含有益生的異麥芽-寡糖的穀物組合物及其製造和應用方法

2023-07-03 20:01:56

專利名稱：：含有益生的異麥芽-寡糖的穀物組合物及其製造和應用方法
技術領域：
：本發明描述了含有異麥芽寡糖(isomalto-oligosaccharides)的穀物組合物及其製造方法。該方法包括從穀物中含有的澱粉衍生異麥芽寡糖。
背景技術：
：異麥芽寡糖(「IMOs」)是混合的鍵接寡糖(mixedlinkageoligosaccharides),含有1，4α和/或1，6α糖苷鍵的混合物。它們也被稱為不規則連接寡糖(「ALOs」)。異麥芽寡糖包含大量的分支寡糖，如異麥芽糖、4-α-葡糖基麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、異4-α-葡糖基麥芽糖和更加高度分支的寡糖。存在對含有IMOs的產品的市場需求。IMO產品以粉末形式或者液體形式出售，這取決於所打算的用途。潛在的用途是在食品領域。IMO產品的例子是調味品(蛋黃醬、醋、湯底等)，甜食(糖果、口香糖、巧克力、冰激凌、果子露、糖漿)，水果和蔬菜加工食品(果醬、柑橘醬、水果沙司、醃菜)，肉類或者魚類食品(火腿、香腸等)，焙烤食品(麵包、蛋糕、曲奇、酥皮糕點)，預先烹熟的食物(色拉、煮熟的豆等)，罐裝和瓶裝食品、方便食品(速溶咖啡、速溶蛋糕酒底(instantcakebase)等)，和飲料,既包括含酒精的飲料(酒精飲料、seju、果酒、日本米酒、啤酒[國際公布號WO02/20712A1]，等)又包括不含酒精的飲料(咖啡、果汁、蜜汁飲料、充氣飲料或者碳酸飲料、檸檬水、可樂)。異麥芽寡糖可以進一步用作動物飼料和寵物飼料中的成分。非食物的應用領域是化妝品和藥物(香菸、口紅、牙膏、內服藥等)。異麥芽寡糖屬於被歸類為功能健康食品寡糖(「FHF0」)的一類寡糖。代表性的MOs包括果糖-寡糖、半乳糖-寡糖、木糖-寡糖和龍膽-寡糖(gentio-oligosaccharides)。當IMOs被規則地每日口服時，與之相聯繫的是人類和動物的綜合健康狀態的增進，IMOs被歸類為「益生質(prebiotics)」。益生質被定義為不易消化的物質(例如，食物纖維)，其通過選擇性刺激存在於腸道或者在治療中被導入腸道的有益微生物的生長或者生物活性，對人類施加一些生物學效應。(PrzemyslawJanTomasikandPiotrTomasik.2003AmericanAssociationofCerealChemists,Inc.80(2):113-117)。寡糖的「益生(prebiotic)」作用是增加大腸中雙歧桿菌(bifidobacteria)和乳酸桿菌(Iactobacilli)("益生質")的數量，和降低腐敗細菌(putrifactivebacteria)的濃度。雙歧桿菌與一些促進健康的性質有關，例如抑制病原體生長，這是通過形成酸或者是通過抗微生物活性實現的。它們也和這一類的種種效應有關，如調節免疫系統(抗腫瘤性質)，降低甘油三酯和膽固醇水平，生成維生素(B族)，降低血氨濃度，防止易位，抗菌治療後恢復正常的腸道菌群，產生消化酶，減少與抗生素相關的副作用(KohmotoT.,FukuiF.，TakakuH.,MachidaY.，etal.,BifidobacteriaMicroflora,7(2)(1988)，61-69；KohmotoK.，TsujiK.，KanekoT.，ShiotaM.，etal.，Biosc.Biotech.Biochem.，56(6)(1992)，937-940；KanekoT.，KohmotoT.，KikuchiH.，FukuiF.，etal.，NipponNogeikagakuKaishi，66(8)(1992)，1211-1220，ParkJ-H,Jin-YoungY.，Ok-HoS.,Hyun-KyungS.，etal.，Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，20(3)(1992)，237-242)。Modler，H.W.，1992，"CompoundswhichenhancethegrowthofPrebioticBacteria"，presentedattheInternationalRoundtableonAnimalFeedBiotechnology,Ottawa,Ontario，Canada。異麥芽寡糖是應用D-葡糖基轉移酶(E.C.2.4.I.24，轉葡糖苷酶，a-葡糖苷酶)，通過酶催化的轉葡糖基反應(transglucosylationreaction)合成的。此酶在與a-D-葡糖-寡糖溫育時，催化水解反應和轉移反應。對6_0H(葡萄糖分子的羥基基團6)的轉移發生得最頻繁，由D-葡萄糖產生異麥芽糖，或者從麥芽糖產生4-a-葡糖基麥芽糖。該酶也可以催化向D-葡萄糖的2-0H或者3-0H的轉移，形成曲二糖(2-葡糖-a-葡糖苷)或者黑黴糖，或者回到4-0H再形成麥芽糖。轉葡糖苷酶反應的結果是，麥芽寡糖轉變為異麥芽寡糖，形成了含有更高比例的葡萄糖部分的一類寡糖，所述葡萄糖部分連接於葡萄糖分子非還原末端的一級羥基基團，例如，通過a-D_l，6糖苷鍵連接。來自黑麴黴的轉葡糖苷酶僅作用於低聚合度(DP)的寡糖(McClearyB.V.，GibsonT.S.