一種用於結核病預防的新型疫苗的製作方法

2023-06-07 17:02:11 4

專利名稱：一種用於結核病預防的新型疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域和新型結核疫苗領域，具體涉及一種重組的卡介苗。
背景技術：
結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌引起的一種傳染病，近年來隨著流 動人口增加、人類免疫缺陷病毒(HIV)與結核桿菌伴發感染以及結核桿菌多重耐藥性菌株 的出現，使全球結核病疫情增高，給全球結核病的防治提出了新的挑戰。卡介苗(Bacille CalmetteGuerin,BCG)是目前唯一用於預防結核病的疫苗，但是其免疫保護效果極不穩定， 不同地區的人群接種BCG後其免疫保護作用差異很大(保護率為0-80%不等)，開發比BCG 更為有效的抗結核病疫苗已成為當今迫切需要解決的問題。但目前尚沒有任何一種新型疫 苗能完全替代BCG免疫，因此對卡介苗進行分子改造，研製更為安全有效的新型抗結核病 疫苗具有重要意義。BCG作為一種活疫苗，應用於免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾 滋病患者等)有較大的局限性，而將外源基因導入卡介苗構建重組卡介苗(rBCG)是TB疫 苗改造的重要方向之一，通過BCG的生長繁殖，在體內表達保護性抗原，從而更有效地激發 機體免疫應答，增強BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入編碼MTB 30kD主要分泌 型和細胞外蛋白(Ag85B)的質粒來觀察rBCG的效力，發現rBCG均能穩定表達這種蛋白分 子，與親本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠儘管體重變化不明顯，但動物存活率和組 織抑制細菌生長的能力均超過BCG，已計劃開始進行I期人體試驗。Bao構建了兩株分別表 達Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG誘導更高滴度的特異性抗 體和更強烈的細胞免疫應答，而後者的免疫原性與親本BCG株相似，兩株rBCG的毒力未見 增強，都能明顯抵禦MTB感染，但免疫保護效力方面尚低於BCG。培養濾液蛋白10 (culture filtrate proteinlO, CFP10)是從結核分枝桿菌短期 培養的濾液中分離的一種低分子質量蛋白質，與ESAT6均由RD (Regions of deletion, RD) 1 區的RV3875和RV3874基因編碼，該區只存在於結核分枝桿菌複合群和少數致病性分枝杆 菌基因組中，所有BCG菌株基因組中均缺乏該區域，是BCG減毒傳代過程中最先缺失的一段 區域，與結核分枝桿菌毒力和抗原性相關，能被宿主免疫系統高度識別。CFP10能有效刺激 機體產生特異性細胞免疫應答，可以誘發PPD皮膚試驗陽性者的外周血單個核細胞出現增 殖反應並產生IFN-y，繼而活化巨噬細胞，提高巨噬細胞對胞內結核菌的生長抑制作用和 殺傷能力，可望成為新疫苗研製的主要候選分子。機體對結核病的免疫主要通過ra4+T、細胞等的細胞免疫來完成，BCG是一 種強的CD4+T細胞型免疫應答誘導劑，但它誘導MHCI類限制性CD8+T細胞的作用較弱， 這可能是BCG的主要缺陷之一，而細胞可通過多種機制在宿主防禦結核桿菌感染 和潛伏感染中發揮重要作用。粒-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factorGM-CSF)是一種能夠刺激粒細胞、巨噬細胞形成集落的細胞因 子，可調控粒細胞、單核/巨噬細胞的分化、增殖和存活，激活單核_巨噬細胞、釋放炎性介 導因子，殺死某些微生物和腫瘤，在造血調控和免疫調節中發揮重要作用。GM-CSF在體內外都能影響巨噬細胞的活性，促進樹突狀細胞發育，作為免疫佐劑已廣泛應用於免疫學領 域。例如用抗原-GM-CSF融合蛋白和轉染GM-CSF基因的腫瘤細胞進行免疫；利用GM-CSF 作為佐劑的動物模型試驗均表明，GM-CSF能增強感染的免疫原性。由於GM-CSF能誘導強 的CD8+T細胞反應，可以彌補卡介苗功能上的缺陷，選擇其作為佐劑與結核分枝桿菌免疫優 勢抗原CFP10共同轉入卡介苗，構建能表達人GM-CSF和結核分枝桿菌CFP10蛋白的重組卡 介苗可能具有更好的免疫原性和保護力，對今後結核新疫苗的開發、發病機制的研究及結 核病的防治有重大意義。

