一種香蕉吸芽莖尖接種的方法
2023-06-02 13:43:31
專利名稱：一種香蕉吸芽莖尖接種的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，具體涉及香蕉外植體接種並獲得無菌材料的 方法，即香蕉吸芽莖尖接種的方法。
背景技術：
廣義的香蕉包括了香蕉(Banana)和大蕉(Plantain)兩大類，同屬於芭蕉科 (Musaceae)芭蕉屬(Musa)。香蕉栽培種(Musa sp.)屬於單性三倍體(AAA，AAB，ABB)，具 有高度不育性。香蕉是世界重要的水果，也是我國嶺南四大佳果之一。由於香蕉沒有種子，所以傳 統的繁殖方法是靠挖取吸芽種植，而吸芽種植會帶來許多問題，如容易造成病害傳播、種質 退化、生產管理困難等等。在二十世紀八十年代初，我國就開始了香蕉組織培養技術研究， 優質試管苗得到了極大的推廣種植。到目前為止，香蕉主栽區基本全部都採用香蕉試管苗 種植，主要種植品種有巴西、威廉斯、廣東2號、廣粉1號、順德中巴大蕉、新北蕉等。香蕉組織培養外植體主要有吸芽莖尖、花序軸和雄花分生組織等。以花序軸和雄 花分生組織作為外植體的培養方法通過誘導愈傷組織途徑產生叢生芽，然後進行增殖培 養。這兩種方法都經過植物組織細胞「脫分化——再分化」的過程，在此過程中容易引起基 因變化而產生較高的變異率。因此通過誘導愈傷組織途徑產生叢生芽的方法不適宜用來繁 殖香蕉等經濟作物種苗。而誘導吸芽莖尖直接產生不定叢芽的方法不經過「脫分化——再 分化」過程，對基因不會產生太大影響，在較低濃度6-BA濃度(2 2. Omg/L)下，繼代次數 控制在12代以內的條件下，生產出來的試管苗變異率較低。因此目前香蕉試管苗工廠化生 產基本上都是採用吸芽莖尖直接誘導不定叢芽的方法。在香蕉吸芽莖尖接種方法上，傳統的做法是先將選取的香蕉吸芽切成約5釐 米X3釐米X3釐米大小，然後在超淨工作檯上再小心地將莖尖切成1 2釐米大小，大約 用0. 1 %升汞溶液浸泡，進行表面消毒15 20分鐘，再用無菌水衝洗3次，經削去消毒過的 表面組織，最後接種到誘導培養基上進行誘導培養。該方法存在幾個缺點(1)不夠環保一般採用的外植體表面消毒劑為升汞，是一 種劇毒物質，消毒完後的廢棄液會造成環境汙染。同時，殘留有消毒劑會影響莖尖誘導培 養。(2)較繁瑣、耗時在進行表面消毒前，需要將莖尖組織進行嚴格的切割，要切得表面十 分光滑，切割過程中必須要經常換消毒過的刀和鑷子，操作繁瑣，因此也十分的耗時。據觀 察，比較熟練的人員一天也只能接種50 60個香蕉吸芽。(3)不夠簡易，很難獲得較高的 接種成功率。該方法表面上看似乎很簡單，但實際操作起來很難熟練掌握。採用該方法接 種香蕉外植體，一般人員的接種成功率50 60%，甚至更低，熟練人員能獲得80 85%的 接種成功率已是非常不錯。
發明內容
為克服上述技術缺陷，本發明的目的是提供一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，該方
3法簡便易行、高效、環保。為實現上述目的，本發明採用如下方案挑取無菌的莖尖接種到誘導培養基中進 行誘導培養，而所述無菌的莖尖是通過無菌剝離葉鞘操作而獲得的。具體來說，是用經高溫 消毒的手術刀小心地將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界線環割，力度把握應該不使刀尖劃 破該層葉鞘而碰到裡面相鄰一層的葉鞘，依次層層環剝，這樣操作就不會將外面葉鞘的雜 菌帶到裡面的葉鞘；最後，把全部包住的葉鞘都剝離開，便可輕易挑取無菌的莖尖接種到誘 導培養基中進行誘導培養。以下對本發明作進一步的描述，具體方法步驟如下