，CarbohydrateResearch185(1989)147-162；BensonC.P.,KellyC.T.,Fogartyff.M.,J.Chem.Tech.Biotechnol.,32(1982)790-798；PazurJ.H.,TominagaY.,DeBrosseC.ff.,JackmanL.M.,CarbohydrateResearch,61(1978)279-290)。聚合度是指葡萄糖單位的數目。例如,二葡糖基分子，例如麥芽糖的DP是2。這些糖作為食品添加劑受到了越來越多的關注，原因是它們有助於預防頻齒(Oshima,et.al1988.Thecariesinhibitoryeffectsofgos-sugarinvitroandratexperiments.MicrobialImmunol.32,1093-1105),並且可作為雙歧桿菌的生長因子(益生質)，改善人類的腸道微生物作用(Komoto,et.al1988；EffectofIsomalto-oligosaccharidesonhumanfecalflora,BifidobacteriaMicroflora7,61-69)。可以以不同方法得到異麥芽寡糖。例如，用葡糖澱粉酶處理高幹固體濃度，即60-80%的葡萄糖糖漿，導致DP主要為2的異麥芽寡糖的形成。高固體水平的存在，迫使反應從有利於水解的正常方向逆轉。穀物,包括小麥、大麥等,在許多增值的功能食物成分,如小麥粉、澱粉、澱粉水解產物(葡萄糖、果糖、高麥芽糖糖眾等)和小麥麩(wheatgluten)的經濟生產中，是極好的原材料。在抗生素、藥物、疫苗、生物化學製品，如乙醇(既包含飲料也包括燃料)、胺基酸、有機酸等的生產中，以及最近在被稱為異麥芽寡糖的功能健康食品寡糖的生產中，含有高水平麥芽糖的糖漿也被用作許多微生物發酵中的碳源。在生產澱粉水解產物，如麥芽糖糖漿的傳統方法中，在水解前，通常通過澱粉液化和產麥芽a澱粉酶，將不溶的顆粒狀澱粉與小麥的其它細胞成分分離。麥芽糖是由通過a1-4D-糖苷鍵連接的兩個葡糖基殘基組成的二糖，它是麥芽寡糖家族中最小的物質。它是作為不同純度級別的糖漿、粉末和晶體而大規模生產的。各種麥芽糖糖漿受到了明顯的關注，它們可用於釀造、烘烤、罐裝軟飲料、糖果和其它食品和飲料工業的商業用途中。在日本，超純麥芽糖被用作靜脈內營養物。麥芽糖的催化還原形成麥芽糖醇，其被認為是低卡路裡的甜味劑。近來，高麥芽糖糖漿已經成為工業生產異麥芽寡糖的重要原料(J.K.ShittyandO.J.Lantero,1999"TransglucosylationofMalto-oligosaccharides."Paperpresentedat50thStarchConvention,Detmold,Germany)。在生產澱粉水解產物如高麥芽糖糖漿的傳統方法中，在水解之前，用來自地衣形芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的耐熱液化α澱粉酶[EC3.2.I.2,α(1,4)-葡聚糖葡聚糖水解酶]將不溶性澱粉分離出來。純化澱粉(精製的)的水解是通過，在水中懸浮不溶性顆粒澱粉(30%-50%溶解固體成分[dsb])並加熱至85°C至120°C之間的溫度以溶解澱粉，和使其易受到酶促水解而進行的。使用麥芽糖生成酶，進一步處理液化的澱粉，以產生具有不同的糖類組成的澱粉水解產物，如真菌α澱粉酶(GenencorInternational,PaloAlto,CA出售，商標名為CLARASEL)用於含有少於55%麥芽糖的糖漿，β澱粉酶(GenencorInternational,PaloAlto，CA出售，商標名為OPTIMALBBA)用於產生含有55%至62%的麥芽糖成分和少於1%葡萄糖的糖漿。對於>62%的更高水平麥芽糖糖漿，聯合加入脫支酶(GenencorInternational,PaloAlto,CA出售，商標名為OPTIMAXL-1000)和β澱粉酶是有用的。(Faigh,J.；Duan,G.；Strohm,B.andShetty,J.(2002)"ProductionofMaltose,HighMaltose&VeryHighMaltoseSyrups,"TechnicalBulletin,GenencorInternationalInc.)。已經報導了一種將顆粒澱粉(精製的)轉變為可溶性水解產物的方法，這是通過在低於澱粉糊化溫度的溫度，與細菌α澱粉酶溫育(Leachet.al1978;美國專利號4，113，509)，隨後由β澱粉酶水解，產生高麥芽糖糖漿(Leachet.al1975;美國專利號3，922，196)實施的。然而，通過這種方法產生的糖漿形成的麥芽糖僅佔總含糖量的55%，而含有的麥芽三糖水平非常高。歐洲專利申請0905256(Christophersen，et.al2000)和美國專利5，141，859(Nimmi，et.al1992)，描述了應用液化的澱粉(糊化後，應用耐熱α澱粉酶水解)生產高麥芽糖糖漿的方法。此過程麻煩、昂貴，並且需要將澱粉從其它細胞組分中分離出來，添加的麥芽糖生成酶的成本高，需要高溫處理和較長的反應時間。歐洲專利申請0350737A2(Shinke，et.al1989)公開了一種生成麥芽糖糖漿的方法，方法是應用來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α澱粉酶，在60°C，水解來自玉米、小麥、馬鈴薯和甘薯的顆粒狀(純化的)澱粉，沒有傳統的液化步驟(凝膠化，隨後在高溫下液化)。然而，該水解的澱粉導致麥芽糖濃度範圍為50%至55%。