附睪蛋白酶抑制蛋白b細胞表位及包含此表位的抗原肽的製作方法
2023-06-28 13:07:11
專利名稱：附睪蛋白酶抑制蛋白b細胞表位及包含此表位的抗原肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位及包 含此表位的抗原肽。
背景技術：
計劃生育是我國的基本國策，為有效地控制人口過度增長，開發高效、安 全、可逆的避孕方法一直是計劃生育研究的重要課題。目前，男性避孕還局限 於傳統的使用保險套或輸精管結紮手術，前者失敗率較高，後者具有不可逆性， 且可能產生意料不到的嚴重免疫學後果，如持續高水平的抗精子抗體滴度和/或 睪丸形態學的改變等，二者均不能令人滿意。多年來，國內外科學家一直致力 於男性避孕疫苗的研製，主要是以生殖相關激素和精子特異性蛋白為靶抗原， 如精子膜抗原PH-20、受精抗原FA-1、頂體抗原SP-IO、受精素P等，已研製出 的多價疫苗可明顯抑制動物的精卵結合與融合，但避孕率仍停留在50%左右。
附睪是精子獲能和成熟的場所，附睪蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor, E卯in )作為一種附睪特異表達的分泌蛋白，在保持精子活性以及 精卵結合過程中均發揮重要作用。最新研究表明，用重組Eppin免疫的雄性獼猴 出現可逆性的不育(避孕率7/9,可逆率5/7),精液分析發現精子的前向運動能 力減弱，而精子的數量及體內雄激素水平不受影響，亦未見自身免疫性疾病的 發生，表明Eppin可作為潛在的有效的男性避孕疫苗。生育研究結果提示，抗 E卯in抗體可能結合於精子表面，潛在地破壞了精子在男性生殖道內和射精後精 子最初儲存在女性陰道內的生存微環境，影響了精子的獲能，幹擾了精子受孕 前的一些基本步驟，造成免疫性不育。
蛋白質抗原通過表位體現其免疫特異性。就某一蛋白質抗原而言，它不僅
含有B細胞表位、T輔助細胞(Th)表位、細胞毒性T細胞(CTL)表位、自然 殺傷細胞(NK)表位、主要組織相容性複合物(MHC)限制位等與免疫識別密切 相關的結構，同時還含有毒性表位、抑制性表位、交叉反應性表位等不良表位， 這些不良表位可引起免疫偏移、免疫顛覆等不利的免疫反應而導致免疫耐受。 因此，為了提高蛋白質抗原的保護性，須在表位水平上做出選擇，摒除後者， 保留或改善前者以得到更理想的疫苗分子。
發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供Eppin的B細胞表位，具有SEQ ID No. 1所示胺基酸序列。
本發明的目的之二在於提供包含所述E卯in的B細胞表位的抗原肽，由T 輔助細胞表位與E卯in的B細胞表位串聯而成；所述T細胞表位具有SEQ ID No. 2 所示胺基酸序列。
進一步，T輔助細胞表位通過柔性接頭與E卯in的B細胞表位串聯； 進一步，所述柔性接頭選自由GGG、 GGS或KK組成的短肽。 本發明的目的之三在於提供包含免疫學有效量的所述包含Eppin的B細胞表 位的抗原肽的組合物。
進一步，還包含藥學上可接受的載體；
進一步，所述免疫學有效量為每劑每千克體重2-5毫克。
本發明的目的之四在於提供能夠與所述Eppin的B細胞表位特異性結合的抗
體
本發明的目的之五在於提供能夠與所述包含Eppin的B細胞表位的抗原肽特 異性結合的抗體。
本發明的目的之六在於提供所述包含Eppin的B細胞表位的抗原肽在製備男 性避孕疫苗中的應用。
本發明的有益效果在於本發明公開了Eppin的優勢B細胞表位，具有SEQ ID No.l所示胺基酸序列，其成分單一、結構簡單、擺脫了天然蛋白抗原中不良表
位的影響，引發的免疫反應針對性強；本發明還公開了包含此優勢B細胞表位的 抗原肽，由麻滲病毒融合蛋白的T輔助細胞表位與此優勢B細胞表位串聯而成； 此抗原肽中的T輔助細胞表位能刺激機體產生CD4十T細胞，從而輔助B細胞活化， 使其分泌高滴度的特異地靶向所述優勢B細胞表位的抗體，誘導高效、安全、可 逆的抗生育作用，可用於製備男性避孕疫苗，為男性避孕的臨床主動免疫治療 提供新的手段，具有重要的理論價值和廣闊的應用前景，能夠產生重大的社會 效益和經濟效益。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發 明作進一步的詳細描述，其中
