α-澱粉酶突變體的製作方法

2023-06-29 03:34:21 2

專利名稱：α-澱粉酶突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及親本類透阿米爾(Termamyl-like)α-澱粉酶的變體(突變體)，其在中溫和/或高pH下的活性更高。
背景技術：
α-澱粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)構成這樣一組酶，它們催化澱粉和其他線性及分枝1，4-葡萄糖苷寡-糖和多糖的水解。
有大量專利和科學文獻涉及這類工業上非常重要的酶。從例如WO90/11352，WO95/10603，WO95/26397，WO96/23873和WO96/23874可以知道許多α-澱粉酶，比如類透阿米爾α-澱粉酶變體。
在更近期的涉及α-澱粉酶的公開文獻中，WO96/23874提供了一種類透阿米爾α-澱粉酶的三維，X-射線晶體結構數據，該酶含有解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(BANTM)的300個氨基端胺基酸殘基以及含有所述胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶的羧基端301-483位胺基酸(後者以透阿米爾TM的商品名出售)，因此該酶與工業上很重要的芽孢桿菌α-澱粉酶(其在本文中包含在術語「類透阿米爾α-澱粉酶」中，該術語特別包括地衣形芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌(BANTM)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(BSGTM)α-澱粉酶)有密切的關係。WO96/23874還描述了在分析親本類透阿米爾α-澱粉酶之結構的基礎上，設計相對親本改變了性質的親本類透阿米爾α-澱粉酶之變體的方法。
發明簡述本發明涉及新的類透阿米爾α-澱粉酶的α-澱粉分解酶變體(突變體)，該變體在高pH和中溫的洗滌能力(相對親本α-澱粉酶)提高。
在本發明文中術語「中溫」意指10℃到60℃，優選20℃到50℃，特別是30℃到40℃。
術語「高pH」意指目前用於洗滌的鹼性pH，更具體說是大約pH8到10.5。
在本發明文中，「低溫α-澱粉酶」意指一種在0-30℃的溫度範圍內具有相對最佳活性的α-澱粉酶。
在本發明文中，「中溫α-澱粉酶」意指一種在30℃-60℃的溫度範圍內具有最佳活性的α-澱粉酶。比如，SP690和SP722α-澱粉酶分別是「中溫α-澱粉酶」。
在本發明文中，「高溫α-澱粉酶」意指一種在60℃-110℃的溫度範圍內具有最佳活性的α-澱粉酶。比如，透阿米爾是一種「高溫α-澱粉酶」。
本發明的變體可以實現這些特性的改變類透阿米爾α-澱粉酶在pH8到10.5的穩定性；和/或在pH8到10.5對Ca2+的穩定性；和/或在10℃-60℃，優選20℃-50℃，特別是30℃-40℃的特異活性。
應當注意的是，相對最適溫度通常取決於所用的特定pH。換句話說，在例如pH8確定的相對最適溫度可能與例如pH10確定的相對最適溫度非常不同。
溫度對酶活性的影響活性部位及其周圍的動力學取決於溫度和胺基酸組成，並且對一種酶的相對最適溫度有重要意義。通過比較中溫和高溫α-澱粉酶的動力學，可以確定出高溫α-澱粉酶在中等溫度下的功能關鍵區域。圖2顯示了SP722α-澱粉酶(SEQ ID NO2)和地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶(以Termanyl購自Novo Nodisk)(SEQ ID NO4)。
圖中顯示，在中溫範圍(30-60℃)，SP722絕對活性的相對最適溫度比同源的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶高，後者在60-100℃左右具有最佳活性。這些分布圖主要取決於活性部位殘基及其周圍的溫度穩定性和動力學。另外，活性分布圖取決於所用pH和活性部位殘基的pKa。
本發明更具體地涉及1.一種親本類透阿米爾α-澱粉酶的變體，該變體具有α-澱粉酶活性，所述變體包含1或多個突變，其對應於下列SEQ ID NO2所示胺基酸序列中的突變T141，K142，F143，D144，F145，P146，G147，R148，G149，Q174，R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，S193，N195，H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F173，F267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，K311，E346，K385，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463。
2.項1的變體，所述變體有1或多個下列取代或缺失
T141A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；K142A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；F143A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F145A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G147A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R148A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G149A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；S193A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
L275A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；E346A，D，R，N，C，Q，G，H，I，K，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；K385A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；G456A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N457A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G460A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V.
3.項2的變體，其中所述變體有1或多個下列取代或缺失K142R；S193P；N195F；K269R，Q；N270Y，R，D；K311R；E346Q；K385R；K458R；P459T；T461P；Q174*；R181Q，N，S；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V，R；W189T，S，N，Q.
4.項1-3的變體，其中所述變體在D183+G184位點缺失，還有1或多個下列取代或缺失K142R；S193P；N195F；K269R，Q；N270Y，R，D；K311R；E346Q；K385R；K458R；P459T；T461P；Q174*；R181Q，N，S；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V，R；W189T，S，N，Q。
5.項1-4任何一項的變體，其中相對親本α-澱粉酶所述變體至少下列性能之一發生改變i)在pH8到10.5的pH穩定性提高；和/或ii)在pH8到10.5的Ca2+穩定性提高，和/或iii)在溫度為10到60℃，優選20-50℃，特別是30-40℃特異活性增強。
6.項1-5任何一項的變體，在pH8到10.5穩定性提高，具有1或多個對應下列位點(使用SEQ ID NO2的編號)的位點的突變T141，K142，F143，D144，F145，P146，G147，R148，G149，R181，A186，S193，N195，K269，N270，K311，K458，P459，T461。
7.項6的變體，該變體具有1或多個下列取代T141A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；K142A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；F143A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
F145A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G147A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R148A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G149A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K181A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，P，K，M，F，S，T，W，Y，V；S193A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；N195A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K269A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V.