發明內容
1、本發明的目的是提供一種重組卡介苗的製備方法。根據Genbank中報導的hGMCSF和CFP10基因CDS序列設計引物，分別擴增hGMCSF 和 CFP10 基因，用 S0E 法(重疊延伸，Gene splicing by overlap extension)進一步擴增 GMCSF-CFP10嵌合基因，將此嵌合基因與大腸桿菌-結核分支桿菌穿梭質粒PMV361同時雙 酶切插入穿梭質粒的多克隆位點處，構建重組穿梭質粒rpMV361GMCSF-CFP10，先用卡那黴 素篩選陽性重組子，再用PCR、酶切及基因序列分析進行鑑定。PCR、酶切及測序結果均顯示， 在穿梭質粒PMV361中插入了一個735bp的特異性片段，與預期的GMCSF-CFP10嵌合基因大 小一致，重組穿梭表達載體構建成功。將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍後，迅速轉移至37°C預熱的Sauton培養基中， 放入37°C培養箱靜置培養4-5周，待菌膜長出，直至菌體恢復正常生長狀態，菌體呈白色或 略帶黃色，有皺褶並覆蓋整個培養基液面，將其轉種並擴大培養，待菌膜覆蓋滿液面後用於 電轉化。將測序正確的重組質粒rpMV361GMCSF-CFP10用電轉化的方法轉入至感受態BCG 中，構建rBCG:GMCSF-CFP10重組卡介苗。通過卡那黴素篩選陽性重組子，一方面提取重組 卡介苗的基因組行PCR鑑定，另一方面，通過熱誘導的方法，用小鼠抗hGM-CSF單克隆抗體 進行Western-blot分析，觀察其蛋白表達水平。以提取具有卡那黴素抗性的重組BCG菌 的基因組為模板，經PCR擴增出735bp的目的片段，證明重組質粒pMV GMCSF-CFP10已成功 轉化進BCG菌；重組BCG經熱誘導後，菌體裂解液上清用小鼠抗CFP10單克隆抗體為一抗， HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，經ECL顯色後顯示在27kDa左右出現一特異性的條帶，和目 的蛋白的預期分子量吻合，而PMV361空質粒電轉化組(rBCG:361)未出現陽性條帶，表明重 組BCG可以表達GMCSF-CFP10外源目的蛋白，重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構建成功。2、本發明的另一個目的是提供一種效果優於目前市售卡介苗的重組卡介苗。取6周齡的BALB/C小鼠32隻(雌雄不限)，每組8隻，隨機分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組，各組適應性飼養1周後，於背部皮下多點分別注射 PBST、BCG 及 rBCG(5X106CFU/ 只，用 PBST 稀釋成 0. lmL)，共免疫 1 次。免疫後 6、8、10、12 周四個時間點各組隨機抽取小鼠2隻，摘眼球取血，分離血清，檢測各組小鼠血清特異性抗 體滴度。同時無菌分離脾臟，收集脾淋巴細胞，經臺盼藍染色後細胞計數，活細胞數在90% 以上，調整細胞密度為2X106/L進行下述實驗(1)特異性脾淋巴細胞增殖試驗分離培養的脾細胞加入96孔圓底培養板，每組 小鼠脾細胞做6個復孔，並設陰性對照孔和調零孔，試驗孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不 加特異性蛋白，調零孔不加淋巴細胞。於37°C 5% C02培養68小時後加入XTT再培養4h，
4用酶標儀測定A450吸光值，結果用刺激指數表示，SI =刺激組/非刺激組。