圖1為本發明抗原肽的HPLC鑑定圖； 圖2為本發明抗原肽的MS鑑定圖3為本發明抗原肽免疫雄鼠血清中特異性抗體生成情況； 圖4為本發明抗原肽免疫雄鼠血清與人精子蛋白提取液的ELISA反應結果； 圖5為本發明抗原肽首次免疫雄鼠後第5周雌雄小鼠合籠實驗中雌鼠的產 仔情況；
圖6為本發明抗原肽首次免疫雄鼠後第26周雌雄小鼠合籠實驗中雌鼠的產 仔情況。
具體實施例方式
發明人採用生物信息學方法，以單參數(親水性、可及性、柔韌性及抗原 性)預測為基礎，結合二級結構預測，從385個候選表位中篩選出多個Eppin的 優勢B細胞表位，並以其中一個優勢B細胞表位(SEQ ID No. 1)為基礎，引入一 個T輔助細胞表位，構建了抗原肽。
B細胞表位成份單一，結構簡單，擺脫了抗原蛋白中不良表位的影響，引發
的免疫反應針對性強，但當B細胞表位是自身抗原時，其存在免疫原性低的缺陷。 以往多是用B細胞表位交聯外來載體蛋白(以提供和B細胞表位連接的新T輔助細 胞表位)的方法來刺激T輔助細胞，以提高其免疫原性。但是， 一些問題伴隨著 載體蛋白的使用而產生，即(1) B細胞表位與載體蛋白的化學偶聯可能會造 成目的決定簇的改變並且隨機的反應會導致製品在大小和組成方面不均一；(2) 載體蛋白也許會導致不想要的免疫反應；(3 ) B細胞表位-載體蛋白綴合物可能 會激發不相關的免疫反應，錯誤地針對載體蛋白而非B細胞表位。為了避免這些 問題，T輔助細胞表位被用於替換載體蛋白來引發T輔助細胞反應。T輔助細胞表 位可以與B細胞表位串聯形成抗原肽。在本發明中，T輔助細胞表位選擇麻滲病 毒融合蛋白第288-302位胺基酸序列(SEQ ID No. 2 ),此T輔助細胞表位能刺激 機體產生CD4 + T細胞，從而輔助B細胞活化，使其分泌特異於Eppin的B細胞表位 的抗體。
在本發明中，T輔助細胞表位與B細胞表位串聯形成抗原肽，可以是T輔助 細胞表位的羧基(C-)端與B細胞表位的氨基(N-)端連接；也可以是T輔助 細胞表位的N-端與B細胞表位的C-端連接。本領域技術人員應該理解，連接順 序通常不會改變該胺基酸序列的抗原特異性。T輔助細胞表位與B細胞表位之間 通過柔性接頭連接，柔性接頭通常選自由GGG、 GGS或KK組成的短肽。柔性接 頭在物理上將T輔助細胞表位與B細胞表位分隔開來，使得B細胞表位與B細 胞受體、T輔助細胞表位與T細胞受體可以更好地實現結合，不受空間位阻的影 響；柔性接頭還可以打斷由T輔助細胞表位和B細胞表位串聯形成的人為二級 結構，並由此消除對T輔助細胞或B細胞反應可能照成的幹擾；此外，柔性接 頭還利於使抗原肽經蛋白酶降解後形成兩個完整表位，即T輔助細胞表位和B 細胞表位。
本發明還涉及包含免疫學有效量的所述抗原肽的組合物。本發明抗原肽的 免疫學有效量通常為每劑每千克體重2-5毫克，這一劑量可以分成多次施用；但 正如免疫和治療領域所熟知的，給藥劑量可以根據患者的年齡、健康狀況和個
體反應等進一步調整；安全有效量的抗原肽可以和藥學上可接受的載體如弗氏 完全佐劑、弗氏不完全佐劑等製成疫苗等藥物形式；本領域普通技術人員可以 4艮容易地確定藥物劑型，包括速釋或/和緩釋製劑；所得藥物製劑可以通過任何 一種便利的途徑施用，包括皮下的、口服的、肌內的、腹膜內的，或其他腸胃 外的或腸道的途徑。
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
實施例一
本實施例抗原肽由T輔助細胞表位的C-端與E卯in的B細胞表位的N-端通 過柔性接頭-GGG-連接而成，其^&酸序列為LSEIKGVIV服LEGVGGGCQGNNNNFQSKA N。