該糖漿含有的麥芽三糖水平也非常高(30-36%)。不論澱粉的來源如何，此方法均造成麥芽糖與麥芽三糖的比率少於2.O。由於代謝麥芽三糖的難度大，含有高水平麥芽三糖的麥芽糖糖漿在許多微生物發酵包括酵母的乙醇發酵中，不是碳供給的優選底物(J.K.Shettyand0.J.Lantero,1999"TransglucosylationofMalto-oligosaccharides.",論文在德國Detmold第50屆澱粉大會上發布)。美國專利6，361，809描述了生產麥芽糖和極限糊精的方法，方法為用水解酶，分類為EC3.2.I.133的來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的maltogenaseα澱粉酶處理純化的顆粒狀臘質玉米澱粉,隨後應用超濾方法分離麥芽糖。對含有麥芽糖的稀釋透過物(dilutepermeate)的蒸發是昂貴的，因為能源花費聞，並且存在著微生物汙染的聞風險。傳統地，穀物如小麥、麥芽、高粱屬(買羅高梁)、黍(鴨腳稗)，特別地是整個的穀物，可作為宏量(micix)-)元素和微量元素、蛋白質、纖維和維生素的載體，被用在營養品中。穀物穀物中的大多數似乎太容易被消化，以至於不能作為益生質或者甚至作為營養物質(nutraceuticals)而起到有效的作用。已經建議，設計遺傳修飾的、較不易消化的、適於作為益生質的穀物，以調節腸道微生物群(Gibson,G.R,andRoberfroid,Μ.B.1995,Dietarymodulationofthehumancolonicmicrflora!Introducingtheconceptofprebiotics.J.Nutr.125，1401-1412)。生產含有異麥芽寡糖的穀物組合物的方法一直受到關注，希望在這樣的方法中在轉葡糖苷反應(transglucosidationaction)之前,不需要將澱粉與其它穀物成分分離開來和/或使底物的澱粉遭受蒸氣加壓的高溫，便能從源底物例如穀物或者塊莖酶促地衍生出異麥芽寡糖。用於最小化微生物汙染的低PH方法，也一直受到關注。本發明即是針對這些關注。發明概述本發明描述了用於生產異麥芽寡糖穀物組合物的方法，所述方法包括(a)用產麥芽酶(maltogenicenzyme)和澱粉液化酶(starchliquefyingenzyme)接觸含有未糊化澱粉的穀物，以生成麥芽糖；(b)用轉糖苷的酶(transglucosidicenzyme)接觸所述麥芽糖，其中所述步驟(a)和所述步驟(b)發生的溫度是低於或者等於澱粉糊化溫度；和(C)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的穀物組合物，其中所述寡糖來源於所述穀物。可任選地,在一種實施方案中，步驟(a)和(b)同時發生。在另一種實施方案中，該方法進一步包括乾燥所述穀物組合物的步驟。在另一種實施方案中，所述穀物選自小麥、黑麥、大麥、麥芽和水稻。在另一種實施方案中，所述穀物選自高粱、黍和水稻。在另一種實施方案中，所述產麥芽酶是β澱粉酶。在另一種實施方案中，所述產麥芽酶對所述穀物來說，是內源性的。在另一種實施方案中，所述產麥芽酶對所述穀物來說，是外源性的。在另一種實施方案中，所述澱粉液化酶是源自桿菌(Bacillus)的α澱粉酶。在另一種實施方案中，所述澱粉液化酶源自地衣形芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一種實施方案中，所述轉葡糖苷的酶是轉葡糖苷酶(transglucosidase)。在另一種實施方案中，轉葡糖苷酶源自麴黴菌(Aspergillus)。在另一種實施方案中，轉葡糖苷酶源自黑麴黴(Aspergillusniger)。本發明的其它實施方案包括根據上面所描述方法而產生的穀物組合物。本發明的另一種實施方案包括含有上面所描述穀物組合物的食品添加劑。本發明也描述了在等於或者低於糊化溫度時生產異麥芽寡糖強化谷粉的方法，其中使帶有內源性的產麥芽酶的未糊化穀物接觸選自桿菌的溶解酶(solubilizingenzyme)，以產生麥芽糖糖漿。使麥芽糖糖漿接觸轉葡糖苷酶，產生基質(塊莖或者穀物)組合物，所述組合物包括來源於它們的異麥芽-糖類。本發明也描述了在等於或者低於糊化溫度時生產異麥芽寡糖強化谷粉的方法，其中將帶有內源性的產麥芽酶的未糊化穀物(小麥、大麥等)與不帶有內源性的產麥芽酶的未糊化穀物(例如，高粱、黍或者水稻)混合，將該穀物混合物接觸選自桿菌的溶解酶，以生成麥芽糖糖漿。將該麥芽糖糖漿接觸於轉葡糖苷酶，產生基質(塊莖或者穀物)組合物，所述組合物包括來源於它們的異麥芽-糖類。本發明也描述了用於製造小麥穀物組合物的方法，所述方法包括(a)將含有內源性的產麥芽β澱粉酶的未糊化小麥穀物與來自桿菌的澱粉液化α澱粉酶接觸，以產生麥芽糖；(b)用轉葡糖苷酶接觸所述麥芽糖，其中所述步驟(a)和步驟(b)發生在低於小麥糊化溫度的溫度；和(C)獲得含有酶促生成的異麥芽寡糖的小麥穀物組合物，其中所述寡糖來源於所述的未糊化穀物。可任選地，在另一種實施方案中，本方法應用上述方法來製造用於製造食品添加劑的穀物組合物。另一種實施方案包括由此製成的穀物組合物。另一種實施方案包括含有如上所述的穀物組合物的谷粉。另一種實施方案包括根據上面所述方法製成的異麥芽寡糖。另一種實施方案包括含有上述的異麥芽寡糖的口服再水合溶液。另一種實施方案包括含有未糊化穀物和至少一種異麥芽寡糖的穀物組合物，其中所述異麥芽寡糖酶促地來源於所述的未糊化穀物。