8.項7的變體，該變體具有1或多個下列取代K142R，R181S，A186T，S193P，N195F，K269R，N270Y，K311R，K458R，P459T和T461P。
9.項1-5的變體，在pH8到10.5對Ca2+的穩定性提高，具有1或多個對應下列位點(使用SEQ ID NO2的編號)的突變R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，N195，N270，E346，K385，K458，P459。
10.項9的變體，該變體具有1或多個下列取代或缺失R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A， R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；E346A， R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K385A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V.
11.項10的變體，其中所述變體具有1或多個下列取代或缺失R181Q，N；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G H，I，L，M，N，F，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V；W189T，S，N，Q；N195F；N270R，D；E346Q；K385R；K458R；P459T。
12.項1-11的變體，其中所述親本類透阿米爾α-澱粉酶選自具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶；具有SEQ ID NO5所示序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶；具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶。
13.項1-5的變體，在10-60℃，優選20-50℃，特別是30-40℃的溫度範圍內特異活性提高，在1或多個下列位點(使用SEQ ID NO2的編號)具有突變H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F173，Q174，D183，G184，N195，F267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463。
14.項13的變體，該變體含有1或多個下列取代H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；G184*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；L275A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G456A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N457A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；
G460A，D，R，N，C，E，Q，H，L，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V.
15.項14的變體，其中所述變體含有1或多個下列取代或缺失Q174*，D183*，G184*，N195F，K269S。
16.項13-15的變體，其中所述親本類透阿米爾α-澱粉酶是具有SEQID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶。
17.一種DNA構建體，它含有編碼項1-16任何一項所述α-澱粉酶變體的DNA序列。
18.一種攜帶項17所述DNA構建體的重組表達載體。
19.一種用項17所述DNA構建體或項18所述載體進行轉化的細胞。
20.項19的細胞，它是一種微生物細胞。
21.項20的細胞，它是細菌或真菌。
22.項21的細胞，它是革蘭氏陽性細菌，比如枯草芽孢桿菌，地衣形芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，或蘇雲金芽孢桿菌。
23.項1-16任何一項所述α-澱粉酶變體用於洗滌和/或清洗餐具的用途。
24.含有項1-16任何一項所述α-澱粉酶變體的洗滌劑添加劑，任選該添加劑是非dusting顆粒，穩定化的液體或被保護的酶。
25.項24的洗滌劑添加劑，它含有0.02-200mg酶蛋白/g添加劑。
26.項24或25的洗滌劑添加劑，它還含有另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，另一種澱粉水解酶和/或纖維素酶。
27.一種包含項1-16任何一項所述α-澱粉酶變體的洗滌劑組合物。
28.項27的洗滌劑組合物，它另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，另一種澱粉水解酶和/或纖維素酶。
29.一種手洗或自動餐具洗滌劑組合物，該組合物包含項1-16任何一項所述的α-澱粉酶變體。
30.項29的清洗餐具的洗滌劑組合物，該組合物另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，另一種澱粉水解酶和/或纖維素酶。
31.一種手洗或自動的衣物洗滌組合物，該組合物包含項1-16任何一項所述的α-澱粉酶變體。
32.項31的衣物洗滌組合物，該組合物另外包含另一種酶，比如蛋白酶，脂酶，過氧化物酶，澱粉水解酶和/或纖維素酶。
33.製備α-澱粉酶的方法，該α-澱粉酶具有1)改變了的pH最佳值，和/或2)改變了的溫度最佳值，和/或3)穩定性提高，所述方法包括以下步驟i)將兩個或多個pH，溫度和/或穩定性曲線迥異的α-澱粉酶的3D結構之分子動力學進行比較，從而確定(a)α-澱粉酶突變的目標位點和/或區域；ii)在所確定的位點和/或區域進行1或多個胺基酸的取代，添加和/或缺失。
34.項33的方法，其中將一種中溫α-澱粉酶與一種高溫α-澱粉酶進行比較。
35.項33的方法，其中將一種低溫α-澱粉酶與一種中溫或高溫α-澱粉酶進行比較。
36.項33-35的方法，其中所述α-澱粉酶至少70％，優選80％，達到90％，比如達到95％，尤其是95％同源。
37.項36的方法，其中所比較的α-澱粉酶是類透阿米爾α-澱粉酶。
38.項28的方法，其中所比較的α-澱粉酶是SEQ ID NO1到SEQ IDNO8所示的任何一個α-澱粉酶。
本發明更進一步涉及編碼本發明所述變體的DNA構建體；製備本發明所述變體的方法；以及本發明所述變體單獨地或與其他酶結合，在各種工業產品或方法中的用途，例如，用在洗滌劑中或用於澱粉液化。
本發明最後一個方面涉及生產α-澱粉酶的方法，該酶的最適pH，和/或最適溫度發生改變，和/或穩定性提高。
命名法則在本說明書和項書中，使用了胺基酸殘基的常規單字母和三字母編碼。為了便於參考，採用以下命名法則來描述本發明的α-澱粉酶變體原胺基酸位點取代胺基酸根據這一命名原則，例如在第30位丙氨酸到天冬醯胺的取代應表示為Ala30Asn或A30N
