一種胃癌治療療效判斷的方法、試劑盒及其使用方法
2023-06-28 14:30:51
專利名稱：一種胃癌治療療效判斷的方法、試劑盒及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種胃癌治療療效判斷的方法、試劑盒及其使用方法。
背景技術：
胃癌是最高發的癌症之一，每年約有新發病例87萬和死亡病例65萬。胃癌早期治療效果好，但診斷難；晚期易於診斷，但是治癒難度大。早期胃癌診斷率小於15%，多數胃癌一經診斷即為晚期。診斷胃癌常用的胃鏡技術近年來有顯著發展，如胃黏膜染色內鏡使用的不吸收染料(如靛蘭胭脂紅)，胃癌組織著色率在90%以上，提高胃癌的檢出率；放大胃鏡(可以放大80倍)有助於在微血管水平評估胃部病變；紅外線視頻內鏡的紅外線可以穿透組織深部，獲得組織的黏膜下特徵；電子超聲內鏡能夠清晰地顯示正常胃壁的5層、7層或9層的聲像，通過聲像圖形的改變，可具體辨別出腫瘤黏膜浸潤程度，對早期胃癌診斷正確率可達 88-99%。然而胃鏡檢查價格較貴，同時也給患者帶來不少痛苦，急需開發價廉、舒適、適合胃癌診斷的方法。基因診斷將是胃癌診斷突破口，現已發現癌基因ras、c-met、pl6、cerb、 p53、及端粒酶活性與胃癌有一定關係。但這些指標對胃癌缺乏特異性，目前有潛在臨床應用價值血清學檢測癌前病變或胃癌的方法正在摸索研究中。miRNA是一類非編碼的長約20 22個核苷酸的RNA，是miRNA前體經過RNaseIII 酶Dicer加工形成的miRNA雙鏈。雙鏈中的一條與沉默複合體(RISC)連在一起，另一條被細胞內的核酸酶降解。miRNA-RISC複合體結合到特定mRNA目標，導致mRNA翻譯抑制或裂解。因此，miRNA通過促進RNA降解，抑制mRNA翻譯，或者影響轉錄來調節蛋白的表達。雖然miRNA介導的mRNA降解也發生在哺乳動物中，但大多數哺乳動物的miRNA被認為是通過 mRNA3'-非編碼區不完善的鹼基配對(3『-非翻譯區)在轉錄水平上抑制了目的基因的表達。這種形式的翻譯調控誘導蛋白質合成的快速變化，而不需要mRNA加工過程中大量的轉錄激活和後續步驟，因此提供了對特定蛋白表達更精確、直接和節能的控制方式。此外， 基因表達的翻譯控制有容易逆轉的優勢，為細胞應對各種壓力提供了很大的靈活性。miRNA已被證實參與調控了包括時序發育、細胞凋亡脂肪代謝、神經元發育、細胞分化、激素分泌等在內的多種生理過程。此外，miRNA與癌症發生密切相關。癌症是由受損細胞增殖失控或不適當存活引起的。正常細胞已形成保護功能，以確保細胞的分裂、分化和死亡過程正確且協調地進行。當指導細胞增殖和分化的基因受到損傷時，癌症就發生了。而miRNA發揮類似致癌基因或抑癌基因的作用，參與癌症的發生、發展。(Micro RNAs genomics biogenesis mechanism, and funection[J]. Cell,2004,116 (2) :281-297)位於13ql4的miR-15以及miR_16在B細胞慢性淋巴白血病中表達水平下調；miR-143與 miR-145在直腸癌中表達水平下調；let27在肺癌樣本中表達水平下調，並與預後正相關； miR-125b，miR-145, miR-155, miR-21在乳腺癌中表達水平明顯下調。(姜潔純，湯華.微小RNAs與腫瘤關係的研究進展.醫學綜述，2008，14 (07) :1005-1006)研究人員發現另有一些miRNA在腫瘤樣本中表達水平上調，如由miR-17，miR-18，miR-19等在肺癌樣本中表達水平上調，miR-155的前 Burkitt淋巴瘤表達水平上調。隨著研究的深人，研究人員發現一些miRNA在細胞調控中扮演著「雙刃劍」的作用，如miR-21在乳腺癌樣本中表達水平明顯下調，而在神經膠質瘤中表達水平明顯上調(葉萍，於鳳海.MicroRNAs與肝癌.第二軍醫大學學報，2008，四(05) :561-564.)MiRNA在不同的癌症細胞中具有特定的表達水平和模式，人們可以通過對人乳腺癌、肺癌、結直腸癌、顱腦腫瘤、甲狀腺癌和淋巴瘤等組織中的miRNA表達譜與正常的組織表達譜進行對比分析，對不同癌症特定的miRNA水平進行鑑定，從而有助於癌症的臨床管理。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於在於提供一種能判斷胃癌治療療效的方法，準確判斷患者是否能從治療方案中獲益，幫助判斷使用何種治療方法，從而避免對無應答患者的毒性、降低病人的醫療成本。