禽源啟動子表達載體及其構建方法與應用的製作方法

2023-07-04 04:00:56

專利名稱：禽源啟動子表達載體及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及禽源啟動子表達載體及其構建方法與應用。
背景技術：
真核表達載體是分子生物學研究中最常用的表達載體之一。目前最常用的是哺 乳動物源啟動子的蛋白表達載體，可以在哺乳動物細胞高效表達蛋白。我國是養禽 業大國，養禽業的發展也促進了對禽類生產、疾病預防與控制等領域的研究，尤其 是抗病育種逐漸被提到日程上來。由於目前尚缺少禽源啟動子的蛋白表達載體，難 以在禽類體內或細胞中進行高效表達外源基因。並且，目前使用的真核表達蛋白載
體構建表達外源基因的載體的過程是通過傳統的連接方法連接的，通過T4DNA連接 酶將載體與目的片段連接成一個完整的質粒。傳統的這種酶切的連接方法存在步驟 比較煩瑣，成本高，連接效率較低等問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種禽源啟動子表達載體及其構建方法與應用。
本發明所提供的禽源啟動子表達載體，命名為pAPP-Vector,是一種環狀載體， 包含原核複製起點、 一個真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒；所述外 源基因表達盒自上遊至下遊依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號； 所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1-607位；所述連接 片段含有EcoRV識別序列。
其中，所述真核複製起點可為任何現已知的真核生物進行DNA複製的起始點， 具體可為SV40病毒複製起點。所述多聚腺苷酸加尾信號可為具有終止轉錄作用的 所有DNA片段，具體可為牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核複製起始 位點可為任何現已知的原核生物進行DNA複製的起始點，具體可為大腸桿菌質粒 CoIEl複製起始位點。
pAPP-Vector的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1。
用EcoRV酶切所述禽源啟動子表達載體得到的線性載體也屬於本發明的保護 範圍。
本發明的另一個目的是提供所述禽源啟動子表達載體的構建方法。
4本發明所提供的所述禽源啟動子表達載體的構建方法，包括如下步驟
1) 以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5' v4<^r67TCT7T<XT(%^Ca^r^^^^ 3'和5' fA47TO^(^6^Z4ra:7r6^6CATGCATCTAG 3'進行PCR擴增，得到片段A;
2) 以pCDNA3. 0質粒為模板，用如下引物5， Cmfi4M7TfgC7TCAGCACAC 3'和5' 6r0^7^"76^0;C46K4A^A4C4 7^7 3'進行PCR擴增，得到片段B;
3) 將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和 片段B連接，獲得重組載體pA;
4) 以重組載體pA為模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC J，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG ，進行PCR擴增，得到片段D;
5) 以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC < ，或5，
CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC J， 進行PCR擴增，得到片段C;
6) 將片段C和片段D導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和 片段D連接，獲得重組載體pAP-SV40;
7) 以REV病毒DNA為模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC
3，和5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3， 進行PCR擴增，得到片
段F;
8) 以重組載體pAP-SV40為模板，用如下引物5' TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，和5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，進行PCR擴增，得到片段E;
9) 將片段E和片段F導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段E和 片段F連接，得到所述的載體。
本發明所述禽源啟動子表達載體可作為出發載體，構建在禽類細胞或哺乳動物 細胞中表達蛋白的重組表達載體。
以本發明的pAPP-Vector為出發載體構建的表達綠色螢光蛋白的重組表達載 體，可以在禽類細胞或哺乳動物細胞中高效表達綠色螢光蛋白。以pAPP-Vector為 出發載體利用同源重組構建重組表達載體，避免了傳統的酶切，連接等環節，整個 構建過程中不使用內切酶與連接酶，且比傳統的連接過程省略了2-3個步驟，連接 的效率也較理想。使用本發明的pAPP-Vector構建表達外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經濟、高效，可以快速完成大量外源基因的表達載體的構建。將在轉
基因動物研究中發揮重要作用。


圖1為pAPP-Vector的結構示意圖。 圖2為螢光顯微鏡下觀察螢光蛋白的表達結果。
具體實施例方式
下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑 獲得。
實施例1、 pAPP-Vector的構建 1) pA的構建
設i十弓l物pA Vectorl上遊禾口 pA Vectorl下f遊、pA Vector2上訪,禾口 pA Vector2 下遊，弓l物pA Vectorl上i遊禾口 pA Vectorl下幼字、pA Vector2上幼,禾口 pA Vector2 下遊的序列如下
pA Vectorl上遊5' JC4r677nT7Ta^(^<X6t7^C^(^ 3，；
pA Vectorl下遊5' fi^nC7^C4(24Z47r67r^6CATGCATCTAG 3'。
pA Vector2上遊5' OT(S4■ m:AGCACAC 3'(劃線部分為
EcoR V酶識別位點)；
pA Vector2下遊5， 070^7^fO^(T(^6K4^6^4C47Z r 3'。