(2)細胞因子的誘生上述分離培養的脾細胞加入24孔圓底培養板(0. 5mL/孔)， 每組小鼠脾細胞做3個復孔，25mg/L TB-PPD刺激72h後，收集培養液上清，按ELISA檢測試 劑盒說明書測定IFN- y和IL-4水平。(3)流式細胞術檢測T淋巴細胞⑶4+及⑶8+細胞亞群脾淋巴細胞轉入6孔板， 每組做3個復孔(lmL/孔)，同時加入25mg/L TB-PPD刺激，培養72h後，加入PE螢光素標 記的抗小鼠CD4+和FITC標記的⑶/抗小鼠一抗，流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面⑶/及 ⑶/細胞亞群所佔比例。結果顯示，免疫後6、8、10、12周rBCG: 361組和卡介苗組各時間點血清總抗體滴度 相差不明顯，而rBCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高於rBCG:361組和卡介苗 組，在第8周達到高峰，然後逐漸降低，但仍然高於卡介苗組和rBCG:361組；各免疫組脾淋 巴細胞增殖活性均較PBST組明顯升高，在第10周時達到最高，rBCG:361組和卡介苗組比 較，刺激指數差異不顯著，而rBCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞增殖活性顯著高於卡介苗組 和rBCG:361組；各免疫小鼠脾淋巴細胞上清IFN- y水平均較PBST明顯升高，10周達到高 峰，rBCG:GMCSF-CFP10組IFN- y含量顯著高於卡介苗組和rBCG:361組；各組IL-4濃度均 維持在較低水平，各組間無顯著性差異；卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組 小鼠脾淋巴細胞CD4+T細胞較PBST組相比均有增高的趨勢，在免疫後10周達到最高，其中， 卡介苗組和rBCG:361組CD4+T細胞的比例相當，而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組CD4+T 細胞比例在各個時間點明顯高於其它各組，重組BCG:GMCSF-CFP10組小鼠脾淋巴細胞
細胞比例自免疫8周就明顯增加，至12周達到最高，在各個時間點CD8+T細胞比例均顯著高 於其它組。體液免疫反應和細胞免疫反應均提示重組BCG:GMCSF-CFP10免疫原性強於BCG。本發明的疫苗具有以下優勢1、重組表達了人GM-CSF和結核分枝桿菌免疫優勢抗原CFP10。2、將人GM-CSF基因與CFP10通過基因工程技術融合在一起。3、能穩定的在卡介苗中表達外源蛋白GMCSF-CFP10。4、重組疫苗的免疫原性優於傳統卡介苗。


圖1為hGMCSF基因、CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的PCR圖。1，DNA分子 量標準；2，hGMCSF 條帶；3，CFP10 條帶；4，GMCSF-CFP10 條帶。圖2為rpMV361 GMCSF-CFP10的PCR及酶切鑑定圖。1，DNA分子量標準；2，PCR鑑 定；3，pMV361 空質粒雙酶切；4，rpMV GMCSF-CFP10 單酶切；5，rpMV361 GMCSF-CFP10 雙酶 切。圖 3 為 rBCG:GMCSF-CFP10 基因組 PCR 鑑定圖。1，DNA 分子量標準；2，GMCSF-CFP10條帶。圖4為pMV361的質粒圖譜。圖 5 為 Western-blot 檢測 rBCG:GMCSF_CFP10 細胞裂解液中 GMCSF-CFP10 蛋 白表達圖。1，rBCG:361菌體蛋白Western-blot檢測。2，rBCG:GMCSF_CFP10菌體蛋白 Western-blot 檢測。
圖6為血清特異性抗體滴度IgG。圖7 為血清 IgG2a/IgGl。圖8為免疫小鼠脾淋巴細胞增殖反應。圖9為脾淋巴細胞培養上清中IFN- Y水平。圖10為免疫小鼠脾淋巴細胞⑶4細胞百分比。圖11為免疫小鼠脾淋巴細胞⑶8細胞百分比。圖12為免疫小鼠脾淋巴細胞亞群分析。1，PBST組；2，BCG組；3，rBCG:361組；4， rBCG:GMCSF-CFP10 組。