為解決上述技術問題，本發明提供了一種判斷胃癌治療療效的方法檢測胃癌組織中miR-21和/或miR-18Ib表達水平。將實際測得的miR-21和/或HiiR-ISlb表達水平與治療前相比，如果降低明顯，表明治療方案有效，如果升高或者降低不明顯，表明治療方案對病人效果不明顯，需要考慮更換治療方案。實施例1試驗表明，胃癌組織中miR-21和miR-lSlb有著顯著的表達，治療後低水平miR-21和miR-181b表達的患者生存率更高。本發明提供的試劑盒由三個獨立包裝或組合包裝的試劑盒組成RNA提取試劑盒、RT-PCR反應試劑盒、實時定量PCR反應試劑盒，依次使用三個試劑盒能檢測出胃癌組織中miR-21和miR-181b的含量。作為優選RNA提取試劑盒，含有Trizol試劑、氯仿、異丙醇、顯色劑、乙醇、無核酸酶水。顯色劑為糖原衍生的藍色染料。作為優選RNA提取試劑盒中，含有Trizol試劑0. 8-1. ^il、氯仿500_700ul、異丙醇 400-600ul、顯色劑 0. 5-2ul、75% 乙醇 0. 5_2ml、無核酸酶水 5_20ul。作為優選RNA提取試劑盒中，含有1Trizol試劑1. 05ml、氯仿600ul、異丙醇500ul、 顯色劑lul、75%乙醇1ml、無核酸酶水10ul。作為優選RT-PCR試劑盒，含有dNTPs，逆轉錄酶，逆轉錄緩衝液，RNA酶抑制劑， miR-21和/或miR-18Ib特異性逆轉錄引物、無核酸酶水。作為優選RT-PCR試劑盒中，含有10 mM dNTPs 0. 15ul，50U/ul逆轉錄酶lul，10倍濃度PH7. 5的逆轉錄緩衝液1. 5ul，20U/ul RNA酶抑制劑0. 19ul，購自Applied Biosystem 的5倍濃度miR-21和/或miR-18Ib特異性逆轉錄引物!3ul、無核酸酶水4. 16ul。作為優選實時定量PCR反應試劑盒，含有通用PCR總混合物、無核酸酶水、miR-21 和/或miR-181b特異性PCR引物。通用PCR總混合物(Universal PCRMasterMix，購自 TaqMan)中含有DNA聚合酶、UNG酶、含dUTP的dNTPs、內參、緩衝液。作為優選實時定量PCR反應試劑盒，含有TaqMan2倍濃度通用PCR總混合物(TaqMan 2x Universal PCR Master Mix) 10ul、無核酸酶水 7. 67ul、購自 AppliedBiosystem的20倍濃度miR-21和/或miR_181b特異性PCR引物Iul。本發明提供了 RNA試劑盒的使用方法1)、用移液器將樣本反覆吹打混勻，各吸取樣本350ul到兩個1. 5ml離心管中，向其中一管加入Ing的RNA作為陽性對照；2)、加入1.05ml Trizol，振蕩5min，混勻，分為兩管;3)、各加入600ul氯仿再振蕩5min ；4)、室溫靜置5min，13200rpm離心lOmin，取800ul上層有機相到新的離心管；5)、加入500ul異丙醇和Iul顯色劑，上下顛倒管子，_20°C冰浴2h ；6)、2h後，取出冰浴樣本，4°C，13200rpm離心lOmin，棄上清，可見離心管底有藍色
沉澱；7)、加Iml 75%乙醇，上下顛倒離心管，13200rpm離心5min棄上清；8)、再離心1 min，用槍頭吸去上清；9)、放通風櫃，晾乾；10) UOul無核酸酶水溶解，-80°C保存。本發明提供了 RT-PCR試劑盒的使用方法1)、將IOmM dNTPsO. 15ul，逆轉錄酶Iul，10倍濃度PH7. 5的逆轉錄緩衝液1. 5ul， 20U/ulRNA 酶抑制劑 0. 19ul，購自 Applied Biosystem 的 5 倍濃度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特異性逆轉錄引物Ml、無核酸酶水4. 16ul、5ul RNA試劑盒提取的樣品混勻瞬離，分裝，加入對應的模板混勻，再加入無核酸酶水至總體系為15ul ；2)、將步驟1的材料在普通PCR儀上進行逆轉錄，16 V保持30min，42 V保持 30min，85°C保持 5min，4°C保持過夜；3)、取步驟2中的材料20ul，繼續在普通PCR儀上反應，a) 95°C保持10min，b)55°C 保持 2min，c) 72°C保持 2min，d) 95°C保持 15 秒，e) 60°C保持 4min, f)重複步驟 d)、e) 12 次， g)99. 