在另一種實施方案中，穀物組合物含有重量大於I%的至少一種異麥芽寡糖。附圖簡述圖I是描述異麥芽寡糖強化谷粉生產的流程圖。圖2是描述異麥芽寡糖強化小麥粉生產的另一個流程圖。發明詳述定義術語「穀物(grain)」是指植物，其被歸類為穀類(cereal)或者屬於禾本目的單子葉植物，尤其是屬於禾本科的單子葉植物。屬於此類的植物的例子是選自小麥屬(小麥)，大麥屬(大麥)；黑麥屬(黑麥)；玉蜀黍屬(玉米(corn))或者玉蜀黍(maize));燕麥屬(燕麥)，蕎麥屬(蕎麥)；高粱屬(高粱或者買羅高梁)，黍屬或者狗尾草屬(黍或者鴨腳稗)；或者稻屬(稻)。例如，在一種實施方案中，術語「小麥(wheat)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為小麥(Triticumaestivum)品系。例如，在一種實施方案中，術語「大麥(barely)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為大麥(HordeumvuIgare)品系。例如，在一種實施方案中，術語「黑麥(rye)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為黑麥(Secalecereal)品系。例如，在一種實施方案中，術語「玉米(corn)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為玉米(Zeamays)品系。例如，在一種實施方案中，術語「燕麥(oats)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為燕麥(Avenasativa)品系。例如，在一種實施方案中，術語「蕎麥(buckwheat)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為蕎麥(Fagopyrumesculentum)品系。例如，在一種實施方案中，術語「高粱(sorghum)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為高梁(Sorghumbicolor)品系。例如，在一種實施方案中，術語「黍(millet)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為黍(PanicummiIiaceum)或者粟(Setariaitalic)品系。例如，在一種實施方案中，術語「稻(rice)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為水稻(Orvzasativa)品系。術語「塊莖(tuber)」是指澱粉貯存器官(例如馬鈴薯、甘薯、山藥、樹薯等)，其由地下莖或者根的遠端膨脹而形成。例如，在一種實施方案中，術語「馬鈴薯(potao)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為馬鈴薯(Solanumtuberosum)品系。例如，在一種實施方案中，術語「甘薯(sweetpotato)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為甘薯(ipom[oe]abatatas)品系。例如，在一種實施方案中，術語「山藥(yam)」是指植物，其被分類為或者曾經被分類為山藥(Dioscoreasativa、D.villosa、C.batatas)品系。術語底物(substrate，本文中有時也稱為「基質」)是指可以酶促地轉變為麥芽糖並從而轉變為MOs的物質。術語「底物」包括，例如，穀物和塊莖。進一步地，術語底物包括穀物(去外殼的或者未去外殼的)或者塊莖的所有形式，如完整穀物、破碎的穀物、粗粉和麵粉以及任何植物部分。術語「澱粉(strach)」是指由植物的複雜多糖碳水化合物組成的任何物質，由式子為(C6HltlO5)x的直鏈澱粉和支鏈澱粉組成，其中X可以是任何數字。術語「顆粒澱粉(granularstrach)」是指未煮過的(生的)澱粉，其還未被糊化。術語「糊化(gelatinization)」是指澱粉分子的溶解,形成粘性的懸浮物。術語「含有未糊化澱粉的「底物」、「穀物」或者「塊莖」」是指未糊化的底物、穀物或者塊莖，其未遭受高於澱粉糊化溫度的溫度，所述的澱粉糊化溫度導致底物中包含的澱粉糊化或者液化。術語「麥芽糖(maltose)」是指具有兩個葡糖基殘基的二糖，這兩個葡糖基殘基通過a1，4D_糖苷鍵連接。術語「異麥芽糖(isomaltose)」是指具有兩個葡糖基殘基的二糖，這兩個葡萄糖殘基通過a1，6D_糖苷鍵連接。術語「異麥芽寡糖(isomalto-oligosaccharide,ΙΜ0)」是指具有至少兩個葡糖基殘基的糖，所述殘基通過在非還原端的al，6糖苷鍵連接。此外，該術語可指不規則連接的寡糖，既有al，6糖苷鍵又有al，4糖苷鍵的糖。代表性的異麥芽寡糖包括異麥芽糖、4_α-葡糖基麥芽糖(panose)和異麥芽三糖(isomalto-triose)。術語「異麥芽寡糖」穀物組合物是指穀物組合物，其特徵為異麥芽-糖(isomalto-sugars)水平佔總含糖量的至少1%(w/w%),如由高效液相色譜方法所測定。術語「產麥芽酶(maltogenicenzyme)」是指將澱粉轉變為麥芽糖的酶。