氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞分化的應用的製作方法
2023-06-02 15:37:11
氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞分化的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞定向分化中的應用，實驗證明，在骨髓間充質幹細胞的培養基中添加濃度為5μg/mL的氧化型低密度脂蛋白，BMMSCs具有顯著的細胞增殖，並能檢測到心肌樣細胞特異性蛋白和心肌細胞標誌性分子的表達，表明骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞定向分化，其心肌樣細胞轉化率高達30％。
【專利說明】氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細 胞分化的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞分化的方法，特別是涉及氧 化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞分化的應用。
【背景技術】
[0002] 骨髓間充質幹細胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)是存在於 骨髓內的一類成體幹細胞，具有很強的自我更新能力和多向分化潛能，在特定的生理環境 下或體外誘導培養條件下，可向成骨、軟骨、脂肪、成肌、神經和內皮等多種成體細胞分化。 BMMSCs是目前在組織工程和再生醫學中應用最廣泛的種子細胞之一，已被臨床上應用於神 經系統和心血管系統疾病的治療。動物實驗研究表明，將BMMSCs移植到特定組織和器官 中，其可向該組織和器官的功能細胞分化。
[0003] 心肌細胞是不可再生細胞，一旦死亡，只能靠鄰近組織的心肌成纖維細胞的增殖 來補充。然而，成纖維細胞會分泌大量的膠原蛋白，這將造成心肌纖維化，會導致心肌功能 下降，嚴重者可導致心力衰竭。而利用幹細胞的心肌分化特性和幹細胞移植來治療心肌梗 死，已成為心血管和幹細胞領域的一個熱點問題。近年來，有關BMMSCs向心肌細胞分化以 及移植治療心肌梗死的研究已成為國內外研究的重點課題之一。相關研究顯示，移植到心 肌梗死部位的BMMSCs可通過向心肌細胞分化而補充部分損失的心臟固有心肌細胞，不同 程度地改善心臟功能，縮小心肌梗死面積。但是，目前有關幹細胞移植治療心肌梗死仍存在 諸多問題，其中最主要的是向心肌細胞轉化效率較低的問題。相關研究顯示，移植到心肌梗 死部位的幹細胞，包括臍帶來源的幹細胞、臍帶血來源的幹細胞和骨髓間充質幹細胞，均不 能產生有效治療數量的心肌細胞。
[0004] 研究顯示，血管緊張素 II (Angiotensin II，Ang II)可促進BMMSCs向心肌 樣細胞轉化，5-氮雜胞啼陡核苷（5-Azacytidine)也可通過活化細胞外信號調節激酶 1/2 (Extracellular Signal-Regulated Protein 1/2, ERK1/2)而促進 BMMSCs 向心肌樣細 胞轉化。然而，採用血管緊張素 Π 體外誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化時，存在用量大、成 本高、誘導轉化效率低等問題，而且血管緊張素 II在體內容易引發高血壓等副作用。5-氮 雜胞嘧啶核苷則屬於化學誘導劑，會對機體產生不良刺激作用，例如肝功能損傷、白細胞減 少等，此外，5-氮雜胞嘧啶核苷在臨床上亦用作化療藥物，其容易引起細胞凋亡。
【發明內容】
[0005] 基於此，有必要針對現有技術所存在的問題，提供一種誘導轉化效率高、副作用少 的誘導劑，以高效地誘導BMMSCs向心肌樣細胞定向分化。
[0006] 本發明所採用的技術方案如下：
[0007] 氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞（BMMSCs)向心肌樣細胞定向分化 中的應用。
[0008] 在其中一個實施例中，在骨髓間充質幹細胞的培養基中添加濃度為5 μ g/mL的氧 化型低密度脂蛋白。
[0009] 實驗證明，氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein, ox-LDL) 能夠誘導骨髓間充質幹細胞（BMMSCs)向心肌樣細胞定向分化，心肌樣細胞轉化率高達 30%。BMMSCs經ox-LDL誘導培養後，促細胞增殖基因 Mdm2表達增高，顯著促進BMMSCs 細胞增殖，並能檢測到心肌樣細胞特異性蛋白--波形蛋白（Vimentin)的表達，同時，心 肌細胞標誌性分子-心鈉素 （Atrial Natriuretic Peptide, ANP)、B型鈉素（B-type Natriuretic Peptide，BNP)、α -肌球蛋白重鏈（a -MHC)、β -肌球蛋白重鏈（β -MHC)和 α-心肌肌動蛋白（a-Cardiac Actin)的mRNA表達量亦顯著增高。
[0010] 氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL)作為誘導劑，不但能夠有效誘導BMMSCs向心肌樣 細胞分化，而且能夠促進細胞增殖，同時，氧化型低密度脂蛋白屬於內源性物質，不會對機 體產生不良的刺激作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為BMMSCs的細胞形態圖；