在同一位點的丙氨酸缺失表示為Ala30*或A30*添加的胺基酸殘基，比如賴氨酸插入表示為Ala30 AlaLys或A30AK連續的胺基酸殘基片段，比如30-33位胺基酸殘基缺失表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當特定α-澱粉酶與其他α-澱粉酶相比含有一個「缺失」，並且在該位點做了一個插入，這種情況表示為(對於36位插入了一個天冬氨酸)36Asp或36D多重突變用加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S代表在30和34位分別將丙氨酸和穀氨酸取代為天冬氨酸和絲氨酸。
當在一個給定位點可以插入1或多個可選擇的胺基酸殘基時，將其表示為A30N，E或A30N或A30E另外，當本文中確定了一個適合進行修飾的位置而沒有建議具體的修飾方式，應當理解為可以用任何胺基酸殘基來取代該位點的胺基酸殘基。因此，例如，如果提及30位的丙氨酸修飾，但沒有具體化，應當理解可以將該丙氨酸缺失或用任何其他胺基酸來取代它，即下列之一的胺基酸R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。


圖1是6個親本類透阿米爾α-澱粉酶的胺基酸序列對比。最左端的數字代表下列各胺基酸序列1SEQ ID NO22Kaoamyl3SEQ ID NO14SEQ ID NO55SEQ ID NO46SEQ ID NO3圖2顯示SP722(SEQ ID NO2)(pH9)和地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶(SEQID NO4)(pH7.3)的溫度活性關係圖。
圖3顯示SP690(SEQ ID NO1)，SP722(SEQ ID NO2)，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶(SEQ ID NO4)在pH10的溫度分布圖。
圖4是5個α-澱粉酶的胺基酸序列對比。最左端的數字代表下列各胺基酸序列1amyp-小鼠2amyp-大鼠3amyp-豬 豬胰腺α-澱粉酶(PPA)4amyp-人5amy-altha A.haloplanctis α-澱粉酶(AHA)發明詳述類透阿米爾α-澱粉酶眾所周知，芽孢桿菌亞種所產生的許多α-澱粉酶在胺基酸水平上同源性極高。例如，發現包含SEQ ID NO4所示胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶(商品名為透阿米爾TM)與包含SEQ ID NO5所示胺基酸序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶大約89％同源，與包含SEQ ID NO3所示胺基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶大約79％同源。其他的同源α-澱粉酶包括來源於芽孢桿菌菌株NCIB12289，NCIB12512，NCIB12513或DSM9375的α-澱粉酶(這些在WO95/26397中都有詳細的描述)以及Tsukamoto等描述過的α-澱粉酶(生物化學和生物物理研究通訊，151(1988)，25-31頁，參見SEQID NO6)。
其他同源α-澱粉酶包括EP0252666中描述的地衣形芽孢桿菌(ATCC27811)產生的α-澱粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中鑑定到的α-澱粉酶。在產品OptithermTM和TakathermTM(Solvay有售)，MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor有售)，Spezym AATM和Spezym Delta AATM(Genencor有售)以及KeistaseTM(Daiwa有售)中含有其他一些商品類透阿米爾地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶。
由於發現這些α-澱粉酶之間有極大的同源性，可以認為它們屬於同類α-澱粉酶，即「類透阿米爾α-澱粉酶」類。
因此，在本文中，術語「類透阿米爾α-澱粉酶」意指這類α-澱粉酶，它在胺基酸水平上與透阿米爾TM(即具有文中SEQ ID NO4所示胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶)有極大的同源性。換句話說，以下所有具有SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8所示胺基酸序列，或者WO95/26397中的SEQ ID NO1所示胺基酸序列(與此處SEQ ID NO7所示胺基酸序列相同)之α-澱粉酶或者WO95/26397中的SEQ ID NO2所示胺基酸序列(與此處SEQ ID NO8所示胺基酸序列相同)或者Tsukamoto等文中(1988，該胺基酸序列在文中見SEQ ID NO6)之α-澱粉酶都被認為是「類透阿米爾α-澱粉酶」。其他的類透阿米爾α-澱粉酶是這樣一些α-澱粉酶i)與SEQ ID NO1-8所示胺基酸序列中的至少一個有至少60％，比如至少70％(例如至少75％)，或至少80％(例如至少85％)，至少90％或至少95％同源，和/或ii)與至少一個所述α-澱粉酶的抗體有免疫交叉反應，和/或iii)由這樣一種DNA序列編碼，這些序列能與編碼以上特定α-澱粉酶的DNA序列進行雜交，根據本申請的SEQ ID NO9，10，11或12(這些編碼序列分別編碼此處SEQID NO1，2，3，4和5所示的胺基酸序列)，WO95/26397中的SEQ ID NO4(文中SEQ ID NO13顯示了該DNA序列和終止密碼子TAA，並編碼文中SEQ ID NO8所示的胺基酸序列)以及WO95/26397中的SEQ ID NO5(文中SEQ ID NO14所示)很容易得到這些序列。
對於特性i)，可以藉助任何常規算法來確定「同源性」，優選利用GCG程序包7.3版本(1993年6月)中的GAP程序，該程序中GAP罰分採用預設值，即GAP生成罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1(Genetic computergroup(1991)GCG程序包程序手冊，版本7，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。
可以利用透阿米爾(SEQ ID NO4)和類透阿米爾α-澱粉酶之間的結構對比來鑑定其他類透阿米爾α-澱粉酶中的等同/相應位點。獲得所述結構對比的一個方法是利用GCG程序包中的Pile Up程序，該程序中GAP罰分採用預設值，即GAP生成罰分為3.0，GAP延伸罰分為0.1。其他結構對比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等，(1987)，FEBS快報224，149-155頁)和反相成絲技術(reverse threading)(Huber T，Torda，AE，蛋白質科學，7卷，1期142-149(1998))。
可以利用抗相關類透阿米爾α-澱粉酶的至少一個表位，或者與之反應的抗體來檢測α-澱粉酶的特性ii)，即免疫交叉反應性。可以通過本領域的已知方法，例如Hudson等(實用免疫學，第3版(1989)，Blackwell ScientificPublications)描述的方法來製備單克隆或多克隆抗體。可以利用本領域已知的檢測方法(這類例子有Western印跡或者Hudson等(1989)描述的徑向免疫擴散法)來確定免疫交叉反應性。就這方面而言，發現具有SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8所示胺基酸序列的α-澱粉酶之間分別有免疫交叉反應。