具體實施例方式1、以pORF-hGMCSF質粒和結核分枝桿菌H37Rv基因組序列為模板，根據發表的人 粒_巨噬細胞集落刺激因子CDS序列和結核分枝桿菌H37Rv株CFP10基因序列分別設計人 GM-CSF和CFP10基因的引物，複製人GM-CSF和結核分枝桿菌CFP10基因。2、通過基因工程手段，將克隆的人GMCSF和CFP10基因末端加上連接肽段，獲得 GMCSF-CFP10嵌合基因。3、將嵌合基因轉入pMV361穿梭質粒，構建rpMV361 GMCSF-CFP10重組質粒。4、提取重組質粒，分別進行PCR、酶切及測序鑑定。5、運用電轉化的方法將重組質粒轉入卡介苗，構建重組卡介苗GMCSF-CFP10。6、用卡那黴素進行初步篩選。7、提取重組卡介苗的基因組並進行PCR鑑定。8、通過熱誘導的方法誘導重組卡介苗表達蛋白並用Western-blot的方法鑑定。9、分別用重組卡介苗、傳統卡介苗和PBS免疫小鼠，觀察並分析各組小鼠的體液 免疫和細胞免疫反應。實施例實施例1 hGMCSF-CFPIO嵌合基因重組卡介苗的構建、表達與鑑定1 材料1. 1菌株及質粒BCG上海株由成都生物製品研究所提供，質粒PMV361由本室保存，pORF_hGMCSF質 粒購自Invitrogen公司。1. 2主要試劑prime STAR HS DNA 聚合酶、dNTP、DNA 連接試劑盒是 Takara 公司產品；EcoR I、 HindHI及蛋白分子量標準購自晶美公司；Omega質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒及 膠回收試劑盒、細菌基因組提取試劑盒購自寶信生物；CFP10單克隆抗體為Abeam公司產 品；HRP酶標羊抗鼠IgG和ECL顯色試劑盒購自北京中杉公司。1. 3主要儀器PCR儀、電轉儀購自百樂公司，低溫冰箱購自三洋公司。2 方法2. 1人GM-CSF和結核分枝桿菌CFP10基因的PCR擴增根據Genbank中報導的hGMCSF和CFP10基因⑶S序列設計2對引物，引物序列為
6hGMCSF 上遊5，-CG GAATTC ACATGTGGCTGCAGAGCCTG-3，，hGMCSF 下遊5，-GTCTTCATCTCTGCC ATCTCCTGGACTGGCTCCC-3』,上遊黑體字是EcoR I的酶切位點，下遊刪除終止密碼子TGA，下 劃線部分是含有17個鹼基的linker序列。CFP10上遊5』-GGGAGCCAGTCCAGGAGATGGCAGAGA TGAAGAC-3，，CFP10 下遊5，_GC AAGCTT TCAGAAGCCCATTTGCG-3，，上遊下劃線部分是含有 17 個鹼基互補的linker序列，下遊黑體字是Hind III的酶切位點。以pORF_hGMCSF質粒和結 核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，分別PCR擴增hGMCSF基因和CFP10基因。hGMCSF 基因 PCR 擴增體系總體積為 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L(dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 lOmmoL/L)，pORF-hGMCSF 質粒 DNA 1 u L, hGMCSF 基因上下遊引物各 1 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U，去離子水 32. 5 ii L。PCR 反應條件如下95°C 預變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C復性45秒，72°C延伸1分鐘，30個循環，72°C延伸10 分鐘。CFP10 PCR 擴增體系總體積為 50ii L，5Xprime STAR Buffer 10 u L, dNTP 4u L, H37Rv 株基因組DNA 1 ii L，CFP10 基因上下遊引物各 1 ii L，prime STAR HS DNAPolymerase 1U，去離子水32. 5ii L，PCR反應條件同上，擴增得到下遊帶linker的hGMCSF基因和上遊帶 linker 的 CFP10 基因。2. 2GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增與純化取設計的hGMCSF基因上遊引物1 P L，CFP10基因的下遊引物1 P L，以上述擴增的 hGMCSF 和 CFP10 的 PCR 產物各 1 u L 為模板，dNTP 4 u L, 5 X prime STAR Buffer 10 u L, prime STAR HS DNA Polymerase 1U,去離子水 31. 