代表性的產麥芽酶包括源自真菌、細菌和植物的α澱粉酶和β澱粉酶。術語「澱粉酶(amylases)」是指催化澱粉水解的酶。術語「α-澱粉酶(a-amylases)」是指(E.C.)3.2.I.I類別和/或3.2.I.133類別的酶，其催化α-1，4_糖苷鍵的水解。這些酶也被描述為，在含有I，4-α連接的D-葡萄糖單位的多糖中，外切水解或者內切水解I，4-a-D-糖苷鍵的那些酶。用以描述這些酶的另一個術語是糖原酶。代表性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶葡聚糖水解酶。術語「β-澱粉酶(β-amylases)」是指(E.C.)3.2.I.2類別的酶，其催化ct-I,4-糖苷鍵水解，釋放麥芽糖單位。這些酶也被描述為，使多糖中I，4-a-D-糖苷鍵水解，以致從鏈的非還原末端移除連續的麥芽糖單位的那些酶。術語「轉糖苷的(transglucosidic)」酶是指在和aD-葡糖-寡糖(aD-gluco-oligosaccharides)溫育時,催化水解和轉移兩種反應的酶。代表性的酶包括轉葡糖苷酶(transglucosidases)和/或(E.G.)2.4.I.24類別的那些酶,例如,D-葡糖基轉移酶。這些酶也被稱為l，4-a-葡聚糖-a-葡糖基轉移酶和寡葡聚糖分支糖基轉移酶術語脫支酶(debranchingenzyme)是指催化a_1，6_糖苷鍵水解的酶。就此而論，E.C.3.2.I.41類的酶是有用的。此類的代表性酶是普魯蘭酶(pullanase)，也被稱為a-糊精內切-l，6-a葡糖苷酶、極限糊精酶、脫支酶、支鏈澱粉1，6_葡聚糖水解酶。(E.C.)3.2.I.41類的其它代表性酶，例如，支鏈澱粉酶(pullulanases)，[a-(1-6)-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，也被稱為a-(I，6)-葡糖苷酶])。術語「澱粉糊化溫度(starchgelatinizingtemperatures)」是指足夠地高以致可以有效液化或者糊化顆粒澱粉的溫度。在水中加熱澱粉引起澱粉顆粒膨脹。在足夠的固體濃度時，膨脹的顆粒佔據了大部分空間，稱為糊(paste)的粘性物質產生。澱粉分子的溶解被稱為糊化。糊化伴隨著雙折射的喪失。術語澱粉糊化溫度是指糊化發生時的溫度。術語「澱粉液化酶(starchliquefyingenzyme)」是指實現顆粒澱粉的流體化的酶。代表性的澱粉液化酶包括(E.C.)3.2.I.I.類的a澱粉酶。術語「內源性」是指在穀物或者塊莖中存在的酶，而無需求助於向穀物加入該產麥芽酶。術語「外源性」是指在穀物中不存在的酶。代表性的外源性酶包括，例如，在野生型底物例如，稻、黍等中不存在的酶。術語「總含糖量(totalsugarcontent)」是指在澱粉、穀物或者塊莖組合物中存在的糖的總量。術語「MO數(MONo.)」計算為，異麥芽糖、4-a-葡糖基麥芽糖、異麥芽三糖和DP大於3的分支糖的總和。IMO數提供了在化合物或者溶液中存在的IMO化合物的量的指/Jno術語「分支糖的比(ratioofbranchedsugars,RBS)」是指,在穀物中存在的麥芽糖(DP2)與得到的穀物組合物中存在的麥芽三糖(DP3)水平的比。術語「糖化力程度(DegreesofDiastaticPower)」(DP。)單位是指,在0.10ml的酶製備物樣品5%溶液中含有的酶量，其在20°C(68°F)和IOOml底物溫育I小時，會生成足夠的還原糖，以還原5mlFehling's溶液。術語「DE」或者「右旋糖當量(dextroseequivalent)」是用於測定總還原糖的濃度的工業標準，所述總還原糖的濃度在被計算時是換作為D-葡萄糖來計算的，按乾重計算(onadryweightbasis)。未水解的顆粒澱粉的DE基本上是0,D-葡萄糖的DE是100。術語「總含糖量(totalsugarcontent)」是指在澱粉組合物中存在的糖的總含量。術語「幹固體成分(drysolidbasis)」和「dsb」是指漿體中的化合物例如麵粉的總量(以％表示)，按乾重計算。術語「Brix」是指用於測定特定溫度下溶液的糖含量的公知的比重計標度值(hydrometerscale)。因此,術語「Brix」是指溶液中溶解的糖的量度。Brix標度值測定的是每100克的含水糖溶液中存在的蔗糖的克數(總的溶解固體含量)。例如，I.OOBrix的測定值是指溶液中的糖大約是10mg/ml。Brix的測定值通常是通過應用液體比重計或者折射計而完成的。術語「聚合程度(degreeofpolymerization,DP)」是指在特定糖類中卩比喃型葡糖酐單元的數目(η)。DPl的例子是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麥芽糖和蔗糖。DP4+意味著聚合度大於3的聚合物。術語「酶促生成(enzymaticallyproduced)」是指底物被酶促催化為ΙΜ0,這不同於IMO的化學合成或者有機化學合成。術語「絲狀真菌(filamentousfungi)」是指真菌亞門(subdivisionEumycotina)的所有絲狀形式(參見，Alexopoulos,C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY,NewYorkWiley)。這些真菌的特徵在於營養菌絲體，其帶有由殼素、纖維素和其它複合多糖組成的細胞壁。