一種可用於藍白篩選的多功能的ta克隆載體系統及其用途

2023-06-08 03:53:11

一種可用於藍白篩選的多功能的ta克隆載體系統及其用途
【專利摘要】本發明通過調整編碼框架的方法，構建一種多功能的TA克隆載體系統。與常規商品化TA載體相比，本發明TA克隆時的假陽性和假陰性率降低；載體自連現象明顯改善。本發明更具有創造性的用途是，可提供插入序列後菌落由藍變白和由白變藍兩種選擇，其中由白變藍的選擇能達到假陽性和假陰性均低於1％。其次，本載體可用於腫瘤相關基因移碼突變的微小病變檢測，這是目前市場具有這一功能的獨家產品；且本載體能用於反因子蛋白酶TALENs有效性的檢測。
【專利說明】-種可用於藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統及其用 途

【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術。通過調整編碼框架的方 法，構建三種TA克隆載體。與常規商品化TA載體相比，除保留了由藍變白的篩選之外，增 加了由白變藍的新選擇，可用於微小突變的檢測和反因子核酸酶活性的檢測。

【背景技術】
[0002] 目前，分子生物學實驗中大多數克隆載體都是經人工構建的，基本上都帶有可供 選擇的遺傳標誌或表型特徵。藍白斑篩選（β_半乳糖苷酶系統）是較常用的篩選標記。
[0003] 此類載體攜帶lacZ'基因，它編碼β_半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），並且處於 誘導物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，與乳糖結構類似但不能被β-半乳糖苷酶降 解）誘導的啟動子調控之下。質粒轉化的宿主菌為LacZΛΜ15基因型（含有編碼N-末端 缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質粒轉化宿主菌後，在IPTG的誘導下，質 粒與宿主菌分別表達缺陷但可以相互補償的兩個肽（即α-互補），形成了有功能的β-半 乳糖苷酶，該酶能把培養基中無色的X-gal(5-溴-4-氯-3-H引哚-β-D-半乳糖苷）底物 分解成半乳糖和深藍色的5-溴-4-氯-靛藍，菌落呈現藍色。但當外源DNA插入質粒位於 α-肽編碼序列中的多克隆位點時，由於破壞了α-肽的閱讀框架，使其編碼的α-肽失去 活性，則重組子所在的細菌不能完成α互補，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重組 菌形成白色菌落。因此，可以藉助藍白斑篩選出重組子.
[0004] 儘管藍白斑篩選應用了三十餘年，但假陽性和假陰性率仍然很高。SlilatySN和 LebelS. [1]研究證明，藍白斑篩選的載體，通常將插入位點放在LacZ基因的起始密碼子 ATG到第7個胺基酸密碼子之間。但如果將插入位置改變到LacZ基因的第11-36個胺基酸 密碼子之間，那麼就可以完全消除假陽性和假陰性。GenomicsOne公司正是利用了他們的 研究結果開發出TrueBlue技術，同樣是藍白斑篩選，但準確率可達100%。不過實際操作中 仍出現一定程度的假陽性和假陰性。
[0005] 為了解決現有技術中存在的上述缺陷，本發明由此而來。