5 ii L，總體積 50 ii L，用 S0E 法擴增 GMCSF-CFP10嵌合基因。PCR反應條件95°C預變性5分鐘，94°C變性45秒，68°C復性1分 鍾，72°C延伸1分30秒，30個循環，72°C延伸10分鐘。將GMCSF-CFP10嵌合基因PCR產物 用柱式膠回收試劑盒純化，具體實驗步驟參照說明書。2. 3 重組質粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的構建用質粒提取試劑盒提取PMV361空質粒，和上述GMCSF-CFP10嵌合基因純化產物分 別用EcoR I和Hind III進行雙酶切，反應體系為:pMV361空質粒5 y L，5 X Tango buffer 4u L, EcoRI 0. 5u L, Hind III0. 5u L,總體積 20 u L ；GMCSF-CFP10 嵌合基因 PCR 純化產物 5u L,5XTangobuffer 4u L, EcoR I 0. 5 u L, Hind III0. 5 ii L，總體積 20 ii L。反應條件 37°C水浴5小時。純化空質粒和PCR產物的雙酶切產物，按照PCR 空質粒濃度比1 10 的比例混合，再加入等體積的連接試劑，輕輕混勻後，16°C連接3小時。取5 y L連接液加入 至50 ii L DH5a感受態菌液中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42 °C水浴靜置90秒，取出迅速轉入 至冰浴中2分鐘，加入不含抗生素的LB液體培養基250P L，37°C緩慢振搖60分鐘，取轉化 後的菌液100 u L鋪於含卡那黴素50 u g/mL的LB平板上，37°C過夜培養。2. 4 重組質粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑑定隨機挑取3個生長菌落分別接種於5mL LB液體培養基中(含卡那黴素50 u g/ mL)，37°C振搖過夜，提取質粒後電泳初步觀察質粒DNA大小。取較空質粒略大者進行PCR 鑑定，其中陰性對照以PMV361為模板，待檢樣本則以含有插入片段的重組質粒DNA為模板 進行PCR擴增，引物為hGMCSF上遊和CFP10下遊，PCR反應體系及循環參數同前述，另一方 面用EcoR I和Hindlll雙酶切消化，電泳檢測有無插入片段及其大小。初步鑑定重組質粒 插入片段大小與預期相符後，將重組質粒送至Invitrogen公司進行DNA序列分析，測序引 物分別為hGMCSF上遊和CFP10下遊。
2. 5 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的構建將-70°C凍存的BCG菌株快速解凍後，迅速轉移至37°C預熱的Sauton培養基中， 放入37°C培養箱靜置培養4-5周，待菌膜長出，直至菌體恢復正常生長狀態，菌體呈白色或 略帶黃色，有皺褶並覆蓋整個培養基液面，將其轉種並擴大培養，待菌膜覆蓋滿液面後用於 電轉化。37°C靜置培養於Sauton培養液約20天的卡介苗於轉化前加入甘氨酸至終濃度為 4%,繼續培養24小時。用無菌玻璃珠振搖3小時以打碎菌膜。冰浴1小時後，4000rpm 4°C 離心10分鐘集菌，菌團用預冷的10%甘油洗滌4次後重懸於10%甘油中。取200 y L菌液 加入10 ii L重組質粒，冰浴30分鐘，轉入預冷2mm電穿孔杯中，在2. 5KV/cm, 25 u F，720 Q 條件下電轉化。放電完畢後立即冰浴10分鐘，輕柔加至10mL Sauton培養液中，37°C靜置 培養。待長出菌膜後轉入含20 u g/mL卡那黴素的Sauton培養液中，於37°C繼續靜置培養 3 4周。2. 6 重組卡介苗 rBCG:GMCSF-CFP10 的鑑定待菌膜長滿液面後，離心集菌，依據基因組提取試劑盒提取重組卡介苗總DNA，以 其為模板按前述擴增條件，分別以hGMCSF上遊和CFP10下遊為引物，進行PCR擴增。含外源 基因的重組卡介苗在Sauton培養液(含20 y g/mL卡那黴素)中靜置培養兩周，迅速加入 等體積53°C的Sauton培養液，置45°C水浴熱誘導30分鐘。5000rpm離心15分鐘集菌。