可以在所研究的α-澱粉酶的全長或部分核苷酸或胺基酸序列的基礎上適當地製備到用於根據特性iii)來鑑定類透阿米爾α-澱粉酶的寡核苷酸探針。
檢測雜交的適宜條件包括在5×SSC中預浸泡，於～40℃在含有20％甲醯胺，5×Denhardt′s溶液，50mM磷酸鈉(pH6.8)以及50mg超聲變性小牛胸腺DNA的溶液中預雜交1小時，然後於～40℃在補充有100mMATP的同一溶液中雜交18小時，隨之將濾膜洗3次，每次在2×SSC，0.2％SDS中於40℃(低嚴格性)，優選50℃(中等嚴格性)，更優選65℃(高嚴格性)，還要優選的是～75℃(極高嚴格性)洗30分鐘。有關雜交方法的其他細節可見Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，Cold Spring Harbor，1989.
在本文中，「來源於」不僅是指由所研究的微生物菌株產生或能產生的α-澱粉酶，也指分離自該菌株的DNA序列所編碼的，並在用所述DNA序列轉化的宿主微生物中產生的α-澱粉酶。最後，該術語意指這樣的α-澱粉酶，它由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼並且具備所述α-澱粉酶的鑑定特徵。該術語還用來表示親本α-澱粉酶可以是天然存在的α-澱粉酶的變異體，即由天然存在的α-澱粉酶的1或多個胺基酸殘基經過修飾(插入，取代，缺失)所產生的變體。
親本雜交α-澱粉酶親本α-澱粉酶(即主鏈α-澱粉酶)可以是一種雜交α-澱粉酶，即包含組合在一起的來源於至少兩個α-澱粉酶的部分胺基酸序列。
親本雜交α-澱粉酶可以是這樣的酶，在胺基酸同源性和/或免疫雜交反應性和/或DNA雜交(如上所述)的基礎上可以確定它屬於類透阿米爾α-澱粉酶家族。在這種情況中，雜交α-澱粉酶通常包含類透阿米爾α-澱粉酶的至少一部分和1或多個其他α-澱粉酶的1個或多個部分，後者選自微生物(細菌或真菌)和/或哺乳動物來源的類透阿米爾α-澱粉酶或非類透阿米爾α-澱粉酶。
因此，親本雜交α-澱粉酶可以包括來源於至少兩個類透阿米爾α-澱粉酶，或者來源於至少一個類透阿米爾α-澱粉酶和至少一個非類透阿米爾細菌α-澱粉酶，或者來源於至少一個類透阿米爾和至少一個真菌α-澱粉酶的部分胺基酸序列的組合。來源於部分胺基酸序列的類透阿米爾α-澱粉酶可以是，例如文中提到的那些特定類透阿米爾α-澱粉酶中的任何一個。
例如，親本α-澱粉酶可以包括來源於地衣形芽孢桿菌菌株的α-澱粉酶的羧基端部分和來源於解澱粉芽孢桿菌菌株或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-澱粉酶的氨基端部分。例如，親本α-澱粉酶可以包括地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶的羧基端部分的至少430個胺基酸殘基，還可以，例如，包括a)與具有SEQ ID NO5所示胺基酸序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶的37個氨基端胺基酸殘基相對應的胺基酸片段和與具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶的445個羧基端胺基酸殘基相對應的胺基酸片段，或者雜交類透阿米爾α-澱粉酶與透阿米爾序列(即SEQ ID NO4所示的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶)相同，除了氨基端的35個胺基酸殘基被BAN(成熟蛋白質)(即SEQ ID NO5所示的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶)的氨基端33個殘基(成熟蛋白質)取代；或者包括b)與具有SEQ ID NO3所示胺基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶的68個氨基端胺基酸殘基相對應的胺基酸片段和與具有SEQ ID NO4所示胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶的415個羧基端胺基酸殘基相對應的胺基酸片段。
另一合適的親本雜交α-澱粉酶是先前在WO96/23874(Novo Nordisk申請)中描述的酶，該酶由BAN(解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶)的氨基端(成熟蛋白質的1-300位胺基酸)和透阿米爾的羧基端(成熟蛋白質的301-483位胺基酸)構成。通過將上述雜交α-澱粉酶(BAN1-300/透阿米爾301-483)的1或多個以下位點取代使其活性提高Q360，F290和N102。尤其有意義的取代是1或多個以下取代Q360E，D；F290A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；N102D，E。
SEQ ID NO2所示SP722α-澱粉酶中的相應位點是S365，Y295，N106中的1或多個。在SEQ ID NO2所示α-澱粉酶中尤其有意義的相應取代是S365D，E；Y295A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；以及N106D，E中的1或多個。
SEQ ID NO1所示SP690α-澱粉酶中的相應位點是S365，Y295，N106中的1或多個。尤其有意義的相應取代是S365D，E；Y295A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T；以及N106D，E中的1或多個。
上面提到的非類透阿米爾α-澱粉酶可以，例如，是(與類透阿米爾α-澱粉酶不同的)真菌α-澱粉酶，哺乳動物或植物α-澱粉酶或者細菌α-澱粉酶。這類α-澱粉酶的具體例子包括米麴黴TAKAα-澱粉酶，黑麴黴酸α-澱粉酶，枯草芽孢桿菌α-澱粉酶，豬胰腺α-澱粉酶和大麥α-澱粉酶。所有這些α-澱粉酶的結構與文中所述的典型類透阿米爾α-澱粉酶的結構顯著不同。
上面提到的真菌α-澱粉酶，即來源於黑麴黴和米麴黴，在胺基酸水平上同源性極高，通常認為屬於同族α-澱粉酶。來源於米麴黴的真菌α-澱粉酶以商品名FungamylTM銷售。
另外，如果類透阿米爾α-澱粉酶的特定變體(本發明的變體)是指-以常規方式-特定類透阿米爾α-澱粉酶的胺基酸序列中的特異胺基酸殘基發生的修飾(例如缺失或取代)，那麼應將其理解為涵蓋了在等同位點(由各胺基酸序列之間的最可能胺基酸對比所確定的)進行修飾的另一個類透阿米爾α-澱粉酶的變體。
在本發明的一個優選實施方案中，α-澱粉酶主鏈來源於地衣形芽孢桿菌(與親本類透阿米爾α-澱粉酶一樣)，例如前面提到過的，比如具有SEQ IDNO4所示胺基酸序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶。
本發明變體的改變特性以下討論存在於本發明的變體中的突變與可能由該突變導致的預期性狀變化(相對親本類透阿米爾α-澱粉酶的這些性狀)之間的關係。