本實施例抗原肽的合成在固相多肽合成儀(ABI 431A型)上完成。採用標 準藥曱氧羰基(Fmoc)方案，起始選用0. 0125mmo1的聚苯乙稀(polystyrene, PS)樹脂(美國ABI公司)，按照設計的胺基酸序列使肽鏈從C-端逐個向N-端 延伸；各種Fmoc胺基酸用量為0. l隱ol;每步縮合前用1-羥基苯並三唑(H0Bt) /N,N'-二環己基碳二亞胺(Dec)活化Fmoc胺基酸的羧基，縮合後用含有體積 百分濃度為20 %的六氬吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP )溶液去除Fmoc保護基； 肽鏈合成後，將含樹脂的肽鏈加至處於水浴條件下的裂解液[由結晶苯盼0. 75g、 酒石酸乙二胺(EDT)O. 25mL、苯石危基曱烷(Thionaisole)0. 5mL、去離子水0. 5mL、 三氟乙酸10mL組成]中，於室溫、攪拌條件下反應4. 5小時，將肽鏈從樹脂上 裂解下來，同時去除多種保護基團；將反應後的混合液經玻璃濾器過濾以濾掉 樹脂及保護基團，並用三氟乙酸洗滌濾渣、反應瓶和濾器，濾液於常溫下低壓 蒸發至1-2mL，加乙醚50mL使多肽沉澱後，再經玻璃濾器過濾，收集沉澱，冷 凍乾燥，即得抗原肽。所得抗原肽通過高效液相色語(HPLC)法和質譜(MS) 法進行鑑定，HPLC鑑定圖如圖1所示，所得抗原肽的純度為85%; MS鑑定圖如 圖2所示，證實所得抗原肽為目標多肽。實施例二
本實施例抗原肽由Eppin的B細胞表位的C-端與T輔助細胞表位的N-端通 過柔性接頭-GGS-連接而成，其M酸序列為CQGNNNNFQSKANGGSLSEIKGVIVHRLEGV。
本實施例抗原肽的合成在固相多肽合成儀(ABI 431A型)上完成。採用標 準Fmoc方案，合成方法與實施例一所述方法相同。
實施例三
本實施例抗原肽由T輔助細胞表位的C-端與Eppin的B細胞表位的N-端通 過柔性接頭-KK-連接而成，其M酸序列為LSEIKGVIVHRLEGVKKCQGNNNNFQSKAN。
本實施例抗原肽的合成在固相多肽合成儀(ABI 431A型)上完成。採用標 準Fmoc方案，合成方法與實施例一所述方法相同。
本發明抗原肽的鑑定
方法(1 )實驗動物分組將40隻體重為18-20 g的清潔級6-8周齡雄性Balb/c 小鼠(北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供)隨機分成4組實驗組(本發明 抗原肽)、PBS對照組(以磷酸鹽緩衝液PBS替代抗原肽)、無關肽對照組(以 胺基酸序列為LSEIKGVIVHRLEGVGGG的多肽替代抗原肽)和空白對照組(以超純 水替代抗原肽)，每組10隻；
(2) 免疫方案首次免疫，將純化的原核表達的重組Eppin蛋白與弗氏完 全佐劑等體積混合，充分乳化，製得免疫原，於小鼠腹股溝皮下組織部位注射， 每隻50-80嗎；間隔1周，加強免疫，將本發明抗原肽與弗氏不完全佐劑等體積 混合，充分乳化，製得免疫原，於小鼠腹股溝皮下組織部位注射，每隻50 fig; 再間隔2周，以同樣方法重複加強免疫l次；
(3) 免疫原性檢測一首次免疫前後，每間隔一定時間，行小鼠尾靜脈採 血，分離血清，置溫度-2(TC保存，待測；採用間接酶聯免疫吸附(ELISA)法
測定免疫雄鼠血清中特異性抗體的滴度將抗原肽用包浮皮稀釋液(即濃度為O. 05 mol/L、 pH值為9. 6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)稀釋，製成濃度為IO )tig/mL的包 被液；將包被液加至96孔反應板中，每孔IOO ^L，置溫度37。C包被4小時，棄去 包被液，以洗滌液(在IOOO mL PBS中力口入O. 5 mL Tween-20和0. 1 g硫柳汞， 調節pH值至7.4,即得)洗滌3次，再加入用PBS稀釋至體積百分濃度為5y。的小牛 血清(Hyclone公司)封閉液，每孔IOO pL，置溫度37。C封閉^分鐘，棄去封閉 液，以洗滌液洗滌3次，再加入按10倍連續稀釋的免疫後小鼠血清，每孔100^L, 置溫度37。C孵育1小時，以洗滌液洗滌3次，再加入辣才艮過氧化物酶(服P)標記 的羊抗小鼠IgG (稀釋度為l : 5000, Nordic公司)，每孔IOO jiL，置溫度37。C 孵育40分鐘，以洗滌液洗滌3次，加入鄰苯二胺-過氧4匕氫(OPD-H202 )底物液， 每孔IOO ^L，置溫度37。C避光顯色40分鐘，終止反應，測量492 nm波長處的光 密度(OD),以正常小鼠血清作陰性對照，結果以雙復孔OD值均值表示，待測 孔0D值大於或等於陰性對照2. l倍者判為陽性，以判為陽性的最高稀釋倍數為抗 體滴度。