菌 體用冰預冷的PBS(pH7.2)洗滌2次，振蕩混勻，超聲波裂解菌體40分鐘，-20°C備用。根據 Laemmli等介紹的方法，依次灌制12%的分離膠5mL和5%的濃縮膠2mL，待膠完全凝固後， 將上述製備的蛋白樣品及蛋白質分子量標準各取10 y L上樣於梳齒孔中進行電泳，先80V 穩壓電泳至分離膠，再120V電泳至結束。電泳完畢後，剝下凝膠塊，先剪與凝膠塊相同大小 的2張濾紙和1張硝酸纖維素膜。連同凝膠塊一起浸入轉移電泳緩衝液(25mmoL/L Tris, 0. 2moL/L氨基乙酸，20%甲醇)中浸泡30分鐘，然後在BR10592型半乾轉移裝置的陽極 板上依次平鋪濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、濾紙，蓋上陰極板，接通電源，於10V穩壓電泳45 分鐘；取出硝酸纖維素膜，將膜置5%脫脂奶粉中封閉1小時後用TTBS(10mM/L Tris-HCl, 150mmoL/L NaCl,0. 05% Tween20, pH7. 5)室溫輕搖洗滌3X5分鐘，然後浸入含小鼠抗 CFP10單克隆抗體(1 1000)的一抗中於室溫孵育2小時，TTBS洗膜3X5分鐘，浸入含辣 根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(l 5000)的二抗稀釋液中，室溫孵育1小時；TTBS洗 膜3X5分鐘，ECL顯色，觀察嵌合蛋白在卡介苗中的表達。3 結果3. 1人GM-CSF基因、結核分枝桿菌CFP10基因和GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增以設計的GM-CSF基因上下遊為引物，通過PCR方法從p0RF_hGMCSF質粒獲得 449bp的人GM-CSF基因片段(不含終止密碼子)，以CFP10基因上下遊為引物，從結核分枝 桿菌標準株H37Rv基因組DNA中獲得320bp的結核分枝桿菌CFP10基因，以GM-CSF基因上 遊、CFP10基因下遊為引物，GM-CSF和CFP10基因為模板，擴增得到735bp的特異性片段，與 預期的GMCSF-CFP10嵌合基因大小一致(見圖1)。3. 2 重組質粒 rpMV361GMCSF-CFP10 的鑑定以抗生素篩選陽性重組子提取的質粒為模板，以GM-CSF基因上遊、CFP10基因下 遊為引物進行PCR擴增，同時用EcoR I.Hindi 11雙酶切該重組質粒，均證實有大小為735bp 的目的片段插入PMV361質粒(見圖2)，測序結果和GenBank中人GM-CSF基因、結核分枝杆
8菌CFP10基因序列比對，均100%匹配，表明重組質粒構建成功。3. 3重組BCG的PCR鑑定以提取具有卡那黴素抗性的重組BCG菌的基因組為模板，經PCR擴增出735bp的 目的片段，證明重組質粒pMV GMCSF-CFP10已成功轉化進BCG菌(圖3)。3. 4重組BCG表達產物的Westrn-blot分析重組BCG經熱誘導後，菌體裂解液上清用CFP10單克隆抗體為一抗，HRP標記的 羊抗鼠IgG為二抗，經ECL顯色後顯示在27kDa左右出現一特異性的條帶，和目的蛋白的 預期分子量吻合，而空質粒電轉化組(rBCG:361)未出現陽性條帶，表明重組BCG可以表達 GMCSF-CFP10外源目的蛋白(見圖5)，重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10構建成功。4 結論運用分子生物學技術成功構建能表達hGMCSF-CFPIO外源蛋白的重組卡介苗 BCG:GMCSF-CFP10。實施例2重組卡介苗rBCG:GMCSF_CFP10免疫原性研究1 材料1. 1實驗動物BALB/C小鼠購自四)I丨大學華西校區實驗動物中心。1. 2主要試劑IFN- y、IL-4ELISA檢測試劑盒購自R&D公司，PE標記的CD4和FITC標記的CD8抗 小鼠一抗購自eBioscience公司，RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司。1. 3主要儀器FACSCalibur 流式細胞儀(BD Biosciences)，酶標儀(Bio-Rad)。2 方法2. 