【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種高效率和多功能的TA克隆載體體系。該載 體體系的優點是既能採用由藍變白的選擇方式，又能採用由白變藍的選擇方式，降低了假 陽性和假陰性的發生，除能用於克隆PCR產物外，還能用於微小病變的檢測，能用於反因子 核酸酶活性的檢測等。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案為，一種可用於藍白篩選的多功能的TA 克隆載體系統，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質粒組成；其中，pMD19-JZ3 的基因序列為SeqNo. 3，pMD19_JZ2的基因序列為SeqNo. 2,其中鹼基N選自A，T，C，G; PMD19-JZ1的基因序列為SeqNo. 1，其中鹼基N選自A, T，C，G。
[0008] 本發明的優選技術方案中，質粒體pMD19-JZ3為本身閱讀框未發生移碼的載體； 質粒體pMD19-JZ2為本身閱讀框因增加了二對鹼基發生移碼的載體；質粒體pMD19-JZ1 為本身閱讀框因增加了一對鹼基發生移碼的載體。
[0009] 本發明的優選技術方案中，PMD19-JZ2的基因序列為SeqNo. 2,第433位鹼基N為 g,第434位鹼基N為t;pMD19-JZl的基因序列為SeqNo. 1，第433位鹼基N為t。
[0010] 本發明的第二方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體 系用於亞克隆，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三個質粒 體組成；其中，PMD19-JZ3的基因序列為SeqNo. 3,pMD19-JZ2的基因序列為SeqNo. 2， PMD19-JZ1的基因序列為SeqNo. 1。
[0011] 本發明的第三方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體 系用於用於微小病變的基因檢測，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和PMD19-JZ1三個質粒體組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為SeqNo. 3,pMD19-JZ2的基因 序列為SeqNo. 2,pMD19_JZl的基因序列為SeqNo. 1。
[0012] 在大量實驗的基礎上，我們發現一個現象：應用TrueBlue技術的藍白斑篩選載 體，插入片段小於IOObp時，若插入片段是3的整數倍則菌落呈藍色；若是3的非整數倍則 菌落呈白色。在分子生物學實驗中，常需要將擴增的PCR產物進行克隆。Taq酶是最早發現 的可用來進行PCR反應的DNA聚合酶，該酶的一個重要特點是在產物的3'末端以不依賴 於模板的方式摻入A鹼基，導致PCR產物不能以平末端的方式克隆，而需要用特殊的載體 即T載體進行克隆。T載體作為一種克隆PCR產物的有效工具，因其3'末端帶有突出的T 鹼基，可直接與PCR擴增產物3'末端突出的A鹼基配對，因此大大提高了PCR產物與載 體的連接效率。
[0013] 由於現有T載體僅僅採用由藍變白這樣一種選擇，而實際結果是有些藍色菌落 含有插入序列，另一些白色菌落為空載體。本產品發明以常用的PMD19-Tvector為基礎 改建，構建了含有3種載體的TA克隆載體體系--分別命名為pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和 PMD19-JZ1，與常規的TA克隆載體相比，本發明TA克隆時的假陽性和假陰性率降低；載體 自連現象明顯改善。
[0014] 本發明的技術方案是：
[0015] 本產品由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三個質粒體組成TA克隆載體系 統；其中的質粒體PMD19-JZ3為本身閱讀框未發生移碼的載體；質粒體pMD19-JZ2為本身 閱讀框因增加了二對鹼基發生移碼的載體；質粒體PMD19-JZ1為本身閱讀框因增加了一對 鹼基發生移碼的載體。（序列見表1)
[0016] 上述三種載體的共同特徵是均為雙鏈線性DNA，且具有三末端一個胸腺嘧啶鹼基 突出（見表1)。這種含有三末端突出T的載體分子，用於亞克隆時，能與低保真DNA聚合酶 的PCR產物中含有三末端突出腺嘌呤的片段形成互補的粘性接頭，在DNA連接酶作用下，克 隆效率高於平末端。由於本產品所含三個質粒體的共性，因此均能用於亞克隆（見應用例 1，2, 3)。通過使用Pfu作為對照，應用例1，2, 3還同時表明，本產品體系對於高保真DNA聚 合酶產生的平末端產物克隆效率極低。（圖1，AtagBpfu)
[0017] 表 1
[0018]

【權利要求】
1. 一種可用於藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和 PMD19-JZ1三種質粒組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為Seq No. 3, pMD19-JZ2的基因序 列為 Seq No. 2, pMD19_JZl 的基因序列為 Seq No. 1。
2. 根據權利要求1所述的多功能的TA克隆載體體系，其特徵在於，質粒體pMD19-JZ3 為本身閱讀框未發生移碼的載體；質粒體PMD19-JZ2為本身閱讀框因增加了二對鹼基發生 移碼的載體；質粒體PMD19-JZ1為本身閱讀框因增加了一對鹼基發生移碼的載體。
3. 根據權利要求1或2所述的多功能的TA克隆載體體系，其特徵在於，pMD19-JZ2的 基因序列為Seq No. 2,第433位鹼基n為g，第434位鹼基n為t ;pMD19-JZl的基因序列 為Seq No. 1，第433位鹼基n為t。
4. 一種可用於藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統用於亞克隆，其中，TA克隆載體體 系由PMD19-JZ3, pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質粒組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為 Seq No. 3, pMD19-JZ2 的基因序列為 Seq No. 2, pMD19-JZl 的基因序列為 Seq No. 1。
5. -種可用於藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統及其用途用於微小病變的基因檢 測，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3, pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質粒組成；其中， PMD19-JZ3的基因序列為Seq No. 3，pMD19_JZ2的基因序列為Seq No. 2，pMD19_JZl的基因 序列為Seq No. 1。
【文檔編號】C12N15/66GK104357472SQ201410659108
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】李凱, 潘韻芝 申請人:蘇州大學