1)、香蕉吸芽預處理。將取回的香蕉吸芽用刀小心切去球莖和假莖外層，切去多少組織要視香蕉吸芽大 小而定，經處理後的吸芽大小一般要求為球莖、假莖部分各長6 10釐米，底部直徑大約 2 3釐米的圓柱體；比較小的吸芽經處理後為球莖、假莖部分各長2 3釐米，底部直徑 約1釐米的圓柱體。切去吸芽多餘部分時要注意幾點①儘量避免將吸芽帶的泥土弄髒切成的圓柱 體。②切的時候應該沿著葉鞘垂直向球莖從上往下切，不能向莖尖方向偏切，如果偏切太 深，切口太靠近莖尖，吸芽就不能用了。如果吸芽呈彎曲狀，要把吸芽平放，側向切去內彎部 分球莖，然後用手小心撕去葉鞘。③需要檢測花葉心腐病的香蕉品種，切好的吸芽要做好分組。2)、吸芽莖尖無菌接種。首先用幹布(或報紙)抹乾切後吸芽球莖部分滲出的汁液，以防在接種操作時滑 手，如果切好的吸芽比較髒，可用75%的酒精擦拭乾淨。第二，葉鞘環割。待接種刀具消毒徹底後，吸芽莖尖無菌接種就可開始。用左手握 住吸芽圓柱體球莖部分(如果吸芽較小，也可用左手拇指、食指和中指抓住)，露出部分球 莖，以手術刀刀尖從假莖最外層葉鞘包口處下刀，沿著葉鞘與球莖交界線逆時針環割，環割 時左手拇指及食指要配合地將吸芽圓柱體順時針轉動，讓刀尖劃一圈。環割時要注意用刀 力度，視葉鞘厚薄及時調整用力輕重，原則是刀尖既不接觸內層葉鞘，又能剛好使環割後的 葉鞘容易剝離。而且越靠近莖尖葉鞘越薄，環割力度也要越輕。這需要稍加練習即可做到。第三，葉鞘剝離。剝離葉鞘時，右手拇指、食指和中指抓住假莖部分，從環割後的葉 鞘包口開始，順時針方向擰假莖，使整層葉鞘沿著切口擰離球莖後，用力將脫離球莖的葉鞘 拉開，露出裡面一層葉鞘，然後依次剝離下一層葉鞘。這一步操作中需要注意①當右手擰假莖時不能用力過猛，以防將整個假莖部分 擰斷。②應該先將葉鞘外面邊緣擰開一個口子，然後順著這個口子擰，直到將整層葉鞘擰離 球莖。③如果環割時有些地方劃得太淺，葉鞘就不容易擰離球莖。④如果不小心將全部假 莖擰斷了，操作就會變得複雜繁瑣。這是需要在環割後，換大號手術刀(如23號刀)小心 挑開葉鞘，挑葉鞘時刀尖不能觸及裡面葉鞘，更不能碰到外面球莖，如果到外面球莖，必須 更換消毒過的手術刀接著操作。⑤需要剝離葉鞘層數的多少，要根據吸芽大小及預處理時 切除葉鞘多少而定。如果切除的葉鞘越多，切得越靠近莖尖，則需要剝離的葉鞘層數可相對 少些，一般需要剝離大約3 5層葉鞘即可。⑥每剝離一層葉鞘後，重新換消毒過的刀。第四，吸芽莖尖挑取和接種。經過剝離層層葉鞘後，剩下直徑大約0. 4 0. 8釐米的莖尖(視吸芽大小而定)。用消毒好的手術刀切去所述假莖，留0.3-0. 7cm長，然後以 刀尖在最後剝離葉鞘內側、莖尖邊緣的地方，斜向逆時針插刀一圈，最後以刀尖將莖尖挑出 來，接種到誘導培養基上進行誘導培養。誘導培養基以MS培養基為基本培養基，添加6-苄 氨基嘌呤(6-BA)至其終濃度為4 5mg/L，添加萘乙酸(NAA)至其終濃度為0. 05mg/L，添 加白糖至其終濃度為35g/L。這一步需要注意①插刀時不應插太深，約插進5毫米深即可。②插刀方向應該和 圓柱體中軸線呈40 45°角，不能順著圓柱體中軸線插刀。③挑取莖尖時用力不能太大， 要把全部的球莖組織插離後，輕輕將莖尖挑出。