1動物免疫取6周齡的BALB/C小鼠32隻(雌雄不限)，每組8隻，隨機分為PBST組、BCG組、 rBCG:361組和rBCG:GMCSF_CFP10組，各組適應性飼養1周後，於背部皮下多點分別注射 PBST (含 0. 05 % Tween80)、BCG 及 rBCG (5 X 106CFU/ 只，用 PBST 稀釋成 0. lmL)，共免疫 1 次。 免疫後觀察動物注射部位有無紅腫、潰瘍、化膿等，同時觀察動物皮毛、精神狀態、飲食及大 小便。2. 2血清特異性抗體水平檢測免疫後6、8、10、12周四個時間點各組隨機抽取小鼠2隻，摘眼球取血，待血液固體 成分凝結固縮，離心吸取血清，分裝後-70°C凍存備用。用TB-PPD標準品(lOOyL/孔)包 被酶標板，4°C避光過夜。PBST洗滌，5%脫脂奶粉封閉90分鐘，再次洗滌後依次加入2倍 系列稀釋的待檢血清，37°C溫育90分鐘，洗板後分別加入1 1000稀釋的HRP酶標記羊抗 鼠IgG、IgGl和IgG2a，再次37°C溫育90分鐘，洗板，加入底物液(含0. 4mg/mL鄰苯二胺的 0. 05M磷酸鹽-檸檬酸緩衝液，pH5. 0，臨用前加5uL 30% H202/10mL) 100 u L/孔，室溫避 光15-30分鐘。加入50 u L/孔H2S04(2M)終止反應，于波長490nm測定吸光度。實驗中以 PBST組為空白對照、以rBCG-361及BCG組血清為陰性對照，以結核病人血清作為陽性對照 (1 100稀釋)，檢測各組小鼠血清特異性抗體滴度。結果以雙復孔A值均值表示，當A值 > 0. 05，A實驗組/A對照組> 2. 0時，判為陽性，以出現陽性反應的最高稀釋度作為該樣本
9的抗體滴度。2. 3脾淋巴細胞分離免疫後6、8、10、12周各組隨機抽取2隻小鼠，無菌分離脾臟，同組脾臟混合後，用 玻璃勻漿器研磨，經200目篩網過濾，PBS洗滌1-2次，加入0. 83%NH4C1溶液(0. 15M NH4C1, 10mMNaHC03, ImM EDTA_Na2)混勻後靜置5分鐘以裂解紅細胞，1500rpm離心5分鐘，收集細 胞，加入含10% FBS和雙抗的RPMI1640，經臺盼藍染色後細胞計數，活細胞數在90%以上， 調整細胞密度為2X106/L進行後續實驗。2. 4特異性脾淋巴細胞增殖試驗(XTT)將上述分離培養的脾細胞加入96孔圓底培養板(0. lmL/孔)，每組小鼠脾細胞做 6個復孔，並設陰性對照孔和調零孔，試驗孔加入25mg/L TB-PPD,對照孔不加特異性蛋白， 調零孔不加淋巴細胞。於37°C 5 % C02培養68小時後加入XTT (含lmg/mL XTT和0. 125mmoL/ L PMS)再培養4h，用酶標儀測定A450吸光值，結果用刺激指數表示，SI =刺激組/非刺激組。2. 5細胞因子的誘生將上述分離培養的脾細胞加入24孔培養板(0. 5mL/孔)，每組小鼠脾細胞做3個 復孔，25mg/L TB-PPD刺激72h後，3000rpm離心5分鐘收集培養液上清，_70°C凍存備用，按 ELISA檢測試劑盒說明書測定IFN-Y和IL-4水平。根據標準品各孔的0D值及其所對應的 標準品含量繪製標準曲線，然後根據待測樣品孔0D值從標準曲線上求出樣本中IFN-Y和 IL-4的含量。採用方差分析對各組的測得值進行差異顯著性分析，P < 0. 05為具有統計學
眉、o2. 6流式細胞術檢測T淋巴細胞⑶/及細胞亞群將上述分離培養的小鼠脾淋巴細胞轉入6孔板，每組做3個復孔(lmL/孔)，同時 加入25mg/L TB-PPD刺激，培養72h後，3000rpm離心5分鐘收集細胞，用PBS洗滌2次，細胞 懸液加入PE螢光素標記的抗小鼠CD4+和FITC標記的CD8+抗小鼠一抗(eBioscience)，4°C 避光 30min，再用 PBS_BSA_NaN3 (含 2% BSA 和 0. 5% NaN3 的 PBS)洗滌 2 次，再加入 400 u L PBS-BSA-NaN3，流式細胞儀檢測T淋巴細胞表面⑶/及細胞亞群所佔比例。3 結果3. 1血清特異性抗體滴度測定rBCG:361組和卡介苗組在各時間點血清抗體滴度相差不明顯(P > 0. 05)，而重組 BCG:GMCSF-CFP10組免疫小鼠的抗體滴度明顯高於rBCG:361組和卡介苗組，在8周時達到 高峰，然後逐漸回落，但仍顯著高於卡介苗組和rBCG: 361組(P 0. 05)，而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞增殖活性顯著高於卡介