[0012] 圖2為BMMSCs對DiΙ-ox-LDL的攝入檢測圖；
[0013] 圖3為BMMSCs經ox-LDL誘導後的MTT檢測結果；
[0014] 圖4為Western-blotting檢測BMMSCs促細胞增殖基因 Mdm2的表達；
[0015] 圖5為免疫螢光檢測BMMSCs中Vimentin的表達，其中，A為Heochest3342染色 細胞，B為Vimentin陽性細胞，C為Heochest3342染色細胞與Vimentin陽性細胞的疊加；
[0016] 圖6為ox-LDL誘導BMMSCs向心肌樣細胞轉化的轉化率；
[0017] 圖 7 為 Western-blotting 檢測 Vimentin 的表達量；
[0018] 圖8A至圖8E為RT-PCR檢測心肌細胞標誌分子的mRNA表達量。
【具體實施方式】
[0019] 實施例一：小鼠骨髓間充質幹細胞（BMMSCs)的分離和培養
[0020] 在無菌條件下，從小鼠後肢股骨骨髓中分離出骨髓間充質幹細胞，加入含20%胎 牛血清的DMEM培養基中，以5X IO5AiL的濃度接種於細胞培養瓶，置於37°C、5% CO2的培 養箱中進行培養，培養3周後獲得高純度的BMMSCs (如圖1所示）。
[0021] 實施例二：小鼠骨髓間充質幹細胞（BMMSCs)的誘導分化
[0022] 取培養3周後的BMMSCs，用0. 25%胰蛋白酶消化，PBS緩衝液清洗後，加入含20% 胎牛血清的DMEM培養基中充分混勻；以5 X IO6AiL的細胞濃度將BMMSCs接種於培養瓶中， 並向培養基中加入5 μ g/mL的氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL)，然後在37°C、5% CO2的條件 下進行誘導培養，每3天換液一次並添加5 μ g/mL的ox-LDL，誘導分化4周。
[0023] 分別取誘導1周、2周、3周和4周的細胞液，於螢光顯微鏡下觀察誘導後的細胞形 態，並通過MTT法測定細胞增殖數量，通過細胞免疫組織化學方法檢測Vimentin陽性細胞 的數量和心肌樣細胞轉化率，以及通過RT-PCR法檢測心肌細胞標誌性分子的mRNA表達情 況（詳見實施例三至實施例八）。
[0024] 實施例三：二辛醯基四甲基吲哚花青過氯酸鹽（Dil)螢光標記的 ox-LDL(Dil-ox-LDL)攝入檢測
[0025] 將BMMSCs以IX IOVcm2的密度接種於12孔培養板中，培養4天後向培養基中添加 5μ g/mL的Dil-ox-LDL，置於37°C、5% CO2的培養箱中孵育30分鐘，然後用無血清的DMEM 培養基洗滌細胞2次，置於螢光顯微鏡下觀察並拍照，檢測結果如圖2所示。
[0026] 檢測結果表明，BMMSCs具有很強的攝取ox-LDL的能力。
[0027] 實施例四：MTT法檢測細胞增殖情況
[0028] 將BMMSCs以I X IOVcm2的密度接種於96孔培養板中，同時設置對照組和樣品組， 對照組採用常規DMffl培養基，樣品組在DMffl培養基中加入5 μ g/mL的ox-LDL，於37 °C、5 % CO2的培養箱中孵育24小時後，向每孔加入10 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶液，繼續孵育2 小時，然後向每孔加入100 μ LDMSO溶液，再孵育2小時後，採用酶聯免疫檢測儀檢測570nm 處的吸光值。
[0029] 檢測結果顯示，對照組的吸光值為0. 140D，樣品組的吸光值為0. 210D，由樣品組 吸光值與對照組吸光值的比值計算樣品組的相對細胞增殖數值，結果如圖3所示。實驗結 果證明，與對照組相比，樣品組的BMMSCs在培養24小時後細胞數量顯著增加，表明ox-LDL 能夠刺激BMMSCs的增殖。
[0030] 實施例五：免疫印跡（Western-blotting)檢測促增殖基因 Mdm2的表達
[0031] 以實施例一培養得到的BMMSCs作為對照組，以實施例二中經誘導分化4周後的細 胞作為樣品組，分別用總蛋白提取試劑盒提取對照組、樣品組細胞的總蛋白，用12%的聚丙 烯醯胺凝膠電泳分離蛋白，並將其轉到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上（電流為200mA，轉 膜時間為2小時）；室溫下用5%的BSA封閉PVDF膜1小時，然後加入兔抗小鼠 Mdm2抗體 (1 : 1000稀釋），置於搖床上在4°C下過夜孵育；用含有0. 1% Tween20的Tris鹼緩衝液 (TBS)洗膜3次，然後加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗IgG-HR(l : 1000稀釋），置 於搖床上在室溫下孵育1小時；用含有0. 1 % TWeen20的TBS洗膜3次，用ECL超敏發光液 (購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.)發光並曝光底物。以持家基因 β-actin作為 內參對照，經灰度掃描後分別與β-actin的灰度值進行比較，計算對照組、樣品組的心肌 樣細胞促增殖基因 Mdm2的表達量，結果如圖4所示。
[0032] 檢測結果顯示，樣品組的BMMSCs經誘導培養後，促增殖基因 Mdm2表達量顯著升 高，表明ox-LDL能夠刺激BMMSCs的增殖。
