水稻斑馬葉突變基因zebra15及其編碼的蛋白和應用的製作方法

2023-06-08 06:56:51

水稻斑馬葉突變基因zebra15及其編碼的蛋白和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15及其編碼的蛋白和應用，水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15的核苷酸序列如SEQ?ID?No.12所示，胺基酸序列如SEQ?ID?No.13所示，與野生型相比水稻斑馬葉突變基因ZEBRA15在第3個外顯子上第64鹼基由G轉換為A，並導致第22位的編碼胺基酸由甘氨酸變異為天冬氨酸，該基因突變後的水稻zebra15突變體在苗期至分櫱期間，當出現氣溫在短時期內驟降驟升時，植株的葉片表現是斑馬葉性狀，通過雜交發現該性狀為隱性性狀，因此能夠利用此性狀選育新品種和種子純度鑑定，對水稻的遺傳育種具有重要意義。
【專利說明】水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15及其編碼的蛋白和應用 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,還涉及該基因 編碼的蛋白質和應用。 【背景技術】
[0002] 水稻（Orvza sativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有近半數的人 口以稻米為主食。雜交水稻的種植，顯著提高了水稻的產量，從以前的每畝200-300斤，到 現在的每畝800斤，與第二次綠色革命一起差不多解決了全球的糧食危機，為保障國家乃 至世界糧食安全作出了巨大貢獻。然而種子純度是制約雜交稻發揮更大作用的重要制約因 子。近年來因雜交水稻種子不純而給農民造成的損失越來越嚴重。這一問題已引起政府、 專家的高度重視。兩系法雜交水稻的種子生產，近幾年均出現過重大損失。1999年湖南曾 因遭遇低溫造成2萬畝制種大部分失敗，損失超過千萬元。2002年長江流域8月份的低溫， 又嚴重損害了兩系雜交稻種子生產。但是鑑定雜種種子純度一直沒有理想的技術方法已成 為我國種子產業發展的制約因素。利用苗期標記性狀進行作物雜種一代新品種選育和種子 純度鑑定，能在苗期通過觀察標記性狀的存在或消失與否來識別真假雜種，從而達到能及 早識別剔除雜種或非雜種株、實現親本和雜交種種子純度雙重排雜、加強種子質量監督、大 大降低種子鑑定費用、保證田間品種純度、增產節支等目的。該項技術直觀準確，簡便快速， 具有一般的異地種植鑑定和DNA分子標記鑑定技術無法比擬的優越性。近年來在作物育種 及種子純度鑑定上的研究應用也越來越受到重視。前人已做了大量的工作，也取得了可喜 的成績，成功選育了一些帶標記的不育系，如紫葉標記不育系紫S、白化轉綠型葉色標記不 育系玉兔S和NHR111SA。但由於多數苗期標記性狀單系本身性狀不優良、常導致其它重要 農藝性狀顯著降低，利用時都需要進行一個雜交轉育過程以克服不良性狀的遺傳累贅，實 現優異性狀的聚合，這個過程往往非常困難，都要通過大量長期的轉育才能實現。因而，發 現一些穩定遺傳、葉色變異對其它性狀尤其產量、品質性狀沒有顯著影響的葉色突變非常 重要。
【發明內容】