以pEGFP-Nl (Invitrogen)質粒為模板，用引物pA Vectorl上遊和pA Vectorl
下遊PCR擴增片段A;以pCDNA3. 0質粒為模板，用引物pA Vector2上遊和pA Vector2
下遊PCR擴增片段B。
PCR反應體系10XPCR Buffer 5HL，上遊、下遊引物各l叱，DNA模板1叱，
MgC12 (25mM) 3叱，dNTPs (各2. 5raM) 3叱，Pfu-Taq (5U/I40 0. 5A，最後補水至
50PL。
反應條件94。C熱變性5min; 94。C變性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸6min， 共30個循環；72。C最後延伸10min。
PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
50pl感受態細胞中加入片段A和B後混勻，片段A和B質量比為100 ng: 500 ng。混勻後體系冰浴30 min。 42"水浴熱激90秒，然後冰上放置3 min，加入預 熱的LB培養基900 nl，置於37。C下，180rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液體
6培養基重懸菌體，取200 pl重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37 。C培養 12 h。挑取單克隆提取質粒，該質粒命名為pA。
2) pAP-Vector的構建
設計引物SV (40)上遊和SV (40)下遊、pAP Vector (l)上遊和pAP Vector (1)
下遊，序列如下
SV (40)上遊5， GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCCJ，；
SV (40)下遊5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTCJ，。
pAP Vector (l)上遊5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3，；
pAP Vector (l)下遊5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3，。
以pEGFP-Nl質粒為模板，用引物SV (40)上遊和SV (40)下遊PCR擴增片段
C;以pA質粒為模板，用引物pAP Vector (1)上遊和pAP Vector (l)下遊PCR擴
增片段D。
PCR反應體系10XPCR Buffer 5叱，上遊、下遊引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2 (25 mM) 3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3唚，Pfu-Taq(5 U/叱)0.5叱，最後補 水至50 PL。
反應條件94。C熱變性5 min; 94。C變性45 s， 53 。C退火45s， 72 。C延伸6 min， 共30個循環；72 。C最後延伸10 min。
PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
5(^1感受態細胞中加入片段C和D後混勻，片段C和D質量比為100ng: 500ng。 混勻後體系冰浴30 min。 42。C水浴熱激90秒，然後冰上放置3 min，加入預熱的 LB培養基900 pl，置於37。C下，200 rpm振搖90 min，收集菌體，用LB液體培 養基重懸菌體，取200 pl重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37i:培養16h。 挑取單克隆提取質粒，該質粒命名為pAP-SV40。
3) pAPP-Vector的構建
設計引物PAPP上遊和PAPP下遊、LTR上遊和LTR下遊，引物序列如下 pAPP上遊5， TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3，； pAPP下遊5， GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3，。 LTR上遊5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3'; LTR下遊5， CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3，。 以pAP-SV40質粒為模板，用引物pAPP上遊和pAPP下遊PCR擴增片段E;以REV病毒(Reticuloendotheliosis. In: Saif, Y. M. ， Barnes, J. ， Glisson， J.， Macdougal， L. ， Swayne， D. (Eds.) ， Diseases of Poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, pp. 517 - 535.)(中國農業大學)的DNA為模板，用引物LTR上遊 和LTR下遊PCR擴增片段F。
PCR反應體系10XPCR Buffer 5叱，上遊、下遊引物各1叱，DNA模板1叱， MgCl2(25 raM) 3叱，dNTPs(各2.5 mM) 3叱，Pfu-Taq (5U/WJ 0.5叱，最後補水 至50 HL。
反應條件94 。C熱變性5 rain; 94 。C變性45 s， 53 。C退火45 s， 72 。C延伸 6 rain，共30個循環；72 。C最後延伸10 min。
PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
50pl感受態細胞中加入片段E和F後混勻，片段E和F質量比為100ng: 500ng。 混勻後體系冰浴30min。 42。C水浴熱激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB 培養基90(^1，置於37。C下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重 懸菌體，取200pl重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37。C培養12h。挑取單 克隆提取質粒，該載體命名為pAPP-vector, pAPP-vector圖譜如圖1所示。