本發明的絲狀真菌在形態學、生理學和遺傳學上不同於酵母。絲狀真菌的營養生長是藉助於絲菌延長，並且碳分解代謝是專性需氧的。在本發明中，絲狀真菌親代細胞可以是下列屬的細胞，但不限於這些細胞木黴菌屬(Trichoderma),例如，裡氏木黴(Trichodermareesei)(以前被歸類為長枝木黴(T.Iongibrachiatum),目前被稱為Hypocreajecorina)、綠色木黴(Trichodermaviride)、康寧木黴(Trichodermakoningii)、哈茲木黴(Trichodermaharzianum);青黴菌屬(Penicilliumsp.);腐質黴屬(Humicolasp.),包括Humicolainsolens和Humicolagrisea;金抱黴菌屬(Chrysosporiumsp·),包括C.Iucknowense;粘帚黴屬(Gliocladiumsp.);麴黴屬(Aspergillussp·),包括米麴黴(A.oryzae)、構巢麴黴(A.nidulans)、黑麴黴(A.niger)和泡盛麴黴(A.awamori);鐮刀菌屬(Fusariumsp·)、脈抱菌屬(Neurosporasp·)、肉座菌屬(Hypocreasp.)和裸孢殼屬(Emericellasp.)。也參考Innisetal.,(1985)Sci.228:21_26。術語「麴黴菌」或者「麴黴屬」是指以前被歸類為麴黴菌或者目前被歸類為麴黴菌的任何黴菌。術語「細菌」是指芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括但不限於枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解澱粉芽孢桿菌(B.amyIoliquefaciesn)、緩慢芽孢桿菌(B.Ientus)、B.Carlsberg、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)。術語「植物起源(plantorigin)」是指由植物來源中衍生、提取、分離、表達的酶，所述植物來源例如大麥麥芽、大豆、小麥或者大麥。術語「接觸」是指將各個酶(一種或者多種)放置在足夠近地接近於各自的底物的位置，以便酶(一種或多種酶)能夠將底物轉變為所需的終產物。本領域的技術人員將認識到，將所述酶或者所述多種酶的溶液與各自的底物混合，可以實現接觸。術語「溫育(incubating)」是指在特定的條件下，在限定的時間期間將含有底物的基質與分別的酶混合，所述的酶例如，液化酶或者產麥芽麥或者轉葡糖苷酶。術語「酶促轉化(enzymaticconversion)」是指對對稻底物進行修飾,產生可溶的水解顆粒狀稻澱粉，優選地產生葡萄糖。術語「漿(slurry)」是指含有不溶顆粒澱粉的含水混合物。有時術語「漿」和「懸浮液」在此處可交換使用。術語「培養」是指在合適條件下，在液體或者固體介質中生長一群微生物細胞。在一種實施方案中，培養是指顆粒澱粉底物發酵性的生物轉化為葡萄糖糖漿或者其它所需的終產物(典型地在容器或者反應器中)。例如，在一種實施方案中，術語a澱粉酶單位被定義為，在pH5.2和40°C的標準分析條件下，I分鐘內水解I微摩爾澱粉底物的a澱粉酶量。例如，在一種實施方案中，術語P澱粉酶單位被定義為，在pH4.6和20°C的標準分析條件下，I分鐘內水解I微摩爾澱粉底物的0澱粉酶量。例如，在一種實施方案中，術語轉葡糖苷酶單位被定義為，在pH4.8和37°C的標準分析條件下，I分鐘內轉化I微摩爾麥芽糖底物的轉葡糖苷酶量。在另一種實施方案中，術語轉葡糖苷酶單位被定義為，在pH4.8和37°C的標準分析條件下，每分鐘生成I微摩爾4-a-葡糖基麥芽糖的轉葡糖苷酶量。例如，在一種實施方案中，術語一個Liquefon單位(LU)是碘溶液產生顏色變化所需的消化時間的量度，它表示了在PH5.6和25°C的標準分析條件下，澱粉底物糊精化的確定時期。「ATCC」是指美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),位於Manassas,VA20108(ATCC,www/atcc.org)。「NRRL」是指農業研究菌種保藏中心,美國國家農業效用研究中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch)(以前被稱為美國農業部北區研究實驗室(USDANorthernRegionalResearchLaboratory),Peoria,ILL。「NCBI」是指美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation),NatlLibraryMed.(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。「一(a)」、「一個(an)」和「該(the)」包括複數含義，除非上下文另外清楚地指明。本發明描述了用於製造異麥芽寡糖基質(substrate)，穀物或者塊莖組合物的方法，所述方法包括(a)用產麥芽酶和澱粉液化酶接觸含有未糊化澱粉的基質，例如穀物或者塊莖，以生成麥芽糖；(b)用轉葡糖苷的酶接觸所述麥芽糖，其中所述步驟(a)和所述步驟(b)發生的溫度低於或者等於澱粉糊化溫度；和(C)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的基質，穀物或者塊莖組合物，其中所述寡糖來源於所述基質，穀物或者塊莖。