在pH8-10.5的穩定性提高在本發明文中，對於實現在高pH下穩定性提高有重要意義的突變(包括胺基酸取代)包括與SP722α-澱粉酶(具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列)中的1或多個下列位點所發生的突變相對應的突變T141，K142，F143，D144，F145，P146，G147，R148，G149，R181，A186，S193，N195，K269，N270，K311，K458，P459，T461。
本發明的變體具有1或多個下列取代(使用SEQ ID NO2的編號)T141A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；K142A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；F143A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；D144A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F145A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；P146A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G147A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；R148A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G149A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
K181A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，P，K，M，F，S，T，W，Y，V；S193A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；N195A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K269A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A，D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K311A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V.
優選的高pH穩定性變體包括SP722α-澱粉酶(具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列)中的1或多個下列取代K142R，R181S，A186T，S193P，N195F，K269R，N270Y，K311R，K458R，P459T和T461P。
在具體實施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶作為主鏈，即親本類透阿米爾α-澱粉酶來進行這些突變。
從圖1的對比結果可以看到，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的N270對應的位點已有一個酪氨酸。另外，芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶和解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的K458對應的位點早已有精氨酸。另外，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的T461對應的位點已有一個脯氨酸。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
可以利用實施例2中提及的分子動力學模擬，通過在所發現的區域進行取代來構建在高pH下穩定性提高的α-澱粉酶變體。模擬描述了那些在高pH(即pH8-10.5)比在中等pH有更高柔性或可變性的區域。
利用任何與類透阿米爾α-澱粉酶(BA2，在Novo Nodisk提出的WO96/23874的附錄1中公開了該酶的3D結構)同源(定義如下)的細菌α-澱粉酶的結構，即有可能建立這些α-澱粉酶結構的模型並可以對它進行分子動力學模擬。用GCG程序包7.3版(1993年6月)中的UWGCG GAP程序測量到所述細菌α-澱粉酶的同源性可以為至少60％，優選70％以上，更優選80％以上，最優選90％以上同源於前面提及的類透阿米爾α-澱粉酶(BA2)，測量採用預設值作為GAP罰分(Genetic computer group(1991)GCG程序包程序手冊，版本7，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。將不利的殘基取代為其他殘基是可行的。
在pH8-10.5的Ca2+穩定性提高Ca2+穩定性提高意味著酶在Ca2+耗盡的情況下，穩定性已有提高。在本發明文中，對於獲得在高pH下Ca2+穩定性提高有重要意義的突變(包括胺基酸取代)包括與SP722α-澱粉酶(具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列)中的下列位點相對應的1或多個位點突變或缺失R181，G182，D183，G184，K185，A186，W189，N195，N270，E346，K385，K458，P459。
本發明的變體具有1或多個下列取代或缺失R181*，A，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G182*，A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G184*，A，R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K185A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；A186D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W189A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A， R，D，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；E346A， R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K385A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；P459A， R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V.
優選的是具有1或多個下列取代或缺失的變體R181Q，N；G182T，S，N；D183*；G184*；K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F，P，S，T，W，Y，V；A186T，S，N，I，V；W189T，S，N，Q；N195F，N270R，D；E346Q；K385R；K458R；P459T.