[0003] 有鑑於此，本發明的目的之一在於提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,該基因為苗 期標記性狀，並且對其他主要農藝性狀無顯著影響，為水稻轉基因研究提供有力的工具，促 進雜交稻育種研究；本發明的目的之二在於提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼的蛋白 質；本發明的目的之三在於提供水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15的應用。
[0004] 為實現上述目的，本發明利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優良恢復系縉恢10 號獲得一個遺傳穩定的水稻"斑馬葉"突變體，在遺傳分析和基因定位的基礎上，先通過 基因預測、同源搜索及基因序列差異比較，初步確定了水稻斑馬葉突變性狀為ZEBRA15隱 形基因控制，ZEBRA15為類受體蛋白激酶（0s05gl2680)。隨後，本發明以水稻斑馬葉突變 體zebral5為材料，克隆了水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,具有如SEQ ID No. 12所示的核 苷酸序列，開放閱讀框為2028bp，由8個外顯子組成，編碼675個胺基酸，其胺基酸序列如 SEQ ID No. 13所示。與野生型縉恢10號相比，突變基因 ZEBRA15在第3個外顯子上第64 鹼基有G-A的轉換，並導致第22位的編碼胺基酸序列發生甘氨酸（Glycine)到天冬氨酸 (L-Aspartic-acid)的變異，突變位點位於催化域PKc。植物類受體蛋白激酶（RLK)是植物 體內信號分子的重要受體，已被證明參與植物生長發育及對環境刺激應答反應等多種信號 的轉導過程，在植物生命活動中發揮著多種重要的生物學功能。當植物受到脅迫時，RLK能 識別和接受生物或非生物刺激的信號物，通過可逆磷酸化轉導信號，誘導防禦反應。
[0005] 然後，然後構建功能互補載體並轉化zebral5突變體（G95)。經鑑定轉基因陽性植 株葉片變綠，完全恢復為野生型葉型。進一步確定水稻斑馬葉性狀由ZEBRA15基因突變引 起，因此水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15能夠用於在水稻斑馬葉性狀的分子育種。
[0006] 本發明的有益效果在於：本發明提供了水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,該基因為 苗期標記性狀，對其他主要農藝性狀無顯著影響，為水稻遺傳育種研究提供了有力的工具， 為選育純種不育系奠定基礎。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0008] 圖1為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15基因的遺傳和物理圖譜（A為ZEBRA15的初 定位區間在第5染色體長臂SSR標記RM3322和RM6082間；B為將ZEBRA15基因精細定位 在標記nSSR516與nSSR502間25kb的範圍內；C為所在區域BAC克隆；D為突變體ZEBRA15 的候選基因0sl0g40960. 1的結構及突變位置）。
[0009] 圖2為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳鑑定（其 中1泳道為PLAS5000DNA Marker，2泳道為野生型縉恢10號的RT-PCR產物，3泳道為突變 體 zebral5 的 RT-PCR 產物）。
[〇〇1〇] 圖3為水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼蛋白類受體蛋白激酶的胺基酸序列結構 域分析。
[0011] 圖4為ZEBRA15基因編碼蛋白的進化樹分析結果。
[0012] 圖5為互補重組載體構建圖。
[0013] 圖6為ZEBRA15突變體互補表型分析，其中wt為野生型，zebral5為斑馬葉突變 體，c-zebral5為斑馬葉突變體zebral5轉野生型ZEBRA15基因陽性植株。 【具體實施方式】
[0014] 以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0015] 本發明實施例中使用的材料：野生型水稻材料縉恢10號（wt)和斑馬葉突變體 (zebral5)，均由本實驗室培育；M-MLV逆轉錄酶、高保真DNA聚合酶PFU、Taq DNA聚合 酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、pMD19-T載體、Trizol試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質 粒提取試劑盒、λ-Hind III DNA Marker 及 DL5,000DNA Marker 購自 TaKaRa 公司；DNA Marker III購自天根生化科技（北京）有限公司；氨節青黴素（Ampicillin，Amp)和卡拉 黴素（Kanamycin，Kan)為Sigma公司產品；引物合成和DNA測序由上海英俊生物技術有 限公司完成；其它化學試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司；大腸桿菌DH5 α、農桿菌 LBA4404由本實驗室保存。
[0016] 實施例1、水稻斑馬葉突變體zebral5的獲得和形態學觀察 [〇〇17] 利用甲基磺酸乙酯（EMS)誘變自育優良恢復縉恢10號獲得一個遺傳穩定的水稻 "斑馬葉"突變體，命名為zebral5。水稻"斑馬葉"突變體zebral5,在苗期至分櫱期間，當 出現氣溫在短時期內驟降驟升時（即V型變化），植株的葉片即會出現有規律的垂直於葉脈 的淡黃色（嚴重時為白色）與綠色相間的斑馬紋，葉鞘部分表現為正常綠色。待溫度穩定回 升一段時間後，該表型即會緩慢恢復為正常綠色。當溫度反覆出現這種V型變化時，"斑馬 紋"突變表型會反覆出現。表明突變體 zebral5可能主要響應極端溫、光變化，進而影響光 保護系統而形成斑馬葉。該性狀經過多代觀察，表現穩定遺傳，並且其他主要農藝性狀（如 產量、品質性狀）沒有顯著降低。
[0018] 實施例2、突變zebral5基因遺傳分析與定位
[0019] 以zebra-15突變體為父本，秈稻品種西農lA(XinonglA)為母本雜交獲得Fi代植 株葉片全部表現為正常綠色，然後通過自交獲得4350株F 2代群體中，依據斑馬葉性狀分離 出了突變葉片和正常葉片兩種表型，分離出1054株突變單株，其餘為正常株，可以看出正 常株與突變株符合3 :1的分離比例，表明該突變性狀由一對隱性單基因控制。
[0020] 初步定位：選取均勻分布於水稻12條染色體上的480對SSR引物，在親本 zebra-15和西農1A間檢測多態性，其中有98對SSR引物顯示多態性。用這98對引物在正常 和突變基因池中進行基因連鎖分析，篩選與基因 Zebra-15連鎖的SSR標記，發現Zebra-15 與第5染色體短臂上標記RM3322和RM6082連鎖。用連鎖標記RM3322和RM6082分析150 株隱性突變單株，結果顯示，基因 Zebra-15與標記RM3322和RM6082之間的遺傳距離分別 為 19. 6cM 和 6. OcM (圖 1A)。
[0021] 精細定位：根據已公布的秈稻品種93-11序列，在標記RM3322和RM6082間進一步 篩選和開發了 36對SSR引物，其中有4對在親本間表現多態性（表1)。用這4對引物分析所 有1054株突變單株，結果表明：標記nSSR511、nSSR516、nSSR502和RM169與基因 Zebra-15 之間的遺傳距離分別為8. 6cM、0. lcM、l. OcM和1. OcM(圖1B)。最終Zebra-15被定位在標 記nSSR516和nSSR502之間約258kb (此為93-11序列上的長度，日本晴上為288kb)的範 圍內，此區間包括三個BAC克隆：AC108498、AC137001和AC146716(圖1C)。
[0022] 表1、4對具有多態性的SSR標記序列
[0023]
【權利要求】
1. 水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15,其特徵在於：核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示。
2. 權利要求1所述水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15編碼的蛋白質，其特徵在於：胺基酸 序列如SEQ ID No. 13所示。
3. 權利要求1所述水稻斑馬葉突變基因 ZEBRA15在水稻斑馬葉性狀的分子育種中的應 用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於：所述水稻為縉恢10號。
【文檔編號】C12N15/82GK104087603SQ201410319603
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】趙芳明, 何光華, 施軍瓊, 王秋實, 桑賢春, 凌英華, 李雲峰, 王楠, 楊正林 申請人:西南大學