10苗組和 rBCG:361 組(P 0.05)，而重組BCG:GMCSF-CFP10組脾淋巴細胞IFN-y產生顯著高於卡介苗組和 rBCG:361組(P < 0.05)(見圖9)。而各組細胞因子IL-4在各時間點產生均不明顯，未達 到試劑盒檢測的最低濃度，0D值維持在0. 015左右。3. 4免疫小鼠脾淋巴細胞亞群的變化卡介苗組、rBCG:361組和重組BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細胞CD4+T細胞與 PBST組相比均有增高的趨勢，在免疫後10周達到最高，其中，卡介苗組和rBCG: 361組
細胞的比例相當(P > 0. 05)，而重組卡介苗rBCG:GMCSF-CFP10組細胞比例明顯高於 PBST組、卡介苗組rBCG: 361組(P < 0. 05)(見圖10) ；BCG:GMCSF_CFP10組小鼠脾淋巴細胞 細胞比例在各時間點也顯著高於其它組，至12周細胞比例達到最高(P < 0. 05) (見圖 11，12)。4 結論共表達人GMCSF和結核分枝桿菌CFP10外源蛋白的重組卡介苗rBCG GMCSF-CFP10 免疫原性優於傳統卡介苗，為研製具有特異性抗結核桿菌免疫保護和佐劑增強雙重效應的 新型重組BCG疫苗奠定了基礎。
權利要求
一種重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10，其特徵在於，能夠穩定的表達GMCSF-CFP10嵌合蛋白。
2.如權利要求1所述的重組卡介苗，其特徵在於，免疫原性強於傳統卡介苗。
3.如權利要求1所述的重組卡介苗的製備方法，其特徵在於，該方法包括以下幾個步驟(1)hGM-CSF基因的擴增、結核分枝桿菌CFPlO基因的擴增；(2)GMCSF-CFP10嵌合基因的擴增；(3)將GMCSF-CFP10嵌合基因插入至大腸桿菌-結核分枝桿菌穿梭質粒pMV361中，構 建rpMV361GMCSF-CFP10 ；(4)將(3)中的重組質粒電轉化入卡介苗。
4.如權利要求1所述的重組卡介苗，其特徵在於，通過抗生素篩選、提取基因組、PCR及 誘導表達後進行Western-blot鑑定，得到rBCG :GMCSF_CFP10。
5.一種重組質粒，其特徵在於，用基因工程技術將人粒_巨噬細胞集落刺激因子 (hGM-CSF)序列和結核分枝桿菌CFPlO基因序列嵌合後插入大腸桿菌-結核分枝桿菌穿梭 質粒序列中。
6.如權利要求5所述的重組質粒，其特徵在於，大腸桿菌_結核分枝桿菌穿梭質粒為 PMV361。
7.如權利要求5所述的重組質粒，其特徵在於，將人GM-CSF基因序列和結核分枝桿菌 CFPlO基因序列連接後插入大腸桿菌_結核分枝桿菌穿梭質粒的多克隆位點處。
8.如權利要求5所述的重組質粒，其特徵在於，用PCR、酶切和測序鑑定，得到重組質粒 rpMV361GMCSF-CFP10。
9.如權利要求1所述的重組卡介苗，其特徵在於，將如權利要求5所述的重組質粒電轉 化入卡介苗，得到rBCG :GMCSF-CFP 10。
全文摘要
本發明涉及一種人GM-CSF基因與結核分枝桿菌CFP10基因嵌合表達GMCSF-CFP10蛋白重組卡介苗的構建及其免疫原性研究，即利用基因工程技術將人GM-CSF基因和結核分枝桿菌CFP10基因序列插入到同一大腸桿菌-結核分枝桿菌穿梭質粒pMV361的序列中，構建重組穿梭質粒rpMV361GMCSF-CFP10。然後採用電穿孔的方法將上述載體導入卡介苗，構建重組卡介苗rBCGGMCSF-CFP10。本發明構建的重組卡介苗可以穩定的表達人GM-CSF與結核分枝桿菌CFP10嵌合蛋白GMCSF-CFP10，其免疫原性優於傳統卡介苗。本發明提供了一種重組卡介苗的製備過程，並研究了其免疫性，屬於基因工程領域和結核疫苗領域。本發明將更有效的預防結核病的發生及傳播。
文檔編號C12N15/63GK101850111SQ201010140350
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月7日 優先權日2010年4月7日
發明者楊曉玲, 鄧儀昊, 鮑朗 申請人:四川大學