在具體實施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶作為進行這些突變的主鏈。
從圖1的對比結果可看到，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶沒有與SP722中的D183和G184對應的位點。因此，所述缺失與該α-澱粉酶無關。
在一個優選實施方案中，變體是這樣的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶，它在D183和G184缺失，並有下列取代之一R181Q，N和/或G182T，S，N和/或D183*；G184*和/或K185A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F，P，S，T，W，Y，V和/或A186T，S，N，I，V和/或W189T，S，N，Q和/或N195F和/或N270R，D和/或E346Q和/或K385R和/或K458R和/或P459T。
在中溫的特異活性增強本發明另外一個方面，對於獲得在10-60℃，優選20-50℃，尤其是30-40℃特異活性增強的變體來說，重要的突變包括與SP722α-澱粉酶(具有SEQID NO2所示胺基酸序列)中的1或多個下列位點相對應的突變H107，K108，G109，D166，W167，D168，Q169，S170，R171，Q172，F173，Q174，D183，G184，N195，F267，W268，K269，N270，D271，L272，G273，A274，L275，G456，N457，K458，P459，G460，T461，V462，T463.
本發明的變體具有1或多個下列取代H107A， D，R，N，C，E，Q，G，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K108A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；G109A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D166A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；W167A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；D168A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q169A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；S170A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V；R171A， D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；Q172A， D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F173A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；Q174*，A，D，R，N，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D183*，A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；G184*，A，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N195A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；F267A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，P，S，T，W，Y，V；W268A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，Y，V；K269A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；N270A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；D271A， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；L272A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G273A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；A274D， R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；L275A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；G456A， D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；N457A， D，R，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；K458A， D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
P459A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V；G460A，D，R，N，C，E，Q，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；T461A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V；V462A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；T463A，D，R，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，W，Y，V.
優選的變體具有1或多個下列取代或缺失Q174*，D183*，G184*，K269S。
在具體實施方案中，用具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶作為進行這些突變的主鏈。
本發明變體的通用突變在中溫特異活性增強特別有意義的胺基酸取代是那些能提高酶活性部位周圍的可變性的取代。這可以通過那些能破壞活性部位附近(即優選與構成活性部位的任何殘基在10A或8A或6A或4A之內)的穩定性相互作用的改變來實現。
這類例子是那些能降低側鏈尺寸的突變，比如Ala到GlyVal到Ala或GlyIle或Leu到Val，Ala或GlyThr到Ser我們希望，通過導入空腔或者通過能填塞突變造成的空間的結構重排，這些突變導致活性部位區域的柔性提高。
可以優選本發明的變體還包含1或多個除上面概括過的以外的修飾。因此，將被修飾的α-澱粉酶變體某部分存在的1或多個脯氨酸取代為非脯氨酸殘基可能是有益的，所述非脯氨酸可以是任何可能的，天然非脯氨酸殘基，優選是Ala，Gly，Ser，Thr，Val或Leu。
類似地，可以優選將親本α-澱粉酶被修飾的那些胺基酸殘基中存在的1或多個Cys殘基取代為非半胱氨酸殘基，比如Ser，Ala，Thr，Gly，Val或Leu。
另外，可以將本發明的變體進行修飾一作為唯一的修飾或者結合上面概括的任何修飾-以便將與SEQ ID NO4中的185-209位胺基酸片段所對應的胺基酸片段中存在的1或多個Asp和/或Glu分別取代為Asn或Gln。同樣有意義的是在類透阿米爾α-澱粉酶中，將與SEQ ID NO4中的185-209位胺基酸片段所對應的胺基酸片段中存在的1或多個Lys殘基取代為Arg。
應當明白，本發明涵蓋了含有兩個或多個上述修飾的變體。
另外，向此處描述的任何變體導入點突變可能是有益的。
活性部位周圍可變性提高的α-澱粉酶變體可以通過替換靠近底物部位的1或多個位點的1或多個胺基酸殘基來提高本發明α-澱粉酶變體的可變性。這些位點是(使用SP722α-澱粉酶(SEQID NO2)的編號)V56，K108，D168，Q169，Q172，L201，K269，L272，L275，K446，P459。
因此，本發明的一個方面涉及在1或多個上述位點發生突變的變體。
優選的取代是下列中的1或多個V56A，G，S，T；K108A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；D168A，G，I，V，N，S，T；Q169A，D，G，H，I，L，M，N，S，T，V；Q172A，D，G，H，I，L，M，N，S，T，V；L201A，G，I，V，S，T；K269A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；L272A，G，I，V，S，T；L275A，G，I，V，S，T；Y295A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，F，S，T，V；K446A，D，E，Q，G，H，I，L，M，N，S，T，V；P459A，G，I，L，S，T，V.