[0033] 實施例六：免疫螢光檢測心肌樣細胞特異性蛋白Vimentin的表達
[0034] 將BMMSCs以IX IOVcm2的密度接種於12孔培養板中，同時設置對照組和樣品 組，對照組採用常規DMEM培養基，樣品組在培養4天後向DMEM培養基中加入5 μ g/mL的 ox-LDL，於37°C、5% CO2的條件下誘導培養3周；用4%的中性福馬林固定細胞，PBS緩 衝液洗滌細胞2次，在室溫下用1 %的牛血清白蛋白（BSA)作為封閉液封閉細胞30分鐘，然 後向細胞滴加兔抗小鼠 Vimentin抗體（1 : 200稀釋），室溫孵育1小時後，用PBS緩衝液 洗滌細胞3次；然後添加螢光素 Cy3標記的山羊抗兔二抗IgM(l : 200稀釋），室溫避光孵 育30分鐘後，用PBS緩衝液洗滌細胞2次；然後滴加 He〇chest3342染料（細胞核特異性染 料，購自美國ImmunoChemistryTechnologies，LLC)溶液（1 : 500稀釋），室溫下孵育5分 鍾後，用PBS緩衝液洗滌細胞3次；置於螢光顯微鏡下觀察、拍照，並分別統計細胞總數（即 He〇chest3342染色細胞數量）、Vimentin陽性細胞數量，並計算心肌樣細胞轉化率，結果如 圖5、圖6所示。
[0035] 心肌樣細胞轉化率=Vimentin陽性細胞數量/Heochest3342染色細胞數量
[0036] 實驗結果證明，樣品組的Vimentin陽性細胞數量以及心肌樣細胞轉化率均顯著 高於對照組，表明ox-LDL能夠誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化。
[0037] 實施例七：免疫印跡（Western-blotting)檢測心肌樣細胞特異性蛋白Vimentin 的表達量
[0038] 以實施例一培養得到的BMMSCs作為對照組，以實施例二中經誘導分化4周後的細 胞作為樣品組，分別用總蛋白提取試劑盒提取對照組、樣品組細胞的總蛋白，用12%的聚丙 烯醯胺凝膠電泳分離蛋白，並將其轉到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上（電流為200mA，轉膜 時間為2小時）；室溫下用5%的BSA封閉PVDF膜1小時，然後加入兔抗小鼠 Vimentin抗 體（1 : 1000稀釋），置於搖床上在4°C下過夜孵育；用含有0. 1% Tween20的Tris鹼緩衝 液（TBS)洗膜3次，然後加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗IgG-HR(l : 1000稀釋）， 置於搖床上在室溫下孵育1小時；用含有0. 1 % Tween20的TBS洗膜3次，用ECL超敏發光 液（購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.)發光並曝光底物。以持家基因 β-actin 作為內參對照，經灰度掃描後分別與β-actin的灰度值進行比較，計算對照組、樣品組的 心肌樣細胞特異性蛋白Vimentin的表達量，結果如圖7所示。
[0039] 實驗結果證明，樣品組的Vimentin表達量顯著高於對照組，表明ox-LDL能夠誘導 BMMSCs向心肌樣細胞分化。
[0040] 實施例八：反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)檢測心肌細胞標誌分子ANP、BNP、 a -MHC、β -MHC 和 a -Cardiac Actin 的 mRNA 表達量
[0041] 以實施例一培養得到的BMMSCs作為對照組，以實施例二中經誘導分化4周後的細 胞作為樣品組，分別用RNA提取試劑盒從對照組、樣品組的細胞提取總RNA，並用DnaseI (脫 氧核糖核酸酶）處理RNA樣品，以除去DNA汙染。分別將對照組、樣品組的RNA樣品稀釋為 100 μ g/mL,分別取10 μ L樣品,用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。分別以對照組、樣品組的 第一鏈cDNA作為模板，採用表1所示的引物進行PCR反應，以測定BMMSCs經ox-LDL誘導 後的心肌細胞標誌性分子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC和a-Cardiac Actin表達量。
[0042] PCR反應體系：cDNA模板100ng、引物0.3 μ Μ、10 X PCR反應液2 μ L，加入去離子水 至 20 μ L。
[0043] PCR反應條件：94°C預變性5分鐘，94 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸2分 鍾，30個循環後，72 °C終延伸10分鐘。
[0044] 表IPCR反應引物
【權利要求】
1. 氧化型低密度脂蛋白在誘導骨髓間充質幹細胞向心肌樣細胞定向分化中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於：在骨髓間充質幹細胞的培養基中添加濃 度為g/mL的氧化型低密度脂蛋白。
【文檔編號】C12N5/077GK104388384SQ201410598896
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】林俊堂, 曹毓琳, 張芬熙, 王現偉, 李永海, 豐慧根, 連傑 申請人:河南省華隆生物技術有限公司, 新鄉醫學院