如果用力太大，很容易將莖尖弄掉到臺面 上，結果前功盡棄。④挑出的莖尖必須帶有球莖組織，否則莖尖就會失去根基，不能成功培養。香蕉莖尖是由許多層葉鞘緊密包圍住，層層疊疊的葉鞘可把莖尖與外界完全隔離 開來，從而起到保護莖尖的作用。從最外層的葉鞘向內層葉鞘，其受雜菌汙染的程度越來越 低，莖尖及附近幾層葉鞘是不受雜菌汙染的。採用本發明的方法能直接挑取出葉鞘內的莖 尖，不需要經過表面消毒就可獲得無菌莖尖了。與現有技術相比，本發明的方法主要有以下優點(一)不使用消毒劑，不汙染環 境。傳統接種方法採用的消毒劑是0. 的升汞溶液，具有劇毒，用後的廢棄液會對水源等 環境造成汙染。而採用新的接種方法不採用任何消毒劑，不會對環境產生任何不良影響，而 且莖尖接種後不會因為消毒劑沒衝洗乾淨而生長受到影響。(二)操作簡單，易學易用。該 方法不用準備消毒器皿、無菌水和消毒劑等，不需要經過繁瑣的切割過程，不用記消毒時間 等等在傳統接種方法時需要做的事情，在這裡你只要把手術刀消毒好就可開始接種，且沿 著假莖與球莖交界處，層層環剝，十分容易。(三)快速高效。新接種方法操作起來十分簡 便快捷，一般熟練人員大約7 8刀就可接種一個吸芽，一天可接種香蕉吸芽100個左右。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下面舉例說明具體實施步驟1材料與用具1. 1材料預處理將選取回來的巴西蕉(香蕉品種)吸芽先切留假莖10 15釐米 長，然後從切口往球莖方向垂直下切，把外層葉鞘連球莖組織一起切除。最後切成假莖、球 莖部分各長6 10釐米，底部直徑為2 3釐米的圓柱體。1. 2用具3把11號手術刀和1把23號手術刀，1臺300°C電熱消毒器(也可用酒 精燈)。2操作步驟2. 1葉鞘環割左手抓住吸芽圓柱體，右手拿手術刀。以消毒過的手術刀刀尖從葉鞘 包口處開始下刀，沿著外層葉鞘與球莖交界線逆時針輕劃一圈至起刀的位置。2. 2葉鞘剝離右手抓住假莖部分，向順時針方向擰葉鞘，先擰起葉鞘外邊緣，然後 把整層葉鞘逐步擰離球莖。當葉鞘完全與球莖脫離後，右手用力將脫離的葉鞘拉開，或者將 葉鞘一片一片地撕開。按上述方法依次剝離其他葉鞘(約3 5層)。
2. 3莖尖挑取用消毒過的手術刀切去假莖，僅留約0. 5cm長，然後以刀尖在最後剝 離的葉鞘內側、莖尖邊緣的地方，與莖尖成45°夾角逆時針插刀一圈，輕輕地將帶有部分球 莖組織的莖尖挑離球莖。 2. 4莖尖接種將莖尖接種到添加有6-苄氨基嘌呤(6-BA) 4 5mg/L、萘乙酸 (NAA)O. 05mg/L、白糖35g/L的MS誘導培養基，接種深度以剛好插入球莖組織為宜。2. 5莖尖轉接培養20 25天後，將莖尖切口處形成的愈傷組織切去，然後將莖尖 切成4等份，接種在上述誘導培養基上。3接種結果 莖尖接種10天後觀察，平均成功率在85%以上，莖尖開始膨大。再轉接1次培養 20天後開始誘導出叢生芽。
權利要求
一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，所述方法為挑取無菌的莖尖接種到誘導培養基中進行誘導培養，其特徵在於，所述無菌的莖尖是通過無菌剝離葉鞘操作而獲得的。
2.根據權利要求1所述的一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述無菌剝離 葉鞘操作是用經高溫消毒的手術刀將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界處層層環割，直至全 部包住的葉鞘都剝離開。