(4)免疫原性檢測二首次免疫後第5周，小鼠尾靜脈採血，分離血清， 置溫度-2(TC保存，待測；取健康男性新鮮精液，用Pereoll單層法去除圓細胞 和精漿，再用PBS洗滌2次後，參照文獻方法(黃宇峰，許瑞吉.男性診斷學.上 海第二軍醫大學出版社，1999.)，用裂解液(含有濃度為O. 5mol/L的Tris-HCl、 濃度為O. 28 mol/L的2-巰基乙醇、濃度為5 mol/L的鹽酸胍)裂解精子，提取的 蛋白質用三氯乙酸/丙酮法沉澱後冷凍乾燥，再以裂解緩沖液(含有濃度為8 mol/L的尿素,質量百分濃度為4。/。的CHAPS，濃度為40 nmol/L的Tris)溶解,即 得人精子蛋白提取液，測定總蛋白質濃度，置溫度-2(TC保存，待用；採用間接 ELISA法檢測免疫後雄鼠血清與人精子蛋白提取液的反應情況，具體步驟參照 "(3)免疫原性檢測一，，所述方法以人精子蛋白提取液為包^皮抗原，以免疫 後雄鼠血清為一抗，以HRP標記的羊抗小鼠IgG為二抗；同時設陽性對照組I [以 抗Eppin多克隆抗體(Santa Cruz乂^司)為一抗]、陽性對照組II (以純化的重
組Eppin蛋白免疫雄鼠血清為一抗)和陰性對照組(以PBS為一抗)；測量492認 波長處的OD值，結果以雙復孔OD值均值表示，待測孔OD值大於或等於陰性對照 2. l倍者判為陽性。
(5)抗生育能力檢測首次免疫後第5周，按雌雄比例l : 2行雌雄小鼠合 籠實驗，記錄雌鼠產仔情況；首次免疫後第26周，再次按雌雄比例l : 2行雌雄 小鼠合籠實驗，記錄雌鼠產仔情況。
結果(1 )免疫雄性Balb/c小鼠血清中特異性抗體生成情況如圖3所示， 首次免疫後第l周，實驗組雄鼠血清中即有特異性抗體產生，之後抗體滴度逐漸 升高，於首次免疫後第5周達到最高值(40萬)，抗體滴度可一直維持在此水平 至首次免疫後第20周，之後抗體滴度逐漸下降，於首次免疫後第26周降至5000 以下；PBS對照組、無關肽對照組和空白對照組小鼠血清中無特異性抗體產生。
(2 )免疫雄鼠血清與人精子蛋白提取液的ELISA反應結果如圖4所示，實 驗組反應結果呈陽性，顯示採用本發明抗原肽免疫的雄性小鼠血清中含有特異 性抗體，可以與人精液中的抗原蛋白E卯in結合。
(3)在首次免疫後第5周進行的雌雄小鼠合籠實驗中，雌鼠產仔情況如圖5 所示，實驗組免疫雄鼠的生殖力受到抑制，雌鼠產仔率與PBS對照組、無關肽對 照組和空白對照組比較，均有顯著性差異(P<0. 05);
首次免疫後第26周，測得實驗組免疫雄鼠血清中的特異性抗體滴度低於 5000,此時雌雄小鼠合籠實驗中雌鼠產仔情況如圖6所示，實驗組免疫雄鼠的生 殖力得到恢復，雌鼠產仔率與PBS對照組、無關肽對照組和空白對照組比較，均 無顯著性差異(P〉Q. 05)。
結論本發明抗原肽可以誘導高滴度的特異地靶向Eppin優勢B細胞表位的 抗體，並產生高效、安全、可逆的抗生育作用，可用於製備男性避孕疫苗。
最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管 通過參照本發明的某些優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通 技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏
離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍
<110〉中國人民解;^文軍第三軍醫大學
<120〉 附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位及包含此表位的抗原肽