挑取單克隆提取質粒，將pAPP-vector測序，測序結果表明，pAPP-vector的核 苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5'末端第1-607位為LTR啟動子，自5 '末端第692-698位為EcoRV酶的識別序列，自5'末端第670-1023位為BGH Ploy A，，自5'末端第1024-1205位為SV40 Origin,自5'末端第1224-1843位為大 腸桿菌質粒CoIEl複製起始位點，自5'末端第1844-3001位為氨苄青黴素抗性基 因。序列1的自5'端第695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位 的核苷酸序列為能與外源基因上的PCR擴增產物發生同源序列重組的序列。
實施例2、 pAPP-vector表達蛋白的能力
1)表達綠色螢光蛋白的pAPP-EGFP-Vector的構建
設計引物EGFP上遊和EGFP下遊，引物序列如下
EGFP上遊GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG;
EGFP下遊ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。
引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列為能與序列1的自5'端第 695-710位的核苷酸序列和序列1的自5'端第711-726位的核苷酸序列發生同源重 組的序列。
8以pEGFP-Nl為模板，用引物EGFP上遊和EGFP下遊PCR擴增EGFP基因片段。 反應體系10XPCR Buffer 5唚，上遊、下遊引物各1叱，DNA模板1叱，
MgCl2(25 raM)3叱，dNTPs(各2. 5 mM) 3叱，Pfu-Taq (511/叱)0.5叱，最後補水
至50 PL。
反應條件94 r熱變性5 min; 94 。C變性45 s， 50 °(3退火45 s， 72 。C延伸 1 min，共30個循環；72 。C最後延伸10 min。
PCR產物用DNA回收試劑盒回收，方法參考其說明書。
pAPP-Vector用EcorV內切酶酶切線性化，回收線性化的pAPP-Vector。
酶切體系如下
10XD bufferlO(il， BSA l|il， EcoR V 2 u 1 (20U PR0MEGA公司)，pAPP-Vector 50ul，補水至100nl， 37° C酶切過夜。
酶切產物在1XTAE配製的瓊脂糖凝膠中電泳，120v，電泳30分鐘，DNA回收
試劑盒回收目的片段。
感受態細胞中加入線性化的pAPP-Vector和上述PCR擴增的EGFP基因片 段後混勻，線性化的pAPP-Vector和EGFP基因片段質量比為lOOng: 500ng。混勻 後體系冰浴30min。 42"C水浴熱激90秒，然後冰上放置3min，加入預熱的LB培養 基900)al，置於37"下，180rpm振搖90min，收集菌體，用LB液體培養基重懸菌 體，取200(il重懸液塗布LB板上(含有氨苄青黴素)，37'C培養12h。挑取單克隆 提取質粒，該質粒命名為pAPP-EGFP-Vector。 2)綠色螢光蛋白的的檢測
取10 ul lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)加入到250 ul的0PTI-MEMI 培養基(Invitrogen公司)中，室溫放置5分鐘，獲得溶液1;將5ug pAPP-EGFP-Vector質粒加入到250 ul的0PTI-MEMI培養基中，獲得溶液2;將溶 液1和2混合，室溫孵育20分鐘，再加入500 ul的OPTI-MEMI培養基，得到溶液 3。
將雞胚成纖維細胞(CEF細胞)(北京實驗動物研究中心)和293T細胞分別置 於6孔細胞板中培養，等待細胞長至60。/。時將細胞用PBS洗滌兩次，然後分別加入 溶液3， 37"C孵育5個小時，分別吸出溶液3，加入新鮮的OPTI-MEMI培養基，繼 續培養。培養24h後，在螢光顯微鏡下觀察螢光蛋白的表達情況。
以轉染pAPP-Vector質粒的CEF細胞作為對照。螢光顯微鏡結果如圖2所示，表明pAPP-EGFP-Vector轉染後24小時的CEF細 胞和293T細胞有較強的螢光信號，而對照沒有螢光，說明pAPP-EGFP-Vector質粒 可以在CEF細胞與293T表達綠色螢光蛋白。
圖2中，A為pAPP-EGFP-Vector轉染的293T細胞，B為pAPP-EGFP-Vector轉 染的CEF細胞，C為對照。
上述實驗結果說明，pAPP-Vector載體可作為出發載體，構建在禽類細胞或哺 乳動物細胞中表達蛋白的重組表達載體。formula see original document page 11attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 960
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 1020
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgatcc cgcccctaac tccgcccagt 1080
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 1140
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 1200
tgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gc犯aaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1260
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 1320
aagtcagagg tggcgaa^cc cgacaggact ataaagatac caggcgtttx cccctggaag 1380
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 1440
cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 1500
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 1560
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 1620
agcagccact ggt犯cagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagt1:ctt 1680
gaagtggtgg cct犯ctacg gctacactag aagggLcagta tttggtatct gcgctctgct 1740
gaagccag"tt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 1800
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 1860