0°C 保持 IOmin。本發明提供了實時定量PCR試劑盒的使用方法1)將 IOul TaqMan2 倍濃度通用 PCR 總混合物(iTaciMan 2x Universal PCR Master Mix)、7. 67ul 無核酸酶水、Iul 購自 Applied Biosystem 的 20 倍濃度 miR-21 和 / 或miR-lSlb特異性PCR引物、RT-PCR試劑盒獲得的miRNA逆轉錄產物稀釋5倍後的產物 1. 33ul 混勻；2)在普通PCR儀上反應，a) 95°C保持lOmin，b) 95°C保持15秒，c) 60°C保持60秒， d)重複步驟b)、c)45次，g)4°C保存待檢測。本發明的有益效果是RNA提取試劑盒使用的樣本為病人胃癌組織或者胃癌石蠟組織切片，正確按照上述方法依次使用RNA提取試劑盒、RT-PCR反應試劑盒、實時定量PCR 反應試劑盒後，能檢測出胃癌組織中miR-21和miR-lSlb的含量。試驗結果表明胃癌組織中miR-21和miR-181b有著顯著的表達，治療後低水平miR-21和miR_181b表達的患者生存率更高。將實際測得的miR-21和/或miR-lSlb表達水平與治療前相比，如果降低明顯， 表明治療方案有效，如果升高或者降低不明顯，表明治療方案對病人效果不明顯，需要考慮更換治療方案。這將協助胃癌的臨床管理，有助於篩選哪些胃癌患者將從治療中獲益，從而避免對無應答患者的毒性、降低病人的醫療成本。
圖1 :miR-140、miR-192、miR-200c、let_7g在正常組織和胃癌組織中的表達水平圖2 :miR-21、miR-181b在正常組織和胃癌組織中的表達水平圖3 =S-I/奧沙利鉬、去氧氟尿苷/奧沙利鉬治療患者的Kaplan-Meier總生存曲線與miR-21表達水平的關係圖4 =S-I/奧沙利鉬、去氧氟尿苷/奧沙利鉬治療患者的Kaplan-Meier總生存曲線與miR-181b表達水平的關係
具體實施例方式實施例1候選基因分析1.病人與組織樣本收集KPS > 70的胃癌III和IV期患者，去氧氟尿苷/奧沙利鉬組每天服用去氧氟尿苷兩次，每次400mg，靜脈奧沙利鉬第一天130mg/平米，四周一療程。s_l/奧沙利鉬組每天服用S-I兩次，每次40mg，靜脈奧沙利鉬第一天130mg/平米，四周一療程。這些病人的特徵見表1。取上述患者的胃癌組織，福馬林固定制作石蠟標本，用於後續的RNA提取。表1.去氧氟尿苷/奧沙利鉬或S-I/奧沙利鉬治療的胃癌患者的臨床和病理參數
權利要求
1.一種判斷胃癌治療療效的方法檢測胃癌組織中miR-21和/或miR-lSlb表達水平。
2.一種判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於由三個獨立包裝或組合包裝的試劑盒組成RNA提取試劑盒、RT-PCR反應試劑盒和實時定量PCR反應試劑盒，依次使用三個試劑盒能檢測出胃癌組織中miR-21和miR-181b的含量。
3.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於RNA提取試劑盒含有Trizol 試劑、氯仿、異丙醇、顯色劑、乙醇和無核酸酶水。
4.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於RNA提取試劑盒含有Trizol 試劑 0. 8-1. 2ml、氯仿 500-700ul、異丙醇 400_600ul、顯色劑 0. 5_2ul、75% 乙醇 0. 5_2ml 和無核酸酶水5-20ul。
5.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於RNA提取試劑盒含有Trizol 試劑1. 05ml、氯仿600ul、異丙醇500ul、顯色劑lul、75%乙醇Iml和無核酸酶水IOul0
6.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於RT-PCR試劑盒含有dNTPs， 逆轉錄酶，逆轉錄緩衝液，RNA酶抑制劑，miR-21和/或miR-181b特異性逆轉錄引物和無核酸酶水。
