力好，並且安全性高、效力穩定。
[0021]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為黃雞免疫HZ-FJ株滅活疫苗後的禽流感H9亞型血清抗體水平變化；
[0023]圖2為竹絲雞免疫HZ-FJ株滅活疫苗後禽流感H9亞型血清抗體水平變化。
【具體實施方式】
[0024]實施例1:H9亞型禽流感病毒HZ株和FJ株的生物學特性研究
[0025]本發明所述的H9亞型禽流感病毒HZ株和FJ株分別是2010年在我國浙江湖州地區和福建莆田地區發病雞場的發病雞群採集的病料中分離到的，經測序鑑定，都為禽流感病毒H9亞型。其生物學特性研究如下:1)毒種傳代:HZ株、FJ株原代種毒(El代)用滅菌生理鹽水稀釋至10_4，經尿囊腔內接種9日齡SPF雞胚，每胚0.2mL,於37°C繼續孵育96小時，收穫24~96小時內死亡及存活的雞胚，凍存過夜後逐個收穫雞胚液並檢測其HA效價，將檢驗無菌且HA效價> 81og2的雞胚液混合，定量分裝，註明收穫日期、毒種代次等，標記為E2代，留取少量繼續傳代，其餘的置_70°C保存備用。按上述方法連續在SPF雞胚內傳代至第8代(ES代)，每一代分別測定各胚的HA效價及其平均數，結果詳見表1。
[0026]表1毒株El~E8代的HA效價
[0027]
【權利要求】
1.一種禽流感H9亞型滅活疫苗，其特徵在於:由2株H9亞型禽流感病毒經滅活後和油佐劑混合組成，2株H9亞型禽流感病毒分別為HZ株和FJ株，其保藏登記號分別為CGMCC:8355和CGMCC:8354,HZ株的HA基因序列如SEQ ID NO:1所示，FJ株的HA基因序列如SEQID NO:2 所示。
2.—種權利要求1所述的禽流感H9亞型滅活疫苗的製備方法，其特徵在於包括如下步驟: 1)製備H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:將H9亞型禽流感病毒HZ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種9~11日齡SPF雞胚，無菌收穫24~96小時內死亡及96小時後仍存活的HA≥81og2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒HZ株毒液； 2)製備H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:將H9亞型禽流感病毒FJ株用生理鹽水作10_4稀釋，接種擴11日齡SPF雞胚，無菌收穫24、6小時內死亡及96小時後仍存活的HA >8log2的雞胚尿囊液作為H9亞型禽流感病毒FJ株毒液； 3)滅活H9亞型禽流感病毒HZ株毒液:在HZ株毒液中加入終濃度為0.2%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時； 4)滅活H9亞型禽流感病毒FJ株毒液:在FJ株毒液中加入終濃度為0.1%甲醛溶液，37 °C搖床滅活24小時； 5)製備油相溶液:將白油和司本-80按照體積比為If20:1混合均勻，加熱溶解後經121°C滅菌20分鐘； 6)製備水相溶液:將滅活的HZ株毒液和滅活的FJ株毒液按照體積比為6:4混合均勻，加入佔混合毒液體積比0.75%的高壓滅菌的吐溫-80，用磁力攪拌器混勻攪拌至吐溫完全溶解； 7)乳化:將油相溶液和水相溶液按照體積比為廣2:1混合均勻，在乳化攪拌機中攪拌，即製成所述禽流感H9亞型滅活疫苗。
3.根據權利要求2所述的一種禽流感H9亞型滅活疫苗的製備方法，其特徵在於:步驟5)中的白油和司本-80按照體積比為18.5:1混合。
4.根據權利要求2所述的一種禽流感H9亞型滅活疫苗的製備方法，其特徵在於:步驟7)中的油相溶液和水相溶液按照體積比為1.5:1混合。
5.一種禽流感H9亞型滅活疫苗在預防雞禽流感疾病中的應用。
【文檔編號】C12R1/93GK103736088SQ201310553960
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】陳瑞愛, 林綺萍, 陳春麗, 黃文科, 徐家華, 嚴潔珍 申請人:廣東大華農動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農生物藥品有限公司