圖I描述了本發明的一種實施方案。本發明也描述了在等於或者低於糊化溫度的溫度，製造富含異麥芽寡糖的基質，穀物或者塊莖組合物，粉末，口服再水合溶液，和/或食品添加劑的方法，其中將具有或含有未糊化澱粉和含有內源性產麥芽酶的基質與選自芽孢桿菌的溶解酶接觸，產生麥芽糖糖漿。然後，在等於或者低於糊化溫度或者液化溫度的溫度，將麥芽糖糖漿與轉葡糖苷酶接觸，產生具有異麥芽寡糖的穀物組合物。在一種實施方案中，該穀物組合物的特徵在於，在糖組成中麥芽糖多於60%和分支糖的比大於2.0至I.O。從底物到MO的轉化可以酶促地產生。本發明也描述了用於製造異麥芽寡糖基質，穀物或者塊莖組合物的方法，該方法包括(a)用產麥芽酶和澱粉液化酶接觸含有澱粉的基質，穀物或者塊莖，生成麥芽糖；(b)用轉葡糖苷的酶接觸麥芽糖，其中所述步驟(a)和所述步驟(b)發生的溫度低於或者等於澱粉糊化溫度；和(C)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的基質，穀物或者塊莖組合物，其中所述寡糖來源於基質，穀物或者塊莖。本發明可任選地進一步描述了將不溶性組成成分與可溶性組成成分分離的附加步驟。本發明進一步描述了乾燥基質，穀物或者塊莖組合物的附加步驟。在一種實施方案中，穀物選自小麥、黑麥、大麥、麥芽、蕎麥、高梁(買羅高梁)、黍(鴨腳稗)和稻。在另一種實施方案中，產麥芽酶是β澱粉酶。在另一種實施方案中，產麥芽酶對於穀物來說是內源性的。在另一種實施方案中，澱粉液化酶是來源於桿菌的α澱粉酶。在另一種實施方案中，澱粉液化酶來源於地衣芽孢桿菌或者嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一種實施方案中，轉葡糖苷的酶是轉葡糖苷酶。在另一種實施方案中，轉葡糖苷酶來源於麴黴菌。在另一種實施方案中，麴黴菌是黑麴黴。本發明也描述了根據上面描述方法生成的穀物組合物、食品添加劑、口服再水合溶液和/或者粉末。在另一種實施方案中，本發明描述了用於製造小麥穀物組合物的方法，所述方法包括(a)將具有內源性產麥芽β澱粉酶的未糊化小麥穀物與來自桿菌的澱粉液化α澱粉酶接觸，生成麥芽糖；(b)用轉葡糖苷酶接觸麥芽糖，其中所述步驟(a)和所述步驟(b)發生的溫度低於或者等於澱粉糊化溫度；和(C)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的小麥穀物組合物，其中所述寡糖來源於所述的未糊化穀物。圖2描述了本發明的一種實施方案。在另一種實施方案中，上面描述的方法可以被用於製造食品添加劑、焙烘產品、口服再水合溶液和/或者粉末。在另一種實施方案中，產麥芽酶是β澱粉酶。在另一種實施方案中，產麥芽酶對於穀物來說是內源性的。在另一種實施方案中，澱粉液化酶是來源於細菌來源的α澱粉酶。在另一種實施方案中，細菌來源是芽孢桿菌屬。在另一種實施方案中，澱粉液化酶來源於地衣芽孢桿菌或者嗜熱脂肪芽孢桿菌。在另一種實施方案中，轉葡糖苷的酶是轉葡糖苷酶。在另一種實施方案中，轉葡糖苷酶來源於真菌來源。在另一種實施方案中，真菌來源是麴黴菌屬。在另一種實施方案中，麴黴菌是黑麴黴。本發明也描述了根據上面描述方法生成的穀物組合物、食品添加劑、口服再水合溶液和/或者粉末。穀物組合物可以含有重量大於I%的至少一種異麥芽寡糖。所述的至少一種異麥芽寡糖可以選自異麥芽糖、4-α-葡糖基麥芽糖、異麥芽三糖。在本發明的進一步實施方案中，內源性產麥芽酶選自β澱粉酶或者α澱粉酶。在本發明的再進一步的實施方案中，溶解酶是來源於芽孢桿菌的液化α澱粉酶。在本發明的再進一步的實施方案中，液化澱粉酶來源於地衣芽孢桿菌或者嗜熱脂肪芽孢桿菌。基質(或者底物)(substrates)本發明包括含有澱粉的基質，例如含有澱粉的穀物或者塊莖，其與產麥芽酶和澱粉液化酶接觸，產生麥芽糖。術語基質是指可以酶促地轉變為麥芽糖並從而轉變為MIO的物質。代表性的基質可以是選自穀物和塊莖的至少一種基質。麥芽糖可以是富含麥芽糖的糖漿或者漿液的形式。澱粉以兩種形式存在，直鏈澱粉,一種線性鏈多糖，和支鏈澱粉，一種分支鏈多糖。直鏈澱粉含有長的不分支的鏈，其中所有D-葡萄糖單位由α-1，4-鍵(「α-1，4-鍵」或者「1，4-a-D-葡糖基鍵」)連接。支鏈澱粉是高度分支的，骨架的糖苷鍵是α-1，4鍵，但是分支點的糖苷鍵是α-1，6鍵。澱粉的主要成分可以以兩種不同方式被酶促地水解。直鏈澱粉可以由α澱粉酶(E.C.3.2.I.1)，例如，a-(1-4)-葡聚糖4_葡聚糖水解酶(a-(1-4)-glucan4-glucanohydrolase)水解。α澱粉酶水解a-(1,4)鍵,產生葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和更高級的糖的混合物。直鏈澱粉也可以由澱粉酶(E.C.3.2.I.2)[α(I，4)_葡聚糖麥芽水解酶，I，4-a-D-葡聚糖麥芽水解酶]水解。此酶從非還原末端開始切掉連續的麥芽糖單位，定量地產生麥芽糖。a澱粉酶和3澱粉酶也水解支鏈澱粉。a澱粉酶和3澱粉酶均不能水解支鏈澱粉分支位置的a(1-6)鍵。3-澱粉酶對支鏈澱粉徹底作用的終產物是大的、高度分支的核心結構或者P極限糊精。脫支酶(E.C.3.2.I.41，例如，？1111111&1^8^，[[1-(1-6)-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，也稱為a-(l，6)_葡糖苷酶])可以水解分支位置的a-(1-6)鍵。