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 1920
agggatt"ttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 1980
atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 2040
cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 2100
actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 2160
aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 2220
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aaaacgttct tcggggcgaa肌ctctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccag"ttcgat 2760
gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttxacca gcgtttctgg 2820
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ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttat"tgaagc atttatcagg gttattgtct 2940
catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaagLaataaa caaatagggg ttccgcgcac 3000
atttccccga aaagtgccac ctgacgtcca aaagcctagg cctcca犯犯agcctcctca 3060
1權利要求
1、一種環狀載體，包含原核複製起點、一個真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒；所述外源基因表達盒自上遊至下遊依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號；所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述連接片段含有EcoRV識別序列。
2、 根據權利要求1所述的載體，其特徵在於所述真核複製起點為SV40病毒復 制起點。
3、 根據權利要求1或2所述的載體，其特徵在於所述多聚腺苷酸加尾信號為 牛生長激素基因多聚腺苷酸加尾序列。
4、 根據權利要求3所述的載體，其特徵在於所述原核複製起始位點為大腸桿菌質粒CoIEl複製起始位點。
5、 根據權利要求4所述的載體，其特徵在於所述載體的核苷酸序列為序列表 中的序列1。
6、 一種線性的載體，是用EcoRV酶切權利要求l至5中任一所述的載體得到的 線性載體。
7、 權利要求5所述載體的構建方法，包括如下步驟1) 以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5' ^^7^770T7ra^ar(^CZ4^6^ 3' 和5' 6^776T60fi4Z47trr0^6CATGCATCTAG 3'進行PCR擴增，得到片段A;2) 以pCDNA3. 0質粒為模板，用如下引物5' Cr6mW7TTgCUMTiXAGCACAC 3'和5' arr67^^7(%^< 6M6K4A4(X^<^7^r 3'進行PCR擴增，得到片段B;3) 將片段A和片段B導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段A和片 段B連接，獲得重組載體pA;4) 以重組載體pA為模板，用如下引物5， GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC < ，和5， GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG < ，進行PCR擴增，得到片段D;5) 以pEGFP-Nl質粒為模板，用如下引物5' GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC T或5， CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC ， 進行PCR擴增，得到片段C;6) 將片段C和片段D導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段C和片 段D連接，獲得重組載體pAP-SV40;7) 以REV病毒DNA為模板，用如下引物5， GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3，和5，CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3 ， 進行PCR擴增，得到片段F;8) 以重組載體pAP-SV40為模板，用如下引物5'TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3,和5，GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC 3，進行PCR擴增，得到片段E;9) 將片段E和片段F導入大腸桿菌感受態細胞中，通過同源重組將片段E和片段F連接，得到權利要求5中所述的載體。
8、權利要求1至5中任一所述的載體在禽類細胞或哺乳動物細胞中表達蛋白的應用。
全文摘要
本發明公開了一種禽源啟動子表達載體及其構建方法與應用。該禽源啟動子表達載體是一種環狀載體，包含原核複製起點、一個真核複製起點、篩選標記基因和外源基因表達盒；所述外源基因表達盒自上遊至下遊依次含有LTR啟動子、連接片段和多聚腺苷酸加尾信號；所述LTR啟動子的核苷酸序列為序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述連接片段含有EcoRV識別序列。使用本發明的pAPP-Vector構建表達外源基因的重組載體的過程簡便、快速、經濟、高效，可以快速完成大量外源基因的表達載體的構建。將在轉基因動物研究中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK101481703SQ20091007638
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月14日 優先權日2009年1月14日
發明者傅光華, 劉芹防, 劉金華, 畢玉海, 娟 蒲, 馬婧姣 申請人:中國農業大學