3.根據權利要求2所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述無菌剝離葉鞘 操作包括如下步驟1)香蕉吸芽預處理用經高溫消毒的手術刀切去香蕉吸芽的球莖和假莖外層，處理後 的吸芽為圓柱體；2)葉鞘環割；3)葉鞘剝離；4)吸芽莖尖挑取；以上操作都在超淨工作檯上進行。
4.根據權利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述步驟2操作如 下握住所述吸芽圓柱體球莖部分，露出所述葉鞘及所述球莖交界位置，以刀尖從葉鞘包口 處下刀，沿著所述葉鞘與所述球莖交界線逆時針環割。
5.根據權利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述步驟3操作如 下抓住所述假莖部分，向順時針方向擰所述假莖，先擰起所述葉鞘外邊緣，然後把整層葉 鞘擰離球莖；當所述葉鞘完全與所述球莖脫離後，用力將脫離的葉鞘拉開，或者將葉鞘一片 一片地撕開；按上述方法依次剝離其他葉鞘，每剝離一層葉鞘需要重新換消毒過的手術刀。
6.根據權利要求3所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述步驟4操作如 下用消毒過的手術刀切去所述假莖，留0. 3-0. 7cm長，然後以刀尖在最後剝離的葉鞘內 側、莖尖邊緣的地方，逆時針插刀一圈，將帶有部分球莖組織的莖尖挑離球莖。
7.根據權利要求1所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述誘導培養包括 如下步驟1)莖尖接種；2)莖尖轉接；以上步驟都在都在超淨工作檯進行。
8.根據權利要求7所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述步驟1為將莖尖 接種到所述誘導培養基上，接種深度以剛好插入球莖組織為宜；所述誘導培養基以MS培養 基為基本培養基，添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)4 5mg/L、萘乙酸(NAA)O. 05mg/L、白糖35g/ L0
9.根據權利要求8所述的香蕉吸芽莖尖接種的方法，其特徵在於，所述步驟2為培養 20 25天後，將莖尖切口處形成的愈傷組織切去，然後將莖尖縱切成4等份，接種在所述誘導培養基中。
全文摘要
本發明提供了一種香蕉吸芽莖尖接種的方法，該方法為將香蕉吸芽預處理，切成吸芽圓柱體後，用經高溫消毒的手術刀將香蕉吸芽葉鞘沿著其與球莖交界處環割，依次層層環剝，直至把全部包住的葉鞘都剝離開，便可輕易挑取無菌的莖尖接種到添加有6-BA 4～5mg/L、NAA 0.05mg/L、白糖35g/L的MS誘導培養基中進行誘導培養。本方法克服了傳統方法中需要使用消毒劑，材料預處理過程繁瑣、效率不高等缺陷，達到簡便易行、高效、環保的效果。
文檔編號A01H4/00GK101869076SQ20101021842
公開日2010年10月27日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者湯亞飛, 蘇海, 蔡時可, 謝梅新 申請人:廣東省農業科學院作物研究所