因此，￠-澱粉酶和a1，6葡萄糖苷酶聯合作用可以徹底降解支鏈澱粉為麥芽糖和葡萄糖，導致麥芽糖含量高達總含糖量的60%、65%、79%、75%、80%或者更高。對於本發明的目的，含有澱粉的基質可以是穀物或者塊莖或者其混合物。穀物可以是含有澱粉的任意穀類作物或者種子。基質可以被碾碎、磨碎或者否則減小其尺寸，以增加基質與各自的酶接觸的表面面積。例如，依照需要，基質可以是被溼磨或者幹磨的。在本發明的一種實施方案中，澱粉是顆粒狀的澱粉。預期可以應用在本發明中的穀物包括，目前被用於烘焙、麵團或者其它用途的任何穀物。預期的代表性穀物包括但不限於，選自下列中至少一種小麥(小麥屬，包括但不限於一粒小麥(T.monococcum)、圓錐小麥(T.turgidum)、斯卑爾脫小麥(T.spelta)和/或者普通小麥(T.aestivum))、大麥(例如，大麥(Hordeumvulgare)和美國專利6，492，576表I中描述的變種)、黑麥(黑麥屬(Secalesp.),包括但不限於黑麥(S.cereal))、玉米(玉米屬,包括但不限於玉米(Zeamays))、蕎麥(蕎麥屬，包括但不限於甜蕎(F.esculentum))、麥芽(例如，發芽的大麥)、高梁(高梁屬，包括但不限於高梁(Sorghumbicolor)或者另被稱為買羅高梁、黍(鴨腳稗)(黍屬和狗尾草屬，包括但不限於黍(P.milaceum);狗尾草屬包括但不限於慄(S.italica))和稻(稻屬，包括但不限於稻(Oryzasativa))。可以預期，野生型植物和具有有益特性的轉基因植物，都可用作含澱粉的基質，所述的有益特性例如內源性酶水平增加或者外源性酶的存在。發芽穀類，例如，麥芽，被用作許多食品和健康飲料配方的關鍵成分之一，原因是它們具有高營養價值，例如，含麥芽食品(表A)。發芽導致了內源性的產麥芽酶和蛋白水解酶的合成和活化。因此，發芽穀類是含內源性產麥芽酶的穀物的好的來源。麥芽粉和麥芽提取物也被用作釀造和烘培應用中的消化酶的來源。然而，大麥的發芽致使穀物成分太容易消化，以致於不能作為益生質(prebiotics)或者甚至作為營養保健物質(nutraceuticals)起有效作用，因為它們趨向於在到達下胃腸道之前全面地被消化。不幸的是，益生質化合物的有益作用在下胃腸道最得到認同。因此，將高度可消化的麥芽-糖類轉化為較不易消化的異麥芽-糖類，使修飾的麥芽能夠起到益生質的作用，使麥芽能夠到達下胃腸道並提供額外的功能和健康益處。例如，表A提供了含有麥芽提取物的合適的商業上可獲得的食品。表A含有麥芽提取物的商業食品商標名製造商地點H0RLICKSGlaxosmithkline旁遮普，印度MALT0VAGlaxosmithkline旁遮普，印度權利要求1.用於製造異麥芽寡糖底物組合物的方法，所述方法包括(a)將含有澱粉的未糊化底物與產麥芽酶和澱粉液化酶接觸，生成麥芽糖，所述含有澱粉的底物選自穀物、塊莖，和其混合物；(b)將所述麥芽糖與轉糖苷的酶接觸，其中所述步驟(a)和步驟(b)在低於或者等於所述澱粉的糊化溫度的溫度發生；和(C)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的麥芽寡糖底物組合物，其中所述寡糖從所述含有澱粉的底物獲得。2.根據權利要求I所述的方法，其中所述步驟(a)和(b)同時發生。3.根據權利要求I所述的方法，進一步包括乾燥所述異麥芽寡糖底物組合物的步驟。4.根據權利要求I所述的方法，其中所述含有澱粉的底物是選自小麥、黑麥、大麥和麥芽的穀物。5.根據權利要求I所述的方法，其中所述含有澱粉的底物是選自黍、高梁和稻的穀物。6.根據權利要求I所述的方法，其中所述產麥芽酶是3澱粉酶。7.根據權利要求I所述的方法，其中所述產麥芽酶對於所述含有澱粉的底物是內源性的。8.根據權利要求I所述的方法，其中所述澱粉液化酶是獲自芽孢桿菌的a澱粉酶。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述澱粉液化酶獲自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)或者嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)。10.根據權利要求I所述的方法，其中所述轉糖苷的酶是轉葡糖苷酶。11.根據權利要求10所述的方法，其中所述轉葡糖苷酶來源於麴黴菌。12.根據權利要求11所述的方法,其中所述麴黴菌是黑麴黴(Aspergillusniger)。全文摘要描述了用於生產含異麥芽寡糖的基質，塊莖和穀物組合物的方法。方法包括(a)用產麥芽酶和澱粉液化酶接觸含有未糊化澱粉的基質，塊莖或者穀物，生成麥芽糖；(b)用轉糖苷的酶接觸所述麥芽糖，其中所述步驟(a)和所述步驟(b)發生的溫度低於或者等於澱粉糊化溫度；和(c)獲得具有酶促生成的異麥芽寡糖的基質，穀物或者塊莖組合物，其中所述寡糖來源於所述穀物。產麥芽酶對於穀物可以是外源的或者是內源的。接觸步驟可以是相繼的或者同時的。本發明也描述了谷粉、口服再水合溶液、啤酒添加劑、食品、飼料、飲料添加劑，它們含有如所描述地製成的穀物組合物。文檔編號C07H3/06GK102613450SQ20121007459公開日2012年8月1日申請日期2004年3月10日優先權日2003年3月10日發明者F·李,G·段,J·K·謝蒂,J·瓦達庫特申請人:金克克國際有限公司