在本發明的具體實施方案中，用具有SEQ ID NO1所示序列的芽孢桿菌菌株NCIB12512α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO4所示序列的地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶，或者具有SEQ ID NO5所示序列的解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶作為進行這些突變的主鏈。
從圖1的對比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶和解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的K269相對應的位點有一個Glu。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的K269相對應的位點有一個Ser。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
另外，從圖1的對比可以看到，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的L272相對應的位點有一個Ala，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的L272相對應的位點有一個Ile。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
從圖1的對比可以看到，芽孢桿菌菌株12512α-澱粉酶在與SP722中的L275相對應的位點有一個Ile。因此所述取代與該α-澱粉酶無關。
從圖1的對比可以看到，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的Y295相對應的位點有一個Phe。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的Y295相對應的位點有一個Asn。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
從圖1的對比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶和解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的K446相對應的位點有一個Asn。另外，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的K446相對應的位點有一個His。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
從圖1的對比可以看到，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶以及嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶在與SP722中的P459相對應的位點有一個Ser。另外，芽孢桿菌菌株12512α-澱粉酶在與SP722中的P459相對應的位點有一個Thr。因此，所述取代與這些α-澱粉酶無關。
在中溫有較高活性的酶的穩定化本發明另一個實施方案涉及提高低溫α-澱粉酶(例如河豚毒素交替單胞菌(Feller等，(1994)，歐洲生物化學雜誌222441-447))和中溫α-澱粉酶(例如SP722和SP690)的穩定性，這些酶具有中溫活性，即通常稱為嗜冷酶和嗜溫酶。對於這一特定酶類，穩定性應理解為熱穩定性或在鈣耗竭條件下的穩定性。
通常，在中溫顯示高活性的酶在那些對酶有抑制作用的條件(比如溫度或鈣耗竭)下也會有嚴重問題。
從而，本發明的目的是提供在中溫顯示所需高活性，同時在輕微抑制條件下不喪失活性的酶。
應當優選穩定化變體於中溫測定的活性是初始活性的100％或以上與50％之間，更優選在100％或以上與70％之間，最優選在100％或以上與85％之間，所述初始活性是酶在穩定化前在該特定溫度的活性，並且得到的酶應能在抑制條件下比野生型的酶忍受更長時間的溫育。
可以考慮的酶包括例如細菌或真菌來源的α-澱粉酶。
一例這類低溫α-澱粉酶是分離自河豚毒素交替單胞菌(Feller等，(1994)，歐洲生物化學雜誌222441-447)的酶。已得到了該α-澱粉酶的晶體結構(Aghajari等，(1998)，蛋白質科學7564-572)。
河豚毒素交替單胞菌α-澱粉酶(圖4所示對比結果的5)與豬胰腺α-澱粉酶(PPA)(圖4所示對比結果的3)大約66％同源。PPA 3D結構是已知的，並且可從Brookhaven資料庫中以1OSE或1DHK的名字獲得。根據與其他更穩定的α-澱粉酶的同源性，可以使得來自河豚毒素交替單胞菌α-澱粉酶實現「低溫高活性酶」的穩定化，並同時維持所需的中溫高活性。
圖4顯示5個α-澱粉酶，包括AHA和PPAα-澱粉酶的多重序列對比。使河豚毒素交替單胞菌α-澱粉酶的穩定性提高的特異突變是T66P，Q69P，R155P，Q177R，A205P，A232P，L243R，V295P，S315R。
製備α-澱粉酶變體的方法幾種將突變導入基因的方法是本領域已知的。簡要討論α-澱粉酶-編碼DNA序列之後，將討論在α-澱粉酶-編碼序列中的特定位點產生突變的方法。
克隆編碼α-澱粉酶的DNA序列可以利用多種本領域的公知方法，從任何能產生目的α-澱粉酶的細胞或微生物中分離編碼親本α-澱粉酶的DNA序列。首先，應當利用得自能產生目的α-澱粉酶的有機體的染色體DNA或信使RNA來構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然後，如果α-澱粉酶的胺基酸序列是已知的，可以合成併合成並用同源的，標記的寡核苷酸來由從目的有機體製備的基因組文庫鑑定α-澱粉酶-編碼克隆。另外，可以使用標記的寡核苷酸探針(該探針含有與已知α-澱粉酶基因同源的序列)作為探針，採用低嚴謹性雜交和洗滌條件來鑑定α-澱粉酶-編碼克隆。
另一種鑑定α-澱粉酶-編碼克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達載體(比如質粒)，用所得基因組DNA文庫轉化α-澱粉酶陰性的細菌，以及隨後將轉化細菌鋪到含有α-澱粉酶底物的瓊脂上，從而能鑑定表達α-澱粉酶的克隆。
可選擇地，可以通過已確立的標準方法來合成製備編碼酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的磷酸脒方法或Matthes等(1984)描述的方法。在磷酸脒方法中，在例如自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，將其純化，退火，連接和克隆到合適的載體中。