7.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於RT-PCR試劑盒含有 IOmMdNTPs 0. 15ul，50U/ul 逆轉錄酶 Iul，10 倍濃度 PH7. 5 的逆轉錄緩衝液 1. 5ul，20U/ul RNA酶抑制劑0. 19ul，購自Applied Biosystem的5倍濃度miR-21和/或miR_181b特異性逆轉錄引物3ul和無核酸酶水4. 16ul。
8.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於實時定量PCR反應試劑盒含有I1aqMan通用PCR總混合物、無核酸酶水和miR-21和/或miR_181b特異性PCR引物， TaqMan通用PCR總混合物中含有DNA聚合酶、UNG酶、含dUTP的dNTPs、內參、緩衝液。
9.權利要求2的判斷胃癌治療療效的試劑盒，其特徵在於實時定量PCR反應試劑盒含有TaqMan 2倍濃度通用PCR總混合物10ul、無核酸酶水7. 67ul和購自Applied Biosystem 的20倍濃度miR-21和/或miR-181b特異性PCR引物Iul。
10.權利要求2的試劑盒的使用方法a、使用RNA提取試劑盒1)、用移液器將樣本反覆吹打混勻，各吸取樣本350ul到兩個1.5ml離心管中，向其中一管加入Ing的RNA作為陽性對照；2)、加入1.05mlTrizol，振蕩5min，混勻，分為兩管；3)、各加入600ul氯仿再振蕩5min；4)、室溫靜置5min，13200rpm離心lOmin，取800ul上層有機相到新的離心管；5)、加入500ul異丙醇和Iul顯色劑，上下顛倒管子，-20°C冰浴濁；6),2h後，取出冰浴樣本，4°C，13200rpm離心lOmin，棄上清，可見離心管底有藍色沉澱；7)、加Iml75%乙醇，上下顛倒離心管，13200rpm離心5min棄上清；8)、再離心lmin，用槍頭吸去上清；9)、放通風櫃，晾乾；10)UOul無核酸酶水溶解，_80°C保存；b、使用RT-PCR試劑盒1)、將IOmMdNTPsO. 15ul，逆轉錄酶Iul，10倍濃度PH7. 5的逆轉錄緩衝液1. 5ul，20U/ uIRNA 酶抑制劑 0. 19ul，購自 Applied Biosystem 的 5 倍濃度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特異性逆轉錄引物:3ul、無核酸酶水4. 16ul、5ul RNA試劑盒提取的樣品混勻瞬離，分裝，加入對應的模板混勻，再加入無核酸酶水至總體系為15ul ；2)、將步驟1的材料在普通PCR儀上進行逆轉錄，16°C保持30min，42°C保持30min， 85°C保持5min，4°C保持過夜；3)、取步驟2中的材料20ul，繼續在普通PCR儀上反應，a)95°C保持lOmin，b)55°C保持 2min，c)72°C保持 2min，d)95°C保持 15 秒，e)60°C保持 4min, f)重複步驟 d)、e) 12 次， g)99. 0°C 保持 IOmin ；C、使用實時定量PCR試劑盒1)將IOulTaqMan2倍濃度通用PCR總混合物、7. 67ul無核酸酶水、Iul購自 AppliedBiosystem 的 20 倍濃度 miR-21 和 / 或 miR_181b 特異性 PCR 引物、RT-PCR 試劑盒獲得的miRNA逆轉錄產物稀釋5倍後的產物1. 33ul混勻；2)在普通PCR儀上反應，a)95°C保持lOmin，b)95°C保持15秒，c)60°C保持60秒，d) 重複步驟b)、c) 45次，g) 4°C保存待檢測。
全文摘要
本發明涉及一種胃癌治療療效判斷的方法、試劑盒及其使用方法。通過檢測胃癌組織中miR-21和/或miR-181b表達水平可以判斷治療方案是否合理。試劑盒由三個獨立包裝或組合包裝的試劑盒組成RNA提取試劑盒、RT-PCR反應試劑盒、實時定量PCR反應試劑盒，依次使用三個試劑盒最終能檢測出胃癌石蠟組織或者胃癌組織中miR-21和miR-181b的含量。該試劑盒的的使用將協助胃癌的臨床管理，有助於篩選哪些胃癌患者將從治療中獲益，從而避免對無應答胃癌患者的毒性、降低病人的醫療成本。
文檔編號C12Q1/68GK102230006SQ20111015637
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者吳昌平, 蔣敬庭, 鄭曉, 鞠景芳 申請人:吳昌平, 蔣敬庭, 鄭曉, 鞠景芳