2
1
<211〉 13
PRT
<213〉 智人(H畫n )
1
Cys Gin Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gin Ser Lys Ala Asn 1 5 10
2 15 <212〉 PRT
麻滲病毒(morbillivirus ) <400〉 2
Leu Ser Glu lie Lys Gly Val lie Val His Arg Leu Glu Gly Val 15 10 1權利要求
1、附睪蛋白酶抑制蛋白的B細胞表位，具有SEQ ID No.1所示胺基酸序列。
2、 包含權利要求l所述的附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽，其特 徵在於由T輔助細胞表位與附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位串聯而成；所述T 細胞表位具有SEQ ID No. 2所示胺基酸序列。
3、 根據權利要求2所述的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽， 其特徵在於T輔助細胞表位通過柔性接頭與附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位串 聯。
4、 根據權利要求3所述的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽，其 特徵在於所述柔性接頭選自由GGG、 GGS或KK組成的短肽。
5、 包含免疫學有效量的權利要求2所述的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表 位的抗原肽的組合物。
6、 根據權利要求5所述的組合物，其特徵在於還包含藥學上可接受的載體。
7、 根據權利要求5所述的組合物，其特徵在於所述免疫學有效量為每劑 每千克體重2-5毫克。
8、 能夠與權利要求1所述的附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位特異性結合的抗體。
9、 能夠與權利要求2所述的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽特 異性結合的抗體。
10、 權利要求2所述的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽在製備 男性避孕疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位及包含此表位的抗原肽；本發明的附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位，具有SEQ ID No.1所示胺基酸序列，其成分單一、結構簡單、擺脫了天然蛋白抗原中不良表位的影響，引發的免疫反應針對性強；本發明的包含附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗原肽，由T輔助細胞表位與附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位串聯而成，T細胞表位具有SEQ ID No.2所示胺基酸序列；此抗原肽可以誘導高滴度的特異地靶向附睪蛋白酶抑制蛋白B細胞表位的抗體，並產生高效、安全、可逆的抗生育作用，可用於製備男性避孕疫苗，具有重要的理論價值和廣闊的應用前景，能夠產生重大的社會效益和經濟效益。
文檔編號C07K16/38GK101362795SQ20081007028
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月11日 優先權日2008年9月11日
發明者畏 何, 吳玉章, 李晉濤, 梁志清, 萍 閻, 陳正瓊 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學