最後，DNA序列可以是基因組和合成來源混合的，合成和cDNA來源混合的，或者基因組和cDNA來源混合的，其是依照標準技術，將合成的，基因組或cDNA來源的片段連接在一起而製備的(在合適時，對應完整DNA序列各部分的片段)。還可以如US4683202或R.K.Saiki等(1988)描述的，使用特異引物通過聚合酶鏈反應(PCR)來製備DNA序列。
表達α-澱粉酶變體根據本發明，可以利用表達載體將通過上述方法，或者通過本領域已知的任何替代方法製備的編碼變體的DNA序列表達為酶的形式，載體通常包括調控序列，該序列編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號以及任選地，阻遏子基因或各種激活子基因。
攜帶編碼本發明所述α-澱粉酶變體之DNA序列的重組表達載體可以是任何能方便地進行重組DNA操作的載體，且載體的選擇通常取決於它將要導入的宿主細胞。因此，載體可以是自主複製的載體，即以染色體外個體存在的載體，其複製獨立於染色體的複製，例如質粒，噬菌體或染色體外元件，微小染色體或人工染色體。可選擇地，載體可以是這樣的，當被導入宿主細胞時，它會整合到宿主基因組中，並與所整合到其中的染色體一起複製。
在所述載體中，DNA序列應當可操縱地連接到合適的啟動子序列。該啟動子可以是任何在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的DNA序列，並可以來源於編碼宿主細胞的同源或異源蛋白質的基因。適於引導編碼本發明所述α-澱粉酶變體的DNA序列的轉錄的合適的啟動子序列是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的序列，並可以來源於編碼宿主細胞的同源或異源蛋白質的基因。適於引導編碼本發明所述α-澱粉酶變體的DNA序列進行轉錄(特別是在細菌宿主中)的啟動子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈黴菌瓊脂糖酶基因dagA的啟動子，地衣形芽孢桿菌α-澱粉酶(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽澱粉酶基因(amyM)的啟動子，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因等的啟動子。在真菌宿主中進行轉錄時，有用的啟動子的例子是來源於這樣一些基因的啟動子，所述基因編碼米麴黴TAKA澱粉酶，米赫氏根黴天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴中性α-澱粉酶，黑麴黴酸穩定α-澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，米赫氏根黴脂酶，米麴黴鹼性蛋白酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴乙醯胺酶。
本發明的表達載體還可以包含合適的轉錄終止子以及，在真核細胞中時的多腺苷酸化序列，它們與編碼發明所述α-澱粉酶變體的DNA序列可操縱地連接在一起。終止和多腺苷酸化序列可以適當地來自與啟動子相同的來源。
載體還可以包含能使載體在目的宿主細胞中進行複製的DNA序列。這類序列的例子是質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的複製原點。
載體還可以包含選擇標記，例如一個其產物能補償宿主細胞缺陷的基因，比如來自枯草芽孢桿菌或地衣形芽孢桿菌的dal基因；或者賦予抗生素抗性(比如氨苄青黴素，卡那黴素，氯黴素或四環素抗性)的基因。另外，載體可以包含麴黴選擇標記，比如amdS，argB，niaD和sC，產生潮黴素抗性的標記，或者可以通過共轉化(例如WO91/17243中描述的)來實現選擇。
胞內表達在某些方面可能是有益的，例如用某種細菌作為宿主細胞時，但通常優選表達是胞外的。總之，此處提及的芽孢桿菌α-澱粉酶包含一個允許被表達的蛋白酶分泌到培養基中的前導區。如果需要，可以方便地通過取代編碼該前區的DNA序列來將該前區替換為不同的前導區或信號序列。
用於分別將編碼α-澱粉酶變體，啟動子，終止子和其他元件的本發明所述DNA構建體連接在一起，並將其插入合適的包含複製所用的必要信息之載體的步驟是本領域技術人員所熟知的(參考，例如，Sambrook等，分子克隆實驗指南，第2版，Cold Spring Harbor，1989)。
本發明的細胞，它包含如上所述的本發明DNA構建體或表達載體，可以有效地作為重組製備本發明α-澱粉酶變體的宿主細胞。可以用本發明編碼變體的DNA構建體，方便地通過將該構建體(以1或多拷貝)整合到宿主染色體中來轉化所述細胞。通常認為整合是有益的，因為這樣DNA序列更可能穩定地保持在細胞中。可以依照常規方法，例如通過同源或異源重組將DNA構建體整合到宿主染色體中。可選擇地，可以根據宿主細胞的不同類型用上面描述過的表達載體來轉化細胞。
本發明的細胞可以是更高等的生物，比如哺乳動物或昆蟲的細胞，但優選是微生物細胞，比如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
合適的細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，比如枯草芽孢桿菌，地衣形芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌，或者淺青紫鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或者是革蘭氏陰性細菌，比如大腸桿菌。可以通過例如原生質體轉化或利用競爭細胞以已知方式來實現細菌的轉化。
可以有利地從酵母屬或裂殖酵母屬中選擇酵母微生物，例如釀酒酵母。絲狀真菌最好是屬於麴黴屬的種，例如米麴黴或黑麴黴。可以通過一個包括原生質體形成和轉化，以及隨後以已知方式再生細胞壁的方法來轉化真菌細胞。在EP238023中描述了轉化麴黴宿主細胞的適用步驟。
再一方面，本發明涉及製備發明所述α-澱粉酶變體的方法，該方法包括在有助於變體生產的條件下培養以上描述的宿主細胞，以及從細胞和/或培養基中回收變體。
用於培養細胞的培養基可以是任何適合目的宿主細胞生長以及本發明所述α-澱粉酶變體進行表達的常規培養基。可以從供應商那裡獲得合適的培養基或者可以根據公開的配方(例如，美國典型培養物保藏中心的目錄中所描述的)來製備。
可以通過公知方法從培養基中方便地回收宿主細胞所分泌的α-澱粉酶變體，這些方法包括通過離心或過濾從培養基中分離細胞，以及藉助鹽(比如硫酸銨)來沉澱培養基中的蛋白類成分，然後利用層析操作，比如離子交換層析，親合層析等。
工業應用本發明的α-澱粉酶變體具備適合多種工業應用的有價值的特性。具體來說，本發明的酶變體可以作為洗滌，餐具清洗和硬金屬表面清潔的洗滌劑組合物的成分。
許多變體在由澱粉生產甜味劑和乙醇，和/或紡織品退漿時尤其有用。在例如US3912590和歐洲專利
發明者託賓·V·博徹特, 阿倫·斯文森, 卡斯滕·安德森, 比賈尼·R·尼爾森, 託賓·L·尼森, 索倫·克賈魯爾夫, R 尼爾森, 安德森, L 尼森, 克賈魯爾夫, 託賓 V 博徹特, 斯文森 申請人:諾維信公司